La détection de l'antigène carcinoembryonnaire ARN messager dans le sang en utilisant quantitative en temps réel inverser la réaction en chaîne transcriptase-polymerase pour prédire la récidive de l'adénocarcinome gastrique

La détection de l'antigène carcinoembryonnaire ARN messager dans le sang en utilisant quantitative en temps réel inverser la réaction en chaîne transcriptase-polymerase pour prédire la récidive de l'adénocarcinome gastrique
Résumé de l'arrière-plan
L'existence de cellules tumorales circulantes (CTC) dans le sang périphérique comme indicateur de récidive de la tumeur n'a pas été clairement établie, en particulier pour les patients atteints de cancer gastrique. Nous avons effectué une analyse rétrospective de la relation entre les CTC dans le sang périphérique à des constatations de diagnostic et de clinicopathologiques initiales chez les patients atteints d'un carcinome gastrique.
Méthodes de les échantillons de sang ont été obtenus à partir de 123 patients atteints d'un carcinome gastrique au moment du diagnostic initial. L'ARNm a été extrait et amplifié pour l'antigène carcinoembryonnaire (CEA), l'ARNm en utilisant une détection en temps réel RT-PCR. Périodiques examens de suivi de 3 mois inclus les mesures du CEA sérique et de l'imagerie.: Résultats
Le seuil minimum pour corriger CEA ARNm score de [(CEA ARNm /GAPDH ARNm) × 10 6] a été fixé à 100. Quarante-cinq des 123 patients (36,6%) étaient positifs pour l'expression de l'ARNm CEA. expression CEA ARNm significativement corrélé avec le stade T et l'état de récidive postopératoire (P
= 0,001). maladie récurrente a été trouvée dans 44 des 123 cas (35,8%), et 25 d'entre eux (56,8%) étaient positifs pour le CEA ARNm. Parmi ces patients, le CEA ARNm était plus sensible que le CEA sérique en indiquant la récurrence. la survie sans maladie à trois ans des patients positifs pour le CEA ARNm a été significativement plus faible que des patients négatifs pour le CEA ARNm (P
< 0,001). Seul le grade histologique et le CEA ARNm positivité étaient des facteurs indépendants de la survie sans maladie en utilisant une analyse multivariée.
Conclusions
CEA ARNm nombre de copies dans le sang périphérique au moment du diagnostic initial était significativement associée à la récidive de la maladie chez les patients atteints d'adénocarcinome gastrique. En temps réel de détection RT-PCR des niveaux d'ARNm de CEA au moment du diagnostic initial semble être un prédicteur prometteur pour récidive de la maladie chez les patients atteints d'adénocarcinome gastrique.
Contexte
Le cancer gastrique est restée la principale cause de mortalité par cancer dans le monde entier tout au long du 20e siècle. Le seul traitement curatif est la résection chirurgicale éprouvée de toutes les lésions macroscopiques et microscopiques. Cependant, en dépit de subir une gastrectomie curative, y compris la lymphe prolongée ganglionnaire et chimiothérapie adjuvante, le cancer réapparaît à la fois régionale, ainsi que des sites distants dans la majorité des patients [1]. Le diagnostic de récidive avec des protocoles communs de suivi est habituellement faites à un stade tardif, qui, dans une certaine mesure, exclut la possibilité d'un traitement efficace [2]. La surveillance des cellules tumorales circulantes (CTC) semble offrir une plus grande possibilité pour le diagnostic précoce de la maladie récurrente.
Le concept d'enquêter sur le processus métastatique dans le sang périphérique origine au 19ème siècle, lorsque T.R. Ashworth décrit d'abord le phénomène de CTCs, et S. Paget a émis l'hypothèse d'un motif non aléatoire de métastases du cancer (la «graine et le sol« théorie) [3, 4]. Par la suite, la nature maligne de CTCs a été confirmée en démontrant qu'ils possèdent des aberrations chromosomiques spécifiques de la tumeur [5, 6] et qu'ils se développent ex vivo comme les lignées de cellules présentant un phénotype malin [7]. Plusieurs approches pour détecter les CTC ont été décrits et peuvent être classés dans les méthodes basées sur la PCR et les méthodes cytométrie [8].
Avec l'avènement de quantitative en temps réel des techniques de PCR [9], une quantification précise d'une séquence cible est devenu possible . PCR quantitative fournit aux enquêteurs non seulement des avantages techniques, mais aussi avec des avantages applicatifs, tels que la définition des valeurs de coupure indiquant les niveaux d'expression d'ARNm de pertinence clinique chez les patients atteints de cancer par rapport aux sujets sains. PCR en temps réel offre également des possibilités de corrélation entre la charge cible de séquence avec les résultats cliniques [10] ou la réponse au traitement [11]. Le plus LEC, décrit à l'origine comme un antigène de cancer du côlon associée à une tumeur, a été clone en 1987 et est maintenant reconnu comme un membre de la superfamille des immunoglobulines de la protéine [12]. De nombreuses études ont rapporté la détection de cellules gastriques dans le sang [13], la moelle osseuse [14], et le lavage péritonéale [15] des patients atteints de cancer gastrique en utilisant la PCR en temps réel pour le CEA ARNm.
