La detección de ARN mensajero carcinoembrionario antígeno en sangre utilizando cuantitativa en tiempo real inversa-reacción en cadena de la polimerasa-transcriptasa para predecir la recurrencia de adenocarcinoma gástrico

La detección del ARN mensajero carcinoembrionario antígeno en sangre utilizando cuantitativa en tiempo real reacción en cadena de la polimerasa con transcripción para predecir la recurrencia del adenocarcinoma gástrico
Resumen Antecedentes

La existencia de células tumorales circulantes (CTC) en sangre periférica como una indicador de la recurrencia del tumor no se ha establecido claramente, sobre todo para los pacientes con cáncer gástrico. Se realizó un análisis retrospectivo de la relación entre las CTC en sangre periférica en los hallazgos iniciales de diagnóstico y clínico-patológicas en pacientes con carcinoma gástrico.
Métodos
Las muestras de sangre se obtuvieron de 123 pacientes con carcinoma gástrico en el diagnóstico inicial. ARNm se extrajo y se amplifica para el antígeno carcinoembrionario (CEA) mRNA de detección utilizando en tiempo real de RT-PCR. Periódicos exámenes de seguimiento de 3 meses incluyeron mediciones de CEA y de imagen.
Resultados
El umbral mínimo para el ARNm de CEA puntuación corregida [(ARNm de CEA /GAPDH ARNm) x 10 6] se fijó en 100. cuarenta y cinco de 123 pacientes (36,6%) fueron positivos para la expresión de ARNm de CEA. la expresión de ARNm de CEA correlacionó significativamente con el estadio T y el estado de la recurrencia postoperatoria (p = 0,001
). La enfermedad recurrente se encontró en 44 de 123 casos (35,8%), y 25 de ellos (56,8%) fueron positivos para CEA ARNm. De estos pacientes, ARNm de CEA fue más sensible que el suero CEA en indicar recurrencia. supervivencia libre de enfermedad de tres años de los pacientes positivos para CEA mRNA fue significativamente peor que los pacientes negativos para ARNm de CEA (P Hotel < 0,001). Sólo el grado histológico y el ARNm de CEA positividad fueron factores independientes para la supervivencia libre de enfermedad mediante análisis multivariado.
Conclusiones
CEA mRNA número de copias en la sangre periférica en el diagnóstico inicial se asoció significativamente con la recurrencia de la enfermedad en pacientes con adenocarcinoma gástrico. Detección en tiempo real de RT-PCR de los niveles de ARNm de CEA momento del diagnóstico inicial parece ser un predictor prometedor para la recurrencia de la enfermedad en pacientes con adenocarcinoma gástrico.
Antecedentes
El cáncer gástrico sigue siendo la principal causa de mortalidad por cáncer en todo el mundo a lo largo del siglo 20. El único tratamiento curativo es la resección quirúrgica probada de todas las lesiones macroscópicas y microscópicas. Sin embargo, a pesar de someterse a una gastrectomía curativa, incluyendo linfáticos extendida disección de los ganglios y la quimioterapia adyuvante, el cáncer reaparece en tanto regional como sitios distantes en la mayoría de los pacientes [1]. El diagnóstico de la recurrencia de los protocolos comunes de seguimiento se hace generalmente en una etapa tardía, lo que, en cierta medida, excluye la posibilidad de un tratamiento eficaz [2]. La vigilancia de las células tumorales circulantes (CTC) parece ofrecer mayores posibilidades para el diagnóstico temprano de la enfermedad recurrente. México La idea de investigar el proceso metastásico en la sangre periférica se originó en el siglo 19, cuando T. R. Ashworth describió por primera vez el fenómeno de la CTC, y S. Paget hipótesis de un patrón no aleatorio de cáncer de metástasis (la 'semilla y el suelo "teoría) [3, 4]. Posteriormente, la naturaleza maligna de las CTC se confirmó mediante la demostración de que poseen las aberraciones cromosómicas específicas de tumor [5, 6] y que crezcan ex vivo como líneas de células con un fenotipo maligno [7]. Varios enfoques para detectar las CTC se han descrito y se pueden clasificar en métodos basados ​​en PCR y los métodos de citometría de [8].
