Påvisning av carcinoembryonic antigen messenger RNA i blodet ved hjelp av kvantitativ real-time revers transkriptase-polymerase chain reaction å forutsi tilbakefall av mage adenocarcinoma

Påvisning av carcinoembryonic antigen messenger RNA i blodet ved hjelp av kvantitativ real-time revers transkriptase-polymerase chain reaction å forutsi tilbakefall av adenokarsinom i ventrikkel
Abstract
Bakgrunn
eksistensen av sirkulerende tumorceller (CTCs) i perifert blod som en indikator på tumorresidiv er ikke fullstendig klarlagt, særlig for magekreftpasienter. Vi gjennomførte en retrospektiv analyse av forholdet mellom CTCs i perifert blod ved førstegangsdiagnose og clinicopathologic funn hos pasienter med magekreft.
Metoder
Blodprøver ble innhentet fra 123 gastrisk karsinom pasienter ved førstegangsdiagnose. mRNA ble ekstrahert og forsterket for carcinoembryonic antigen (CEA) mRNA deteksjon ved hjelp av real-time RT-PCR. Periodiske 3-måneders oppfølgingsundersøkelse inkludert serum CEA målinger og bildebehandling.
Resultater
minimumsgrensen for korrigert CEA mRNA scorer [(CEA mRNA /GAPDH mRNA) × 10 6] ble satt til 100. førti-fem av 123 pasienter (36,6%) var positive for CEA mRNA uttrykk. CEA mRNA uttrykk signifikant korrelert med T scenen og postoperativ tilbakefall status (P
= 0,001). Tilbakevendende sykdom ble funnet i 44 av 123 tilfeller (35,8%), og 25 av disse (56,8%) var positive for CEA mRNA. Av disse pasientene CEA mRNA var mer følsomme enn serum CEA i indikerer tilbakefall. Tre års sykdomsfri overlevelse av pasienter som var positive for CEA mRNA var signifikant dårligere enn av pasienter negative for CEA mRNA (P
< 0,001). Bare histologisk grad og CEA mRNA positivitet var uavhengige faktorer for sykdomsfri overlevelse ved bruk av multivariat analyse.
Konklusjoner
CEA mRNA kopier tallet i perifert blod ved førstegangsdiagnose var signifikant assosiert med tilbakefall av sykdommen i adenokarsinom i ventrikkelen. Real-time RT-PCR påvisning av CEA mRNA nivåer på første diagnosen synes å være en lovende prediktor for tilbakefall av sykdommen i adenokarsinom i ventrikkelen.
Bakgrunn
Magekreft forble den ledende årsak til kreftdødelighet i verden gjennom hele det 20. århundre. Den eneste god kurativ behandling er kirurgisk fjerning av alle grove og mikroskopiske lesjoner. Men til tross gjennomgår kurativ gastrektomi, inkludert utvidet lymfeknute disseksjon og adjuvant kjemoterapi, gjentar kreft i både regionalt og fjerne områder i flertallet av pasientene [1]. Diagnostisering av tilbakefall med vanlig oppfølging protokoller vanligvis er laget på et sent stadium, noe som til en viss grad, utelukker muligheten for effektiv behandling [2]. Overvåking av sirkulerende tumorceller (CTCs) ser ut til å gi større mulighet for tidligere diagnostisering av tilbakevendende sykdom.
Begrepet undersøke metastatisk prosess i perifert blod oppsto i det 19. århundre da T.R. Ashworth først beskrev fenomenet CTCs, og S. Paget hypotese en ikke-tilfeldig mønster av kreft metastasization (den "frø og jord 'teori) [3, 4]. Deretter ble ondartet karakter av CTCs bekreftet ved å vise at de besitter tumorspesifikke kromosomabberasjoner [5, 6] og at de vokser ex vivo som cellelinjer med en malign fenotype [7]. Flere måter å oppdage CTCs har blitt beskrevet og kan klassifiseres i PCR-baserte metoder og cytometriske metoder [8].