Le but de cette étude était de évaluer l'efficacité de la technique de PCR en temps réel CEA ARNm pour la détection précoce de la récidive de la tumeur. Pour atteindre cet objectif, la relation entre les niveaux d'ARNm CEA sanguins récidive clinique et préopératoire a été examinée chez des patients d'adénocarcinome gastrique.
Méthodes
écrit le consentement éclairé des patients a été obtenu à partir de chaque patient sur l'utilisation des échantillons de sang pour la recherche en conformité avec les directives institutionnelles de notre hôpital. Entre Février 2002 et Décembre 2006, un total de 123 patients consécutifs atteints d'un adénocarcinome gastrique au Cancer Center de l'Université Sun Yat-sen ont été inscrits dans cette étude. Tous les patients ont reçu une résection radicale et D2 lymphadénectomie. À la location de 15 ganglions lymphatiques étaient disponibles pour la détection. Aucune diffusion péritonéale n'a été trouvé. Effacer les enregistrements de sérum changement CEA et de l'évaluation de l'imagerie avant l'opération et tous les trois mois après l'opération ont été nécessaires. Les patients qui avaient des ganglions lymphatiques positifs ont été recommandées pour recevoir une chimiothérapie adjuvante mais finalement seulement quatre-vingt trois patients ont subi une chimiothérapie adjuvante. Les régimes inclus CAPOX (capécitabine + oxaliplatine, 16 cas, avec un cycle médian de 4), folfox6 (56 cas, avec un cycle médian de 6), le taxol + cisplatine (4 cas, avec un cycle médian de 4), le taxol + 5FU /CF (fluorouracil /leucovorine, 7 cas, avec un cycle médian de 6). maladie récurrente, y compris rechute et éloignés des métastases locales, a été détectée par un examen de tomographie par ordinateur. De nouvelles lésions détectées par l'examen d'imagerie dans les nominations de suivi ont été considérés comme la récurrence. Biopsie n'a pas été fait régulièrement pour déterminer la récidive histologique. Tout l'imagerie a été évaluée par au moins deux observateurs indépendants, y compris les radiologistes. La période de suivi médiane était de 37,0 mois (extrêmes, 3.0-73.6 mois) les échantillons de sang de sang Les échantillons de. Ont été recueillies au moment du diagnostic initial un ou deux jours avant la chirurgie. Les 3 premiers millilitres de sang a été jeté pour éviter toute contamination de l'épiderme, puis un échantillon de sang de 5 ml ont été obtenues à partir de la veine périphérique. Des échantillons de sang périphérique obtenus à partir de 30 non-cancer patients volontaires ont été utilisés comme témoins négatifs
Tous les patients donné leur consentement éclairé par écrit. nous avons obtenu un consentement distinct pour l'utilisation d'un échantillon de sang. l'approbation de l'étude a été obtenue à partir de comités d'éthique indépendants au Cancer Center de l'Université Sun Yat-Sen. L'étude a été réalisée en conformité avec les normes éthiques de la Déclaration de l'Association médicale d'Helsinki mondiale.
Pré-traitement des échantillons de sang des échantillons de sang ont été recueillis dans des tubes contenant de l'EDTA. Le traitement des échantillons a été effectuée dans les 2 heures après le retrait de sang. Le sang a été transféré dans un tube Falcon de 30 ml et on centrifuge à 1800 tours par minute à la température ambiante pendant 20 minutes. Le sérum a été retiré et les cellules ont été remises en suspension dans 5 ml de sérum physiologique et 0,3 ml d'ARN ensuite la solution. Après avoir bien mélangé, le mélange des cellules sanguines a été conservée pendant une nuit à 4 ° C et conservé à -80 ° C jusqu'à leur utilisation. Extraction
d'ARN et synthèse d'ADNc de l'ARN total d'échantillons de sang périphérique a été extrait en utilisant le kit Cell RNAprep (Tiangen , Beijing, Chine) en suivant le protocole fourni par le fabricant. l'intégrité de l'ARN a été vérifiée par électrophorèse et quantifiée par absorption à 260 et 280 nm en utilisant un spectrophotomètre UV-visible (Beckman Coulter Du ® 800, Fullerton, CA). Pour la transcription inverse, 1 pg d'ARN total, 1 pi d'oligo (dT) 15 et 1 ul de dNTP ont été dilués dans 10 pi d'eau sans RNase, mis à incuber 10 minutes à 37 ° C et 1 ul de 25 mmol /L d'EDTA ont été ajoutés. Une aliquote de 11 pi de mélange réactionnel a été mis en incubation pendant 10 minutes à 65 ° C et on refroidit rapidement sur de la glace pendant 2 minutes. L'ADNc a été stocké à -80 ° C jusqu'à utilisation. la synthèse d'ADNc a été réalisée selon la méthode TIANScript M-MLV (Tiangen Biotech, Beijing, Chine).
lignées cellulaires