Con el advenimiento de tiempo real cuantitativa técnicas de PCR [9], la cuantificación precisa de una secuencia diana se ha convertido en posible . PCR cuantitativa proporciona a los investigadores no sólo con ventajas técnicas, sino también con ventajas aplicativas, tales como la definición de los valores de corte que indican niveles de mRNA expresión de relevancia clínica en pacientes con cáncer en comparación con los sujetos sanos. PCR en tiempo real también ofrece las posibilidades de la correlación de carga objetivo de secuencia con el resultado clínico [10] o la respuesta al tratamiento [11].
CEA, descrito originalmente como un antígeno de cáncer de colon asociado a un tumor, se clonó en 1987 y es ahora reconocido como un miembro de la superfamilia de proteínas de inmunoglobulina [12]. Muchos estudios han informado de la detección de las células gástricas en la sangre [13], la médula ósea [14], y el lavado peritoneal [15] de los pacientes con cáncer gástrico mediante el uso de PCR en tiempo real para el ARNm de CEA. México La meta de este estudio fue evaluar la eficacia de la técnica en tiempo real PCR CEA ARNm para la detección temprana de la recurrencia del tumor. Para cumplir con este objetivo, la relación entre la recurrencia clínica y los niveles sanguíneos de ARNm de CEA preoperatorio fue examinado en pacientes con adenocarcinoma gástrico.
Métodos Los pacientes

escrito el consentimiento informado se obtuvo de cada paciente en el uso de muestras de sangre para investigación de acuerdo con las directrices institucionales de nuestro hospital. Entre febrero de 2002 y diciembre de 2006, un total de 123 pacientes consecutivos con adenocarcinoma gástrico en el Centro de Cáncer de la Universidad Sun Yat-sen se inscribieron en este estudio. Todos los pacientes recibieron resección radical y linfadenectomía D2. Por lo menos 15 ganglios linfáticos estaban disponibles para la detección. No se encontró diseminación peritoneal. Se requiere un registro claro de suero cambio CEA y evaluación de imágenes antes de la operación y cada tres meses después de la operación. Los pacientes que tenían ganglios linfáticos positivos fueron recomendados para recibir quimioterapia adyuvante pero finalmente sólo ochenta y tres pacientes fueron sometidos a quimioterapia adyuvante. Los regímenes incluyen CAPOX (capecitabina + Oxaliplatino, 16 casos, con un ciclo de mediana de 4), FOLFOX6 (56 casos, con un ciclo promedio de 6), taxol + cisplatino (4 casos, con un ciclo de mediana de 4), taxol + 5FU /CF (fluorouracilo /leucovorina, 7 de los casos, con un ciclo promedio de 6). La enfermedad recurrente, incluida la recaída y metástasis a distancia locales, se detectó mediante un examen de tomografía computarizada. Nuevas lesiones detectadas mediante el examen de imágenes en las visitas de seguimiento se consideraron como recurrencia. Biopsia no se realiza de manera rutinaria para determinar la recurrencia histológica. Toda imagen fue evaluada por al menos dos observadores independientes, incluidos los radiólogos. El período de seguimiento medio fue de 37,0 meses (rango, 3.0-73.6 meses) fueron recogidos.
Muestras de sangre Las muestras de sangre
el momento del diagnóstico inicial de uno o dos días antes de la cirugía. Los primeros 3 ml de sangre se descartó para evitar la contaminación de la epidermis, y luego una muestra de sangre de 5 ml se obtuvo de la vena periférica. Muestras de sangre periférica obtenidas de 30 pacientes voluntarios no cancerosas se utilizaron como controles negativos MyBestPlay Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito.; Se obtuvo el consentimiento por separado para uso de muestra de sangre. de aprobación del estudio se obtuvo de los comités de ética independientes del Centro de Cáncer de la Universidad Sun Yat-Sen. El estudio se llevó a cabo de acuerdo con las normas éticas de la Declaración de la Asociación Médica Mundial de Helsinki.