Med bruk av kvantitativ real-time PCR-teknikker [9], presis kvantifisering av et mål sekvens har blitt mulig . Kvantitativ PCR gir etterforskerne ikke bare med tekniske fordeler, men også med nødvendige ferdighetene fordeler, for eksempel definisjonen av cutoff-verdier indikerer mRNA uttrykk nivåer av klinisk relevans i kreftpasienter sammenlignet med friske personer. Sanntids-PCR gir også muligheter for å korrelere mål-sekvens belastning med klinisk utfall [10] eller respons overfor terapi [11].
CEA, opprinnelig beskrevet som et tumorassosiert antigen tykktarmskreft, ble klonet i 1987 og er nå anerkjent som et medlem av immunglobulin protein super [12]. Mange studier har rapportert påvisning av mage celler i blodet [13], benmarg [14], og peritoneal vasking [15] av magekreftpasienter ved hjelp av real-time PCR for CEA mRNA.
Målet med denne studien var å evaluere effektiviteten av CEA mRNA real-time PCR-teknikken for tidlig påvisning av tumor tilbakefall. For å oppfylle dette målet, forholdet mellom klinisk tilbakefall og blod nivåer av CEA mRNA preoperativt ble undersøkt i adenokarsinom i ventrikkelen.
Metoder
Pasienter
Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver pasient om bruk av blodprøver for forskning i samsvar med de institusjonelle retningslinjer i vårt sykehus. Mellom februar 2002 og desember 2006 ble totalt 123 påfølgende pasienter med adenokarsinom i ventrikkel ved Cancer Center of Sun Yat-sen-universitetet innrullert i denne studien. Alle pasientene fikk radikal reseksjon og D2 lymphadenectomy. Ved leie 15 lymfeknuter var tilgjengelig for påvisning. Ingen peritoneal formidling ble funnet. Klare registreringer av serum CEA endring og bildebehandling evaluering før operasjonen og hver tredje måned etter operasjonen var nødvendig. Pasienter som hadde positiv lymfeknute ble anbefalt å motta adjuvant kjemoterapi, men til slutt bare åttitre pasienter gjennomgikk adjuvant kjemoterapi. De regimer inkludert CAPOX (Capecitabine + oksaliplatin, 16 tilfeller, med en median syklus av fire), folfox6 (56 tilfeller, med en median syklus av seks), taxol + cisplatin (4 tilfeller, med en median syklus av fire), taxol + 5-FU /CF (Fluorouracil /Leucovorin, 7 tilfeller, med en median syklus av seks). Tilbakevendende sykdom, inkludert lokale tilbakefall og fjernmetastaser, ble oppdaget av computertomografi undersøkelse. Nye lesjoner påvist ved bildebehandling undersøkelse i oppfølgings ble ansett som tilbakefall. Biopsi ble ikke gjort rutinemessig for å bestemme histologisk tilbakefall. All bilde ble evaluert ved hjelp av minst to uavhengige observatører, herunder røntgenleger. Median oppfølgingstid var 37,0 måneder (range, 3.0-73.6 måneder).
Blodprøver
Blodprøver ble samlet inn ved førstegangsdiagnose en eller to dager før operasjonen. De første 3 ml blod ble kassert for å forhindre epidermal forurensning, og deretter en 5-ml blodprøve ble oppnådd fra det perifere vene. Perifere blodprøver hentet fra 30 ikke-kreftpasient frivillige ble brukt som negative kontroller
Alle pasienter gitt skriftlig informert samtykke.; vi fått eget samtykke for bruk av blodprøven. Studier godkjenning er innhentet fra uavhengige etiske komiteer på Cancer Center of Sun Yat-Sen University. Studien ble gjennomført i henhold til de etiske standardene i World Medical Association Helsinkideklarasjonen.
Pre-prosessering av blodprøver
Blodprøver ble samlet i EDTA-holdige rør. Utvalgets behandling ble utført innen 2 timer etter blod trekning. Blod ble overført til en 30-mL Falcon rør og sentrifugert ved 1800 rpm ved romtemperatur i 20 minutter. Serum ble fjernet, og cellene ble resuspendert i 5 ml saltvann og 0,3 ml RNA senere løsning. Etter grundig blanding, ble blodcelleblandingen holdt over natten ved 4 ° C og lagret ved -80 ° C inntil den ble brukt.