Pour préparer RT-PCR spécifiques de CEA, deux lignées cellulaires, SW-480 (lignée cellulaire de cancer du côlon ) et SC-7901 (lignée cellulaire de cancer gastrique) ont été utilisés. Les lymphocytes ont été recueillies auprès de volontaires en bonne santé sans malignité épithéliale. Après que les lymphocytes ont été isolés à partir du sang périphérique par centrifugation à gradient, la couche de cellules mononucléaires ont été recueillies. Les lignées cellulaires ont été dilués en série (10 fois) dans 2 x 10 7 à 5 x 10 7 lymphocytes pour donner cellules de carcinome: ratios de lymphocytes allant 1:10-1:10 7.
CEA ARNm Analyse par PCR quantitative de Real-Time PCR quantitative a été réalisée en utilisant le système de détecteur de séquence ABI PRISM 7500 (7500 système PCR rapide en temps réel Applied Biosystems). Des amorces de PCR et des sondes TaqMan ont été conçues en utilisant le logiciel Primer Express 1.0. Dans cet essai, le ménage gène glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) a été utilisé comme témoin interne pour normaliser les variations de l'intégrité et de la quantité totale d'ARN extrait. Les essais de PCR en temps réel pour la GAPDH et le CEA ont été réalisées dans des tubes séparés. Les valeurs CEA d'ARNm ont été ajustés par rapport aux valeurs GAPDH ARNm, et les scores relatifs CEA d'ARNm ont été présentés comme (CEA ARNm /GAPDH ARNm) × 10 6 pour chaque échantillon.
5 pi de l'échantillon d'ADNc a été utilisé pour réel PCR en temps dans un mélange de réaction de 20 ul constitué de 10 pmol des amorces appropriées (Invitrogen coopération, Japon) et 5 sonde pmol TaqMan (Invitrogen coopération, Japon). Le colorant rapporteur (6-carboxy-fluorescéine: FAM) a été fixé de manière covalente à l'extrémité 5 'de la sonde, et le colorant désactivateur (6-carboxy-tétraméthyl-rhodamine: TAMRA) a été attaché à l'extrémité 3' de la sonde. Le profil de température utilisé pour l'amplification était le suivant: dénaturation pendant 1 cycle à 95 ° C pendant 10 minutes, suivie de 40 cycles à 95 ° C pendant 10 secondes, 60 ° C pendant 15 secondes et 72 ° C pendant 5 secondes. La quantification a été faite par le système de détection de séquence ABI Prism 7500. Chaque ensemble d'échantillons et des contrôles externes en série dilué ont été amplifiés en double exemplaire. La valeur moyenne des doublons a été utilisée comme valeur quantitative.
Un oligonucléotide amorce spécifique du CEA a été conçu sur la base du rapport de Gerhard et al.
[16]. Les séquences sont les suivantes: 5'-TGTCGGCATCATGATTGG-3 '(sens) et 5'-GCAAATGCTTTAAGGAAGAAGC-3' (anti-sens). des séquences de sondes fluorescentes et LC-Rouge utilisées pour l'identification du CEA étaient les suivantes: 5'-fluorescéine et CCTGAAATGAAGAAACTACACCAGGGC-5'-LC-Rouge 640-GCTATATCAGAGCAACCCCAACCAGC-phosphate
surveillance en temps réel par PCR a été effectuée en mesurant le signal de fluorescence à la fin. de recuit de la phase de chaque cycle. Les séquences des amorces utilisées pour l'amplification de GAPDH ont été: 5 'TGAACGGGAAGCTCACTGG-3' (sens) et 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 '(anti-sens). Les séquences de sondes utilisées pour l'identification de GAPDH sont les suivantes: 5'-fluorescéine et TCAACAGCGACACCCACTCCT-5'-LC-Rouge 640-CACCTTTGACGCTGGGGCT-phosphate
Détermination du CEA dans des échantillons de sérum pré-opératoire des échantillons de sérum ont également été utilisés pour le dosage. marqueur tumoral CEA en utilisant un kit de dosage immunologique enzymatique disponible dans le commerce (Cobas base EIA, Roche, Bâle, Suisse). niveau de coupure anatomopathologique a été établi à 5 ng /mL pour le CEA sérique des analyses de statistiques
La méthode statistique de Kaplan-Meier a été utilisée pour analyser les caractéristiques cliniques et de récidive. les différences ont été estimées avec le test du log-rank. Les facteurs pronostiques ont été examinés par des analyses univariée et multivariée (test log-rank pour l'analyse univariée et risques proportionnels de Cox modèle de régression, pas à pas vers l'arrière (conditionnel LR) pour l'analyse multivariée). Les tests exacts chi-carré et Fisher ont été utilisés pour l'analyse statistique. Toutes les analyses statistiques ont été réalisées avec SPSS16.0. . Résultats de toutes les valeurs de P étaient 2 à queue, et le niveau de signification a été fixé à 0,05
Caractéristiques cliniques
Les 123 patients inclus dans l'étude de 28 ans à 84 ans (moyenne, 57.11 ans; médiane, 59 ans), et le rapport des mâles aux femelles était 82:41 (tableau 1). Staging a été réalisée selon la classification des tumeurs-Node-Metastasis (TNM) de la American Joint Committee on Cancer (AJCC, révisée en 1997). Vingt-quatre tumeurs ont été localisés dans le cardia, 3 dans le fundus gastrique, 44 dans le corps gastrique, 45 dans l'antre gastrique, 5 impliquer l'ensemble de l'estomac et 2 appartenaient au carcinome gastrique restant (tableau 1) .Tableau 1 clinicopathologic caractéristiques et CEA * expression de l'ARNm détecté par temps réel RT-PCR
caractéristiques
nombre total
(N = 123)