Pre-procesamiento de muestras de sangre
tomaron muestras de sangre en tubos que contenían EDTA. Procesamiento de las muestras se realizó dentro de 2 horas después de la extracción de sangre. La sangre se transfiere a un tubo Falcon de 30 ml y se centrifugó a 1800 rpm a temperatura ambiente durante 20 minutos. El suero se retiró y las células se resuspendieron en 5 ml de solución salina y 0,3 ml de ARN más tarde solución. Después de mezclar bien, la mezcla de células de la sangre se mantuvo durante la noche a 4 ° C y se almacenó a -80 ° C hasta su utilización.
Extracción de ARN y síntesis de ADNc
ARN total de muestras de sangre periférica se extrajo utilizando el kit de la célula RNAprep (Tiangen , Beijing, china) siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante. La integridad del ARN se verificó por electroforesis y se cuantificó por absorción a 260 y 280 nm utilizando un espectrofotómetro de UV-visible (Beckman Coulter Du ® 800, Fullerton, CA). Para la transcripción reversa, 1 g de ARN total, 1 l de oligo (dT) 15 y 1 l de dNTP se diluyeron en 10 l de agua libre de RNasa, se incubó 10 minutos a 37 ° C y se añadió 1 l de 25 mmol /l de EDTA. Una alícuota 11 l de mezcla de reacción se incubó durante 10 minutos a 65 ° C y se enfrió rápidamente en hielo durante 2 minutos. cDNA se almacenó a -80 ° C hasta su uso. la síntesis de ADNc se realizó utilizando el método TIANScript M-MLV (Tiangen Biotech, Pekín, China). Las líneas celulares
Para prepararse para CEA-específica de RT-PCR, dos líneas celulares, SW-480 (línea celular de cáncer de colon ) y se utilizaron SC-7901 (línea celular de cáncer gástrico). Los linfocitos se obtuvieron de voluntarios sanos sin neoplasia epitelial. Después de linfocitos se aislaron de sangre periférica mediante centrifugación en gradiente, se recogió la capa de células mononucleares. Las líneas celulares se diluyeron en serie (10 veces) en 2 × 10 7 a 5 × 10 7 para dar los linfocitos de células de carcinoma: linfocito que van 1:10-1:10 7.
CEA Análisis de ARNm de real-Time PCR cuantitativa
PCR cuantitativa se realizó mediante el sistema detector de secuencias ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems 7500 Fast real-Time PCR System). PCR primers y las sondas TaqMan fueron diseñados utilizando el programa de software Primer Express 1.0. En este ensayo, se utilizó el servicio de limpieza gen de gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como control interno para normalizar las variaciones en la integridad y la cantidad total de ARN extraído. Los ensayos de PCR en tiempo real para GAPDH y CEA se realizaron en tubos separados. valores de CEA de mRNA se ajustan contra valores de GAPDH de ARNm, y las puntuaciones relativas de ARNm de CEA se presentaron como (CEA mRNA /GAPDH ARNm) × 10 6 para cada muestra.
5 l de la cDNA muestra se utilizó para real PCR en tiempo en una mezcla de reacción 20 l que consta de 10 cebadores apropiados pmol (cooperación Invitrogen, Japón) y 5 pmol de sonda TaqMan (Invitrogen Cooperación, Japón). El colorante indicador (6-carboxi-fluoresceína: FAM) se une covalentemente al extremo 5 'de la sonda, y el colorante extintor (6-carboxi-tetrametil-rodamina: TAMRA) se une al extremo 3' de la sonda. El perfil de temperatura utilizado para la amplificación fue como sigue: desnaturalización durante 1 ciclo a 95 ° C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos a 95 ° C durante 10 segundos, 60 ° C durante 15 segundos, y 72 ° C durante 5 segundos. La cuantificación se realiza por el sistema de detección de secuencias ABI Prism 7500. Cada conjunto de muestras y controles externos diluidas en serie fueron amplificados por duplicado. El valor promedio de los duplicados se utiliza como valor cuantitativo.
Un cebador de oligonucleótido-CEA específico fue diseñado basado en el informe de Gerhard et al.