RNA-ekstraksjon og cDNA-syntese
Total RNA fra perifere blodprøver ble ekstrahert ved bruk av RNAprep Cell Kit (Tiangen Beijing, Kina) etter protokollen gitt av produsenten. RNA integritet ble kontrollert ved elektroforese og kvantifisert ved absorpsjon ved 260 og 280 nm ved hjelp av et UV-synlig spektrofotometer (Beckman Coulter Du ® 800, Fullerton, CA). For revers transkripsjon, 1 ug total RNA, 1 ul Oligo (dT) 15 og 1 ul dNTP ble fortynnet i 10 ul RNase-fritt vann, inkubert i 10 minutter ved 37 ° C og 1 pl 25 mmol /l EDTA ble tilsatt. En 11 ul aliquot av reaksjonsblandingen ble inkubert i 10 minutter ved 65 ° C og hurtig avkjølt på is i 2 minutter. cDNA ble lagret ved -80 ° C inntil anvendelse. cDNA syntese ble utført ved hjelp av TIANScript M-MLV-metoden (Tiangen Biotech, Beijing, Kina).
Cellelinjer
å forberede CEA-spesifikke RT-PCR, to cellelinjer, SW-480 (tykktarmskreft cellelinje ) og SC-7901 (magekreft cellelinje) ble anvendt. Lymfocytter ble samlet fra friske frivillige uten epitel malignitet. Etter lymfocytter ble isolert fra perifert blod ved sentrifugering, ble det mononukleære cellelaget oppsamles. Cellelinjer ble serielt fortynnet (10 ganger) i 2 x 10 7-5 x 10 7-lymfocytter for å gi carcinoma cell: lymfocytt-forhold varierende 1:10 til 1:10 7
CEA mRNA analyse av real-Time Kvantitativ PCR
Kvantitativ PCR ble utført ved hjelp av Sequence Detector System, ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems 7500 Fast real-Time PCR System). PCR primere og TaqMan prober ble utformet med Primer Express 1.0 program. I denne analysen ble husholdningsgenet glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) anvendt som en intern kontroll for å normalisere variasjoner i integritet og totale mengde av RNA ekstrahert. De Real-Time PCR-analyser for GAPDH og CEA ble gjort i separate rør. CEA mRNA-verdier ble korrigert mot GAPDH mRNA-verdier, og de relative mRNA-CEA skår ble presentert som (CEA mRNA /GAPDH mRNA) x 10 6 for hver prøve.
5 ul av prøven cDNA ble anvendt for real- time PCR i en 20 mL reaksjonsblanding bestående av 10 pmol egnede primere (Invitrogen Samarbeid, Japan) og 5 pmol TaqMan probe (Invitrogen Samarbeid, Japan). Reporteren fargestoff (6-karboksy-fluorescein: FAM) ble kovalent bundet til 5'-enden av proben, og den quencher fargestoff (6-karboksy-tetrametyl-rhodamin: TAMRA) ble festet til 3'-enden av proben. Temperaturprofilen anvendt for amplifisering var som følger: denaturering i en syklus ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser ved 95 ° C i 10 sekunder, 60 ° C i 15 sekunder og 72 ° C i 5 sekunder. Kvantifisering ble utført av ABI Prism 7500 Sequence detektorsystemet. Hvert sett av prøver og serielt-utvannet eksterne kontroller ble forsterket i duplikat. Den gjennomsnittlige verdien av duplikatene ble brukt som kvantitativ verdi., En CEA-spesifikk oligonukleotid primer ble designet basert på rapporten ved Gerhard et al.