la valeur P du CEA ARNm
positif (n = 45)
négatif (n = 78)

Age
≤40
13 3
10
41-50
20
9
11
51-60
39
9
30
61-70
42
18
24
> 70
9
6 3
0,063
Sex
41
12
29
Masculin Féminin de 82
33
49
0,234
Tumor
10
T1 6 4
73
26
47
T4 de 16 3
13
T3 T2
24
10
14
0,001
ganglionnaire
43
15
28
N2 de 31
11
20
N1 de N0
29 8
21
N3
20
11
9
0,261
anatomopathologique TNM # stade
I
16
7
9
II
21
6
15
III
51
17
34
IV
35
15
20
0,623
histologie sous-type
bien différencié adénocarcinome 3
1 2
Modérément différencié adénocarcinome
27
7
20
mal 93
37
56
0,418
Sérum CEA état adénocarcinome différencié
positif
30
11
19
négatif
93
34
59
0,992
Récurrence
Oui
44
25
19
Non
79
20
59
0,001
Modes de récidive
récidive locale 8
4 4
cavité abdominale
9
6 3
foie
8
5 3
pelviens
6 3
3
Plusieurs sites
10
5
5
autres 3
2 1
0,959
* antigène carcino
# TNM désigne une tumeur-node-métastase
sensibilité de détection de l'ARNm de CEA en temps réel par RT-PCR
CEA ARNm a été détecté dans SW -480 et SC-7901 lignées cellulaires. La limite inférieure de détection était une concentration de 10 cellules tumorales par 10 7 lymphocytes. Conventionnel imbriquée RT-PCR a été utilisée pour confirmer la sensibilité du produit de RT-PCR.
Expression CEA ARNm dans le sang
expression CEA ARNm a été détecté dans 9 des 30 (30,0%) patients non cancéreux, et la moyenne Le score corrigé CEA ARNm était de 7,5 (intervalle, 0 à 92,5). La valeur maximale de correction Le score CEA ARNm chez les patients sans malignité était de 92,5, donc une valeur de coupure de 100 a été utilisé dans la présente étude. L'utilisation de cette valeur seuil, 45 patients (36,6%) ont été diagnostiqués comme CEA ARNm positif. La moyenne corrigée CEA ARNm score de [(CEA ARNm /GAPDH ARNm) × 10 6] des 123 patients était 37,510.0 (gamme, 0-3,695,652.1) copies Figure 1 ont montré la distribution de (CEA ARNm /GAPDH ARNm) x 10 6 dans ce groupe de patients. Figure 1 La répartition du niveau d'expression CEA. Les moyens de rapport (CEA ARNm /GAPDH ARNm) × 106. Considérant le rapport de certains patients a zéro, nous avons ajouté 0,5 au rapport.
Relation entre le CEA expression de l'ARNm et clinicopathologiques caractéristiques
expression CEA ARNm ne sont pas corrélés avec l'âge, le sexe, le stade N, le stade TNM, sous-type histologique et la condition du CEA sérique (tableau 1). Cependant, les patients avec récidive postopératoire avaient pourcentage significativement plus élevé de CEA ARNm positif que ceux sans récidive de la tumeur (P
= 0,001) (tableau 1). En outre, la profondeur de la tumeur aussi positivement corrélée avec l'expression de l'ARNm CEA (P
= 0,001).
Relation entre la récurrence et l'expression de l'ARNm CEA ainsi que le CEA sérique
Le mode de récurrence comprend 8 récidive locale, 9 diffusion abdominale sauf le foie, 8 métastases hépatiques, 6 métastases pelviennes, 3 autres sites de métastases et 10 sites multiples métastases. Il n'y a pas de différence significative entre l'expression de l'ARNm CEA et le mode de récurrence (tableau 1).
Maladie récurrente a été trouvé dans 44 des 123 cas (35,8%). Vingt-cinq de ces patients (56,8%) étaient CEA ARNm positif. En revanche, seulement 14 patients atteints d'une maladie récurrente (31,8%) étaient positifs pour le CEA sérique préopératoire. Les particularités de l'ARNm du CEA et du sérum du CEA pour indiquer la récurrence étaient de 74,7% et 79,9%, respectivement. (Tableau 2) .Table 2 Comparaison entre le CEA * ARNm et CEA sérique dans la prédiction de la récidive

