Detektering av karcinoembryonalt antigen messenger RNA i blod med användning av kvantitativ realtids-omvänt transkriptas-polymeraskedjereaktion för att förutsäga återfall av gastrisk adenokarcinom

Detektering av karcinoembryonalt antigen messenger RNA i blod med användning av kvantitativ realtids-omvänt transkriptas-polymeraskedjereaktion för att förutsäga återfall av gastriskt adenokarcinom Bild Sammanfattning
Bakgrund
Förekomsten av cirkulerande tumörceller (CTCs) i perifert blod som en indikator för tumörrecidiv har inte klarlagts, särskilt för patienter med ventrikelcancer. Vi har genomfört en retrospektiv analys av förhållandet mellan CTCs i perifert blod vid första diagnos och clinicopathologic fynd hos patienter med magcancer.
Metoder
Blodprov erhölls från 123 magcancer patienter vid den första diagnosen. mRNA extraherades och amplifierades för karcinoembryonalt antigen (CEA) mRNA detektion med användning av realtids-RT-PCR. Regelbundna 3-månaders uppföljningsundersökningar ingår serum CEA mätningar och bildbehandling.
Resultat
minimitröskel för korrigerad CEA mRNA mål [(CEA mRNA /GAPDH mRNA) × 10 6] fastställdes till 100. fyrtiofem av 123 patienter (36,6%) var positiva för CEA-mRNA-uttryck. CEA-mRNA-expression signifikant korrelerade med T scenen och postoperativa återfall status (P
= 0,001). Återkommande sjukdom hittades i 44 av 123 fall (35,8%) och 25 av dessa (56,8%) var positiva för CEA-mRNA. Av dessa patienter, CEA-mRNA var känsligare än serum CEA i indikerar återfall. Tre års sjukdomsfri överlevnad av patienterna positiva för CEA-mRNA var betydligt sämre än av patienterna negativa för CEA-mRNA (P Hotel < 0,001). Endast histologiska grad och CEA-mRNA positivitet var oberoende faktorer för sjukdomsfri överlevnad med hjälp av multivariat analys.
Slutsatser
CEA mRNA antalet exemplar i perifert blod vid den första diagnosen var signifikant associerad med sjukdomsåterfall i magsäckscancerpatienter. Realtids-RT-PCR-detektion av CEA mRNA-nivåer vid diagnos tycks vara en lovande prediktor för sjukdomsåterfall i magsäckscancerpatienter.
Bakgrund
Gastric cancer förblev ledande orsaken till cancerdödlighet i världen under 20-talet. Den enda bevisade botande behandling är kirurgisk resektion av alla grova och mikroskopiska skador. Trots att genomgå botande gastrektomi, inklusive förlängd lymfkörtel dissekering och adjuvant kemoterapi, åter cancer i både regionala och avlägsna platser i majoriteten av patienterna [1]. Diagnos av återfall med gemensam uppföljning protokoll vanligen görs i ett sent skede, vilket i viss utsträckning utesluter möjligheten till effektiv behandling [2]. Övervakning av cirkulerande tumörceller (CTCs) verkar erbjuda större möjlighet för tidig diagnos av återkommande sjukdom.
Begreppet undersöker metastaserande process i perifert blod har sitt ursprung i den 19: e talet då T.R. Ashworth beskrivna första fenomenet CTCs och S. Paget hypotes ett icke-slumpmässigt mönster av cancer metastasization (den "utsäde och jord" teori) [3, 4]. Därefter den elakartade karaktär CTCs bekräftas genom att visa att de har tumörspecifika kromosomavvikelser [5, 6] och att de växer ex vivo som cellinjer med en malign fenotyp [7]. Flera metoder för att upptäcka CTC har beskrivits och kan delas in i PCR-baserade metoder och cytometrisk metoder [8].
Med tillkomsten av kvantitativ realtids-PCR-tekniker [9], exakt kvantifiering av en målsekvens har blivit möjligt . Kvantitativ PCR ger utredarna inte bara tekniska fördelar, men också med applikativ fördelar, såsom definitionen av cutoff värden indikerar mRNA expressionsnivåer av klinisk relevans hos cancerpatienter jämfört med friska försökspersoner. Realtids-PCR ger också möjligheterna att korrelera mål-sekvens last med kliniska resultat [10] eller behandlingssvar [11].