[16]. Sekvensene var: 5'-TGTCGGCATCATGATTGG-3 '(sense) og 5'-GCAAATGCTTTAAGGAAGAAGC-3' (antisens). Fluorescerende og LC-Red probesekvenser som brukes for CEA identifikasjon var: 5'-CCTGAAATGAAGAAACTACACCAGGGC-fluorescein og 5'-LC-Red 640-GCTATATCAGAGCAACCCCAACCAGC-fosfat Real-time PCR
overvåkingen ble oppnådd ved å måle fluorescens-signalet ved utgangen. av annealing fase i hver syklus. Primersekvensene som brukes til GAPDH forsterkning var: 5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3 '(sense) og 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' (antisens). Sondesekvenser for GAPDH identifikasjon var: 5'-TCAACAGCGACACCCACTCCT-fluorescein og 5'-LC-Red 640-CACCTTTGACGCTGGGGCT-fosfat
Fastsettelse av CEA i serumprøver
Pre-operative serumprøver ble også brukt til analysering. svulst markør CEA bruker et kommersielt tilgjengelig enzym immunoassay kit (Cobas Kjerne EIA, Roche, Basel, Sveits). . Patologisk nivå cutoff ble etablert på 5 ng /ml for serum CEA
Statistiske analyser
Kaplan-Meier statistisk metode ble brukt for å analysere kliniske funksjoner og gjentakelse; forskjeller ble beregnet med log-rank test. Prognostiske faktorer ble undersøkt ved univariate og multivariate analyser (log-rank test for univariat analyse og Cox regresjonsmodell, bakover trinnvis (betinget LR) for multivariat analyse). Chi-squared og Fisher nøyaktige tester ble brukt for statistisk analyse. Alle statistiske analyser ble gjort med SPSS16.0. . Alle P-verdiene var 2-tailed, og signifikansnivå ble satt til 0,05
Resultater
Kliniske funksjoner
De 123 pasientene som deltok i studien alderen 28 til 84 år (gjennomsnitt, 57.11 år, median, 59 år), og forholdet mellom menn til kvinner var 82:41 (tabell 1). Staging ble utført i henhold til Tumor-Node-metastaser (TNM) klassifisering av det amerikanske Joint Committee on Cancer (AJCC, revidert 1997). Tjuefire svulster ble plassert i Cardia, tre i mage fundus, 44 i mage corpus, 45 i mage antrum, fem involverte hele magen, og to tilhørte den rest gastrisk karsinom (tabell 1) .table en Clinicopathologic funksjoner og CEA * mRNA uttrykk oppdaget av real-time RT-PCR
Kjennetegn Book Totalt antall plakater (N = 123) <.no> CEA mRNA
P-verdi
Positive product: (n = 45)
Negativ product: (n = 78)

Age
≤40
13
3
10
41-50
20
9
11
51-60
39
9
30
61-70
42
18
24
> 70
9
6
3
0,063
Sex
Kvinne
41
12
29
Mann fra 82
33
49
0,234
Tumor
T1
10
6
4
T2
16
3
13
T3
73
26
47
T4
24
10
14
0,001
lymfeknute
N0
31
11
20
N1
43
15
28
N2
29
8
21
N3
20
11
9
0,261
Pathologic TNM # scenen
jeg
16
7
9
II
21
6
15
III
51
17
34
IV
35
15
20
0,623
Histologi subtype
Vel differensiert adenokarsinom
3
1 2
Moderat differensiert adenokarsinom
27
7
20
Dårlig differensiert adenokarsinom
93
37
56
0,418
Serum CEA tilstand
Positiv
30
11
19
Negativ
93
34
59
0,992
Tilbakefall
Ja
44
25
19
Ingen
79
20
59
0,001
Modes av tilbakefall
Lokal tilbakefall
8
4
4
bukhulen
9
6
3
Liver
8
5
3
bekken
6
3
3
Flere steder
10
5
5
andre
3
2
1 0,959 product: * carcinoembryonic antigen
# TNM betegner tumor-node-metastaser
Registreringsfølsomhet følsomhet~~POS=HEADCOMP av CEA mRNA ved real-time RT-PCR
CEA mRNA ble oppdaget i SW -480 og SC-7901 cellelinjer. Den nedre grensen for deteksjon var en konsentrasjon på 10 kreftceller per 10 7 lymfocytter. Konvensjonell nestet RT-PCR ble benyttet for å bekrefte følsomheten av RT-PCR-produkt.