CEA ARNm
Sérum CEA

Positive

Negative

Positive

Negative

Recurrence
Yes
25
19
14
30
Non
20
59
16
63
P
0,001
0,152
X 2
12,088
2.050
Sensibilité (%) 56,8

31,8
Spécificité (%) 74,7

79,7
* antigène carcino
univariée et multivariée analyses de survie sans maladie à 3 ans
La survie globale à 5 ans était de 58,9% et la survie sans maladie à 3 ans était de 63,9%. Les deux analyses univariée et multivariée ont été utilisés pour évaluer les facteurs relatifs à la survie sans maladie. Selon l'analyse univariée, l'âge, la profondeur de la tumeur, métastase ganglionnaire, le grade histologique, le stade TNM, CEA ARNm positivité et le sérum CEA positivité étaient significativement liés à la survie sans maladie (P
= 0,031, < 0,001, 0,001, 0,022, < 0,001, 0,001, 0,045, respectivement) (tableau 3). Une analyse de régression multivariée a montré que seul le grade histologique et le CEA ARNm positivité étaient des facteurs indépendants de la survie sans maladie (P = 0,047
et 0,020, respectivement, tableau 4). Les taux de survie de trois ans sans maladie pour les patients ARNm-positifs du CEA ont été significativement plus faible que pour le CEA ARNm patients négatifs (43,9% contre 74,1%, respectivement, P = 0,001
, Figure 2) .Table 3 analyse univariée du aux maladies survie sans cancer gastrique
Paramètre
survie sans maladie, P valeura
Âge
< 59 vs ≥59
0,031
de Genre Homme vs 0,433
CEA ARNm
femelle (+) par rapport à (-)
0,001
Sérum CEA
(+) par rapport à (-)
0,045
Le grade histologique
Well /modérément vs mal
0,022
pT
pTis /pT1 vs. pT2 /pT3 /pT4
< 0,001
pN
(+) par rapport à (-)
0,001
Stage
1/2 contre 3/4
< 0,001 agents de chimiothérapie
adjuvant
CAPOX vs. mFOLFOX6 vs. Taxol + DDP vs. Taxol + 5FU /CF
0,850
un test log-rank
Tableau 4 L'analyse multivariée de la survie sans maladie dans le carcinome gastrique
Facteurs