[16]. Las secuencias fueron: 5'-TGTCGGCATCATGATTGG-3 '(sentido) y 5'-GCAAATGCTTTAAGGAAGAAGC-3' (antisentido). secuencias de la sonda fluorescente y LC-Red utilizados para la identificación CEA fueron: 5'-CCTGAAATGAAGAAACTACACCAGGGC-fluoresceína y 5'-LC-Red 640-GCTATATCAGAGCAACCCCAACCAGC-fosfato
Monitoreo en tiempo real PCR se consiguió mediante la medición de la señal de fluorescencia en el extremo. de recocido de fase de cada ciclo. Las secuencias de los cebadores utilizados para la amplificación GAPDH fueron: 5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3 '(sentido) y 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' (antisentido). Las secuencias de las sondas utilizadas para la identificación de GAPDH fueron: 5'-TCAACAGCGACACCCACTCCT-fluoresceína y 5'-LC-Red 640-CACCTTTGACGCTGGGGCT-fosfato
La determinación de CEA en muestras de suero
muestras de suero pre-operatorio también se utilizaron para el ensayo. marcador tumoral CEA usando un kit de inmunoensayo enzimático comercialmente disponible (Cobas Core EIA, Roche, Basilea, Suiza). . Patológico nivel de corte se estableció en 5 ng /ml de suero CEA
análisis estadísticos
Se utilizó el método estadístico de Kaplan-Meier para analizar las características clínicas y la recurrencia; Se estimaron las diferencias con la prueba de log-rank. Los factores pronósticos fueron examinados por análisis univariados y multivariados (prueba de log-rank para el análisis univariado y Cox modelo de regresión de riesgos proporcionales, por pasos hacia atrás (condicional LR) para el análisis multivariante). Las pruebas exactas-chi al cuadrado y Fisher se utilizaron para el análisis estadístico. Todos los análisis estadísticos se realizaron con SPSS16.0. . Todos los valores de P fueron de 2 colas, y el nivel de significación se fijó en 0,05
: Resultados de la Características clínicas
Los 123 pacientes incluidos en el estudio de 28 años a 84 años (media: 57,11 años; mediana, 59 años), y la relación de hombres a mujeres era 82:41 (Tabla 1). Puesta en escena se realizó de acuerdo a la clasificación del tumor-nódulo-metástasis (TNM) del Comité Conjunto sobre el Cáncer (AJCC, revisada en 1997). Veinticuatro tumores se encuentran en el cardia, 3 en el fondo gástrico, 44 ​​en el cuerpo gástrico, 45 en el antro gástrico, 5 implicado todo el estómago, y 2 pertenecían al carcinoma gástrico remanente (Tabla 1) .Tabla 1 clinicopatológico características y CEA * la expresión del ARNm detectado por tiempo real de RT-PCR
características
número total
(N = 123)
ARNm de CEA
valor
P

positiva (n = 45) guía empresas negativo gratis (n = 78)

Edad
≤40 página 13 página 3
10
41-50
20 página 9 página 11
51-60
39
9
30
61-70
42
18
24 Hotel > 70 página 9 página 6 página 3
0,063 Sexo seguro
Mujer
41 página 12
29
Hombre
82
33
49
0,234
tumor T1

10
6
4 de T2
16 página 3 página 13
T3
73
26
47
T4
24
10
14
0,001
ganglios linfáticos
N0
31 página 11
20
N1
43
15
28
N2
29 página 8
21
N3
20 página 11 página 9
0,261
patológica TNM # etapa
I
16 página 7
9
II
21 página 6
15
III
51
17
34
IV
35
15
20
0,623 subtipo
Histología
adenocarcinoma bien diferenciado página 3
1
2 adenocarcinoma moderadamente diferenciado
27 página 7
20
mal diferenciadas adenocarcinoma
93 condición
37
56
0,418
suero CEA
positiva
30 página 11 página 19
negativo
93
34
59
0.992
recurrencia
Sí
44
25 página 19
Sin
79
20
59
0,001
Modos de recurrencia local
recurrencia página 8 página 4
4 de la cavidad abdominal página 9 página 6 página 3
hígado página 8
5 página 3
pélvicos página 6 página 3 página 3
múltiples sitios
10 página 5 página 5
3
2
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