CEA mRNA-ekspresjon i blodet
CEA-mRNA-ekspresjon ble påvist i 9 av 30 (30,0%) ikke-kreftpasienter, og den midlere korrigert CEA mRNA poengsum var 7,5 (variasjon 0 til 92,5). Den maksimale verdi av korrigert CEA mRNA stillingen hos pasienter uten malignitet var 92,5, så en grenseverdi på 100 ble anvendt i denne studien. Ved hjelp av denne grenseverdi, ble 45 pasienter (36,6%) diagnostisert som CEA mRNA-positive. Gjennomsnittlig korrigert CEA mRNA Resultat [(CEA mRNA /GAPDH mRNA) × 10 6] av de 123 pasientene var 37,510.0 (range, 0-3,695,652.1) kopier Figur 1 viser fordelingen av (CEA mRNA /GAPDH mRNA) × 10 6 i denne pasientgruppen. Figur 1 Fordelingen av CEA ekspresjonsnivå. Forholdet mellom middel (CEA mRNA /GAPDH mRNA) x 106. Tatt i betraktning at forholdet mellom noen pasienter ble null, tilsatte vi 0,5 til forholdet.
Forholdet mellom CEA mRNA-ekspresjon og clinicopathologic funksjoner
CEA mRNA-ekspresjon ikke korrelerer med alder, kjønn, N scenen, TNM stadium, histologisk subtype og serum CEA tilstand (tabell 1). Imidlertid pasienter med postoperativ tilbakefall hadde signifikant høyere prosentandel av CEA mRNA positiv enn de uten tumorresidiv (P
= 0,001) (tabell 1). Dessuten tumor dybde også positivt korrelert med CEA mRNA uttrykk (P
= 0,001).
Forholdet mellom tilbakefall og CEA mRNA uttrykk samt serum CEA
modus for tilbakefall omfatter åtte lokalt tilbakefall, 9 mage formidling unntatt lever, 8 levermetastaser, 6 bekken metastaser, 3 andre nettsteder metastaser og 10 flere nettsteder metastasering. Det er ingen signifikant forskjell mellom de CEA mRNA-ekspresjon og modusen for tilbakefall (tabell 1).
Tilbakevendende sykdom ble funnet i 44 av 123 tilfeller (35,8%). Tjuefem av disse pasientene (56,8%) var CEA mRNA-positive. Derimot, bare 14 pasienter med residiverende sykdom (31,8%) var positive for preoperativ serum CEA. De som særpreger CEA mRNA og serum CEA å indikere tilbakefall var 74,7% og 79,9%, henholdsvis. (Tabell 2) .table 2 Sammenligning mellom CEA * mRNA og serum CEA i å forutsi tilbakefall

CEA mRNA
serum CEA

Positive

Negative

Positive

Negative

Recurrence
Yes
25
19
14
30
Ingen
20
59
16
63
P
0,001
0,152
X
2
12,088
2.050
Følsomhet (%)
56,8
31,8
spesifisitet (%)
74,7
79,7 product: * carcinoembryonic antigen
Univariat og multivariat analyse av 3-års sykdomsfri overlevelse
5 års total overlevelse var 58,9% og 3 års sykdomsfri overlevelse var 63,9%. Begge univariate og multivariate analyser ble brukt for å vurdere forhold knyttet til sykdomsfri overlevelse. Ifølge univariat analyse, alder, tumor dybde, nodal metastase, ble histologiske grad, TNM stadium, CEA mRNA positivitet og serum CEA positivitet signifikant relatert til sykdomsfri overlevelse (p = 0,031
, < 0,001, 0,001, 0,022, < 0,001, 0,001, 0,045 henholdsvis) (tabell 3). Multivariat regresjonsanalyse viste at bare histologisk grad og CEA mRNA positivitet var uavhengige faktorer for sykdomsfri overlevelse (P
= 0,047 og 0,020, henholdsvis tabell 4). Tre års sykdomsfrie overlevelse for CEA mRNA-positive pasienter var betydelig lavere enn for CEA mRNA negative pasienter (43,9% versus 74,1%, henholdsvis P
= 0,001, figur 2) .table 3 Univariat analyse av sykdoms- overlevelse i Gastric carcinoma
Parameter