Caractéristiques
rapport de danger
95% CI
P value

Unfavorable

Favorable

Age
≥59
<59
1.018
0.986-1.050
0.273
Histological grade
Poorly
Well/moderately
0.412
0.171-0.990
0.047
pT
2/3/4
Tis/1
1.673
0.100-8.690
0.947
pN
(+)
(-)
2.030
0.264-15.611
0.497
Stage
3/4
½
1.437
0.124-16.613
0.771
CEA ARNm
(+)
(-)
2.243
1,138 à 4,424
0,020
Sérum CEA
(+)
(-)
1.130
0,582 à 2,194
0,717
CI, intervalle de confiance; pT, la profondeur de l'invasion tumorale
Figure 2 survie sans maladie des patients selon l'expression de l'ARNm CEA. la survie sans maladie à trois ans des patients ARNm-positifs CEA était significativement inférieur à celui du CEA patients ARNm-négatifs (43,9% contre 74,1%, respectivement; P
= 0,001).
Discussion
La demi nature -quantitative de la technologie PCR traditionnelle a rendu difficile de différencier les niveaux d'expression des gènes de base dans les tissus normaux de l'augmentation des niveaux d'expression des gènes dans le cancer, augmentant ainsi le souci de résultats faussement positifs [17]. Dans notre étude, PCR en temps réel du CEA ARNm a été utilisé pour étudier la possibilité de sang périphérique comme source pour la détection de la CCT et la prédiction de la récidive du cancer chez les patients atteints de carcinome gastrique. En temps réel l'analyse quantitative CEA ARNm chez les patients cancéreux est souvent effectuée sur la base CEA ARNm positivité, qui est déterminée en utilisant un niveau de coupure [13]. CEA ARNm peut être détecté chez les patients atteints d'une maladie bénigne, ainsi que des volontaires sains, de sorte que les niveaux de coupure sont généralement déterminée par l'expression maximale chez les patients non malignes [18, 19]. Setoyama T et al. a constaté que la valeur maximale de l'ARNm CEA chez des patients sans malignité était de 8,6, ils sont donc fixé la valeur de coupure que 9,0 [20]. Schuster R et al. [21] ont également utilisé la valeur maximale de fond volontaire sain que la valeur de coupure pour la détection de l'ARNm CEA chez les patients atteints d'un cancer colorectal. Dans notre étude, nous avons également utilisé la valeur maximale de correction Le score CEA ARNm chez les patients sans malignité comme la valeur de coupure. En établissant une valeur de coupure de 100 pour les niveaux CEA ARNm normalisés, on peut distinguer les patients cancéreux de patients non cancéreux et, par conséquent, envisager avec plus de confiance l'expression de CEA ARNm comme un marqueur de cellules tumorales circulantes.
Nous avons constaté que 10 les patients atteints de tumeur T1, 6 patients ont eu une expression positive CEA-ARNm. Mais aucune trace de récidive n'a été trouvée dans les 10 patients. Il semble qu'il n'y a pas de relation entre l'expression de l'ARNm CEA et la récurrence en T1 tumeur. Il est difficile d'expliquer le taux positif élevé de CEA-ARNm chez les patients T1, mais nous avons trouvé que l'expression de l'ARNm CEA était faible chez les patients T1 6, allant de 4320 exemplaires à 44 600 exemplaires. Ikeguchi M [22] a rapporté que 12,5% de la phase I patients de carcinome gastrique exprimé CK20 ARNm et ils considéré qu'il a été induite par une petite expression de CK20 dans les globules blancs périphériques.
Peu de rapports ont évalué l'état de CTCs dans l'estomac les patients atteints de carcinome avant le traitement. Ikeguchi et Kaibara rapportés [23] qu'ils ne pouvaient pas trouver toutes les cellules cancéreuses dans le sang périphérique de patients atteints de carcinome gastrique non traitées. Les auteurs ont émis l'hypothèse que les cellules cancéreuses ne semblent pas migrer facilement vers le sang périphérique à partir de tumeurs primaires chez les patients atteints d'un carcinome gastrique non traité. En revanche, Miyazono et al.
[24] ont montré que le taux positif pour le CEA ARNm des patients atteints de carcinome gastrique était de 8,8% avant l'opération. La présence de CTC avant le traitement et de sa relation avec le résultat clinique reste donc controversée. Dans cette étude, nous avons évalué la signification clinique de CTCs dans le sang avant l'opération à l'aide en temps réel RT-PCR pour détecter l'expression de l'ARNm de CEA. Le taux positif de CEA ARNm avant tout traitement est de 36,6%. Fichier supplémentaire 1 montre le taux positif de marqueurs d'ARNm de la littérature pour la détection de cellules tumorales par temps réel RT-PCR.
O'Sullivan et al.
[25] ont suggéré que la détection préopératoire des micrométastases peut refléter soit transitoire l'excrétion des cellules, le potentiel métastatique, ou d'une maladie résiduelle. Dans la présente étude, nous avons constaté que les CTC ont été détectés dans le sang avant le traitement par rapport à la récidive. Plusieurs rapports ont montré que la détection préopératoire des cellules cancéreuses circulantes était un marqueur évident de survie pauvre malade, parce que de nombreux cas avec cellules cancéreuses circulantes préopératoire ont montré soit étendu métastase ganglionnaire ou métastases à distance, ainsi le pronostic de ces patients était pauvre [26-28 ]. Dans l'étude actuelle, nous avons constaté que l'expression de l'ARNm de CEA était significativement associée à une récidive de la maladie. En outre, les patients atteints de positif CEA ARNm avaient plus court de 3 ans issue de la survie sans maladie. L'incidence de la récidive était significativement plus élevée chez les patients positifs pour le CEA ARNm que dans ceux négatifs.