CEA, som ursprungligen beskrivits som en tumörassocierad tjocktarmscancer antigen, klonades 1987 och är erkänns nu som en medlem av immunglobulin proteinsuperfamiljen [12]. Många studier har rapporterat upptäckt av gastric celler i blod [13], benmärg [14], och peritoneal tvätt [15] av gastric cancerpatienter med hjälp av realtids-PCR för CEA-mRNA.
Målet med denna studie var att utvärdera effektiviteten av CEA-mRNA realtids-PCR-teknik för tidig upptäckt av tumörrecidiv. För att uppfylla detta mål, förhållandet mellan kliniska återfall och blodnivåer av CEA-mRNA preoperativt undersöktes i magsäckscancerpatienter.
Metoder
Patienter
Skriftligt informerat samtycke erhölls från varje patient för användning av blodprover för forskning i enlighet med de institutionella riktlinjerna för vårt sjukhus. Mellan februari 2002 och december 2006 har totalt 123 konsekutiva patienter med magcancer vid Cancer Center i Sun Yat-sen universitetet inskrivna i denna studie. Alla patienter fick radikal resektion och D2 lymfkörtlar. Vid leasing fanns tillgängliga för detektion 15 lymfkörtlar. Ingen peritoneal spridning hittades. Tydliga uppgifter om serum CEA förändring och bildbehandling utvärdering före operationen och var tredje månad efter operationen krävdes. Patienter som hade positiv lymfkörtel rekommenderades att få adjuvant kemoterapi men till slut bara Åttiotre patienter genomgick adjuvant kemoterapi. De regimer som ingår CAPOX (Capecitabine + oxaliplatin, 16 fall, med en median cykel av fyra), folfox6 (56 fall, med en median cykel av 6), taxol + cisplatin (4 fall med en median cykel av fyra), taxol + 5FU /CF (Fluorouracil /Leucovorin, 7 fall, med en median cykel av sex). Återkommande sjukdom, inklusive lokala återfall och fjärrmetastaser, upptäcktes av datortomografi undersökning. Nya skador upptäcks av avbildningsmetod i uppföljningsbesök betraktades som återkommer. Biopsi gjordes inte rutinmässigt för att bestämma histologiska återfall. All avbildning utvärderades med minst två oberoende observatörer, bland annat radiologer. Medianuppföljningsperiod var 37,0 månader (intervall, 3.0-73.6 månader).
Blodprov
Blodprov samlades vid den första diagnosen en eller två dagar före operationen. De första 3 ml blod kastades bort för att förhindra epidermal förorening, och sedan en 5-ml blodprov erhölls från den perifera venen. Perifera blodprover som erhållits från 30 icke-cancerpatient frivilliga användes som negativa kontroller
Alla patienter som skriftligt informerat samtycke. vi fick separat tillstånd för användning av blodprovet. Studie godkännande erhölls från oberoende etiska kommittéer vid Cancer Center i Sun Yat-Sen universitetet. Studien genomfördes i enlighet med de etiska normerna i World Medical Association Helsingforsdeklarationen.
Förbehandling av blodprover
Blodprov samlades i EDTA-innehållande rör. Beredning av prover utfördes inom 2 timmar efter avlägsnande av blod. Blod överfördes till en 30-ml Falcon-rör och centrifugerades vid 1800 rpm vid rumstemperatur under 20 minuter. Serum togs bort, och cellerna återsuspenderades i 5 ml saltlösning och 0,3 ml RNA senare lösning. Efter noggrann blandning, var blodcellblandningen hölls över natten vid 4 ° C och lagrades vid -80 ° C tills de användes.
RNA-extraktion och cDNA-syntes
Total RNA av perifera blodprover extraherades med användning RNAprep Cell Kit (Tiangen , Beijing, Kina) enligt protokollet som tillhandahålls av tillverkaren. RNA integriteten kontrollerades genom elektrofores och kvantifierades genom absorption vid 260 och 280 nm med användning av en UV-synlig spektrofotometer (Beckman Coulter Du ® 800, Fullerton, CA). För omvänd transkription, en pg av totalt RNA, 1 mikroliter Oligo (dT) 15 och en mikroliter dNTP späddes i 10 mikroliter RNas-fritt vatten, inkuberades 10 minuter vid 37 ° C och 1

• DNA polymeraseη proteinuttryck förutser behandlingssvar och överlevnad av magsäcks patienter adenokarcinom behandlades med oxaliplatinbaserad chemotherapy
• Effektiviteten av ultraljud för att verifiera placeringen av en ventrikelsond hos patienter med låg medvetenhet vid en nödsituation center