Sykdomsfri overlevelse, P valueA
Age
< 59 vs. ≥59
0,031
Kjønn
Mann vs. kvinnelige
0,433
CEA mRNA product: (+) vs. (-)
0,001
Serum CEA product: (+) vs. (-)
0,045
Histologisk klasse
Vel /moderat vs. dårlig
0,022
pT
pTis /PT1 vs. pT2 /pT3 /pT4
< 0,001
pN
(+) vs. (-)
0,001
Stage
1/2 vs 3/4
< 0,001
adjuvant kjemoterapi agenter
CAPOX vs. mFOLFOX6 vs. taxol + DDP vs. taxol + 5-FU /CF
0.850
en Log-rank test
Tabell 4 multivariat analyse av sykdomsfri overlevelse i gastrisk karsinom
Faktorer Book Kjennetegn
Hazard ratio
95% KI
P value

Unfavorable

Favorable

Age
≥59
<59
1.018
0.986-1.050
0.273
Histological grade
Poorly
Well/moderately
0.412
0.171-0.990
0.047
pT
2/3/4
Tis/1
1.673
0.100-8.690
0.947
pN
(+)
(-)
2.030
0.264-15.611
0.497
Stage
3/4
½
1.437
0.124-16.613
0.771
CEA mRNA product: (+) product: (-)
2,243
1,138 til 4,424
0,020
Serum CEA product: (+) product: (-)
1.130
0,582 til 2,194
0,717
CI, konfidensintervall; PT, dybde av tumorinvasjon
Figur 2 Sykdomsfri overlevelse av pasienter i henhold til CEA mRNA uttrykk. Tre års sykdomsfri overlevelse av CEA mRNA-positive pasienter var betydelig lavere enn for CEA mRNA-negative pasienter (henholdsvis 43,9% mot 74,1%,; P
= 0,001).
Diskusjon
semi -quantitative natur av tradisjonell PCR-teknologi har gjort det vanskelig å skille mellom basislinje genekspresjon nivåer i normalt vev fra økte genekspresjon nivå i kreft, for derved å øke det bekymring for falske-positive resultater [17]. I vår studie ble real-time PCR av CEA mRNA brukes for å undersøke muligheten for perifert blod som en kilde for CTC deteksjon og prediksjon av kreft tilbakefall i magekreft pasienter. Real-time kvantitativ CEA mRNA analyse hos kreftpasienter er ofte utført basert på CEA mRNA positivitet, som bestemmes ved hjelp av et nivå cutoff [13]. CEA mRNA kan oppdages hos pasienter med benign sykdom samt friske frivillige, så cutoff nivåene er vanligvis bestemt av maksimalt uttrykk i ikke-maligne pasienter [18, 19]. Setoyama T et al. funnet at den maksimale verdi av CEA mRNA hos pasienter uten malignitet var 8,6, setter de derfor verdien cutoff som 9.0 [20]. Schuster R et al. [21] også brukt den maksimale verdien av sunn frivillige bakgrunn som cut-off verdi for CEA mRNA deteksjon i pasienter med kolorektal kreft. I vår studie, brukte vi også den maksimale verdien av korrigert CEA mRNA poengsum hos pasienter uten malignitet som verdi cutoff. Ved å etablere en grenseverdi på 100 ° C i normaliserte CEA mRNA-nivåer, kan vi skille kreftpasienter som fra ikke-kreft-pasienter, og derfor større sikkerhet vurdere ekspresjonen av CEA mRNA som en markør for sirkulerende tumorceller.
Vi fant at 10 pasienter med T1 svulst, 6 pasienter hadde positive CEA-mRNA uttrykk. Men ingen registrering av tilbakefall ble funnet i 10 pasienter. Det virker som det ikke er noen sammenheng mellom CEA mRNA uttrykk og tilbakefall i T1 svulst. Det er vanskelig å forklare den høye positive frekvensen av CEA-mRNA i T1 pasienter, men vi fant at CEA mRNA uttrykk var lav i de 6 T1 pasienter, som strekker seg fra 4320 eksemplarer til 44 600 eksemplarer. Ikeguchi M [22] rapporterte at 12,5% av fase I gastrisk karsinom pasientene uttrykte mRNA CK20, og de anses at det ble indusert ved en liten CK20 uttrykk i perifere hvite blodceller.