La sensibilité de l'expression de l'ARNm CEA pour prédire la récidive est seulement de 56,8%. Dix-neuf des soixante-dix-huit patients (24,4%) avec négatif expression CEA ARNm avait une récidive tumorale. Setoyama et al.
[20] a montré que 8 sur 69 (11,6%) patients atteints de cancer de l'œsophage avec négative expression CEA ARNm ont une rechute de la tumeur, et 6 patients ont eu récidive ganglionnaire. Une explication fréquemment utilisé de l'échec de détection est que les cellules circulantes ne sont pas distribuées de manière homogène et non en continu versé en circulation [29, 30]. En outre, le marqueur idéal (pas d'expression illégitime dans le sang, une forte expression dans les cellules tumorales) n'a pas encore été trouvé. Au-delà de l'ACE de l'ARNm, d'autres transcrits, y compris la cytokératine (CA) 18 [31], la métalloprotéinase matricielle (MMP) -7 [32], CK 20 [33], l'urokinase de type récepteur de l'activateur du plasminogène (uPAR), CK 19 et CK 7 [ ,,,0],34], ont été jugés comme des marqueurs potentiels de CTCs. Cependant, le hangar de cellules tumorales doit être un événement relativement rare. Ainsi, si le sang périphérique est un compartiment adapté pour la détection précoce des micrométastases est encore controversée. D'autres compartiments tels que la moelle osseuse ou de la cavité abdominale sont connus pour fournir des taux de détection plus élevés, probablement en raison d'un plus grand nombre de cellules tumorales présentes [35-37].
Une autre question importante est l'expression faux positif du CEA ARNm. Vingt patients (44,4%) qui ont eu l'expression d'ARNm CEA positif n'a pas enregistré la récidive dans le suivi. L'une des raisons peut être la période de suivi relativement court.
Sinon, cela peut être tout à fait raisonnable, car quelques cellules de carcinome versées dans la circulation sanguine parviennent à établir une maladie métastatique [25]. Ces cellules cancéreuses circulantes pourraient ne pas attacher à des organes éloignés et peuvent ne pas se développer. Récemment, Méhes et al.
[38] ont étudié la morphologie des cellules cancéreuses circulantes et a constaté que la majorité des cellules circulantes de cancer du sein était dans un état de l'apoptose. Dans le sang périphérique des patients atteints de cancer, l'existence du complexe cellulaire des lymphocytes tumeur a été observée [39]. Ces résultats indiquent que les macrophages ou les lymphocytes peuvent jouer un rôle important dans l'induction de l'apoptose des cellules circulantes de la tumeur et la réponse immunitaire anti-tumorale de l'hôte. Ces macrophages immunisées peuvent sensibiliser les lymphocytes de l'hôte T cytotoxiques et les lymphocytes T sensibilisés peuvent attaquer les lésions cancéreuses micrométastasiques résiduelles des patients [23]. Pour clarifier cette hypothèse, d'autres enquêtes sur la corrélation entre l'existence de cellules cancéreuses circulantes et la réponse immunitaire de l'hôte sont nécessaires.
L'étude actuelle était une analyse rétrospective, et les patients qui doivent recevoir une chimiothérapie adjuvante ne sont pas mis à l'avance. En général, les patients qui avaient des ganglions lymphatiques positifs ont été recommandées pour recevoir une chimiothérapie adjuvante. Jusqu'à présent, il n'y a pas de critères standard pour la chimiothérapie adjuvante du cancer gastrique en Chine. Notre étude a montré que le nombre de copies d'ARNm CEA dans le sang périphérique au moment du diagnostic initial était significativement associée à la récidive de la maladie chez les patients atteints d'adénocarcinome gastrique. Dans le point de vue de la récidive, nous suggérons donc que les patients qui ont une expression positive CEA ARNm reçoivent préopératoire chimiothérapie adjuvante après résection radicale
. Conclusions
Dans cette étude, la sensibilité du CEA ARNm a été supérieure à celle du CEA sérique. En outre, selon l'analyse de régression multivariée, CEA ARNm positivité était un facteur indépendant de récidive. L'étude actuelle a confirmé qu'une telle méthode était prometteuse pour la détection précoce des CTC chez les patients atteints d'un carcinome gastrique avant le traitement; les patients atteints de positif CEA ARNm peuvent avoir un risque plus élevé de récidive, même après résection curative. Cependant, une grande étude prospective randomisée est justifiée pour définir le rôle du CEA ARNm de détection dans le sang
abréviations
RT-PCR.
Transcriptase inverse-Polymerase Chain Reaction