Få rapporter har vurdert tilstanden av CTCs i gastrisk karsinom pasienter før behandling. Ikeguchi og Kaibara rapportert [23] at de ikke kunne finne noen kreftceller i perifert blod fra ubehandlede magekarsinom pasienter. Forfatterne spekulert i at kreftceller ikke synes å enkelt migrere til perifert blod fra primære svulster hos pasienter med ubehandlet magekreft. I motsetning Miyazono et al.
[24] viste at positiv rate for CEA mRNA av magekreft pasienter var 8,8% før operasjonen. Tilstedeværelsen av CTCs før behandlingen og dens forhold til kliniske utfall forblir dermed kontroversielt. I denne studien, vurderte vi den kliniske betydningen av CTCs i blod før operasjonen ved å bruke real-time RT-PCR for å påvise uttrykk av CEA mRNA. Den positive frekvensen av CEA mRNA før noen behandling er 36,6%. Tilleggs fil 1 viser positiv rate av mRNA markører fra litteraturen for påvisning av tumorceller ved real-time RT-PCR.
O'Sullivan et al.
[25] foreslått at preoperativ påvisning av micrometastasis kan gjenspeile enten forbigående Shedding av celler, metastatisk potensial, eller restsykdom. I denne studien fant vi at CTCs ble påvist i blod før behandling i forhold til tilbakefall. Flere rapporter har vist at preoperativ påvisning av sirkulerende kreftceller var en klar markør for dårlig pasientoverlevelse, fordi mange tilfeller med sirkulerende kreftceller preoperativt viste enten utvidet lymfeknutemetastase eller fjern metastase, således prognosen for slike pasienter var dårlig [26-28 ]. I denne studien fant vi at uttrykket av CEA mRNA var signifikant relatert til tilbakefall av sykdommen. Videre pasienter med positiv CEA mRNA hadde kortere 3 års sykdomsfri overlevelse utfallet. Forekomsten av tilbakefall var signifikant høyere hos pasienter positive for CEA mRNA enn i de negative.
Følsomheten CEA mRNA uttrykk for å forutsi tilbakefall er bare 56,8%. Nitten av sytti-åtte pasienter (24,4%) med negativ CEA mRNA uttrykk hadde svulst tilbakefall. Setoyama et al.
[20] viste at 8 av 69 (11,6%) spiserørskreft pasienter med negativ CEA mRNA uttrykk hadde svulst tilbakefall, og 6 pasienter hadde lymfeknute tilbakefall. En hyppig brukt forklaring på deteksjon svikt er at sirkulerende celler ikke er homogent fordelt og ikke-kontinuerlig skur i sirkulasjon [29, 30]. Videre er det ideelle markør (ingen uekte ekspresjon i blod, høy ekspresjon i tumorceller) har ennå ikke blitt funnet. Utover CEA mRNA, andre transkripsjoner, inkludert cytokeratin (CA) 18 [31], matriksmetalloproteinase (MMP) -7 [32], CK 20 [33], Urokinase-type plasminogen aktivator reseptoren (uPAR), CK 19 og CK 7 [ ,,,0],34], har vært forsøkt som potensielle markører for CTCs. Imidlertid bør den tumorcelle-skur være en forholdsvis sjelden hendelse. Således, enten perifert blod er et passende rom for tidlig påvisning av mikrometastaser er fremdeles kontroversiell. Andre avdelinger som benmarg eller bukhulen er kjent for å gi høyere deteksjon priser, sannsynligvis på grunn av et større antall kreftceller til stede [35-37].
En annen viktig sak er falsk positivt uttrykk for CEA mRNA. Tjue pasienter (44,4%) som hadde positiv CEA mRNA uttrykk ikke ta tilbakefall i oppfølgingen. En årsak kan være den relativt korte oppfølgingsperioden.
Alternativt kan dette være ganske rimelig fordi få carcinoma celler skur i blodet lykkes i å etablere metastatisk sykdom [25]. Disse sirkulerende kreftceller kan ikke legge til fjerne organer og kan ikke vokse. Nylig, Méhes et al.