CTCs:
cellules tumorales circulantes
CEA:
antigène carcinoembryonnaire
CA19-9:
Glucides Antigen 19-9
TNM:
Tumor-Node-Metastasis
AJCC:
American Joint Committee on Cancer
GAPDH:
glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase
MMP-7:
Matrix Metalloproteinase-7


uPAR:. de type urokinase
Plasminogen Activator Receptor
Déclarations Remerciements
Ce travail a été financé par le national Natural science Foundation de Chine subvention 30672408, Guangzhou Bureau de la science et de la technologie accorde 2006Z3-E0041 et Sun Yat-sen University 985 Fonds Initiation Programme (Chine). Nous remercions chaleureusement les membres du personnel du Département d'oncologie médicale et GI chirurgie oncologie au Cancer Center Université Sun Yat-sen pour leur suggestion et de l'assistance
matériel supplémentaire électronique
12967_2009_529_MOESM1_ESM.DOC fichiers supplémentaires 1. Les données de la littérature pour la détection des cellules tumorales en temps réel RT-PCR de l'ARNm des marqueurs. Elle montre que le taux positif de marqueurs d'ARNm à partir de la littérature pour la détection de cellules tumorales en temps réel RT-PCR. (DOC 58 Ko) Auteurs de fichiers originaux soumis pour les images
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