[38] undersøkte morfologien av sirkulerende kreftceller, og funnet at de fleste sirkulerende brystkreftceller var i en tilstand av apoptose. I det perifere blod fra kreftpasienter, ble eksistensen av tumorcelle-lymfocytt-komplekset observert [39]. Disse funnene tyder på at makrofager eller lymfocytter kan spille en viktig rolle i induksjon av sirkulerende tumorcelle-apoptose og antitumorimmunrespons i verten. Disse immunisert makrofager kan bevisstgjøre de cytotoksiske T-lymfocytter av verten, og lysfølsomt T-lymfocytter kan angripe de gjenværende mikrometa kreft lesjoner av pasientene [23]. For å klargjøre denne hypotesen, videre undersøkelser angående sammenhengen mellom tilstedeværelsen av sirkulerende kreftceller og vertens immunrespons er nødvendig.
Studien var retrospektiv analyse, og pasienten som skal motta adjuvant kjemoterapi ble ikke innstilt på forhånd. Generelt ble pasienter som hadde positiv lymfeknute anbefales å få adjuvant kjemoterapi. Til nå er det ingen standard kriterier for adjuvant kjemoterapi av magekreft i Kina. Vår studie viste at CEA mRNA kopiantall i perifert blod ved førstegangsdiagnose var signifikant assosiert med tilbakefall av sykdommen i adenokarsinom i ventrikkelen. I utsiktspunktet av tilbakefall, foreslår vi derfor at pasienter som har positiv CEA mRNA uttrykk preoperativt mottar adjuvant kjemoterapi etter radikal reseksjon
. Konklusjoner
I denne studien følsomheten til CEA mRNA var høyere enn for serum CEA. Videre, ifølge multivariat regresjonsanalyse, CEA mRNA positivitet var en selvstendig faktor for tilbakefall. Studien bekreftet at en slik metode var lovende for tidlig påvisning av CTCs hos pasienter med gastrisk karsinom før behandling; pasienter med positiv CEA mRNA kan ha en høyere risiko for tilbakefall selv etter kurativ reseksjon. Det er imidlertid en stor randomisert prospektiv studie garantert til å definere rollen til CEA mRNA deteksjon i blodet
Forkortelser
RT-PCR.
Revers transkriptase-Polymerase Chain Reaction

CTCs:
Circulating tumorceller
CEA:
carcinoembryonic Antigen
CA19-9:
Karbohydrat Antigen 19-9
TNM:
Tumor-Node-metastaser
AJCC:
amerikanske Joint Committee on Cancer
GAPDH:
glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase
MMP-7:
matriksmetalloproteinase-7


uPAR.
urokinasetype plasminogenaktivator Receptor
Erklæringer
Takk
Dette arbeidet ble finansiert av National Natural Science Foundation of China stipend 30672408, Guangzhou Bureau of Science and Technology gi 2006Z3-E0041 og Sun Yat-sen-universitetet 985 Program Initiation Fund (Kina). Vi takknemlig takke ansatte ved Institutt for medisinsk onkologi og GI kirurgi Oncology på Sun Yat-sen-universitetet Cancer Center for deres forslag og hjelp
Electronic supplerende materiale
12967_2009_529_MOESM1_ESM.DOC tilleggsfiler. 1: data fra litteraturen for påvisning av tumorceller ved sanntids RT-PCR av mRNA-markører. Den viser den positive frekvensen av mRNA-markører fra litteraturen for påvisning av kreftceller ved sanntids RT-PCR. (DOC 58 KB) Forfatternes opprinnelige innsendte filer for Images Nedenfor er linkene til forfatternes opprinnelige innsendte filer for bilder.

• DNA polymeraseη protein uttrykk spår behandlingsrespons og overlevelse av metastatisk adenokarsinom i pasienter behandlet med oksaliplatin kjemoterapi
• Effektiviteten av ultralyd i å verifisere plasseringen av et nasogastrisk rør i pasienter med lav bevissthet hos en nødsituasjon senter