Påvisning af carcinoembryonisk antigen messenger RNA i blod ved brug af kvantitativ real-time revers transkriptase-polymerasekædereaktion at forudsige gentagelse af gastrisk adenocarcinom

Påvisning af carcinoembryonisk antigen messenger RNA i blod ved brug af kvantitativ real-time revers transkriptase-polymerasekædereaktion at forudsige gentagelse af gastrisk adenocarcinom
Abstract
Baggrund
Eksistensen af ​​cirkulerende tumorceller (CTCs) i perifert blod som en indikator for tumor tilbagefald er ikke blevet klart fastlagt, især for gastrisk kræftpatienter. Vi har udført en retrospektiv analyse af forholdet mellem CTCs i perifert blod ved første diagnosticering og clinicopathologic fund hos patienter med gastrisk karcinom.
Metoder
Blodprøver blev opnået fra 123 gastrisk karcinom patienter ved første diagnosticering. mRNA blev ekstraheret og amplificeret i carcinoembryonisk antigen (CEA) mRNA detektion ved hjælp af real-time RT-PCR. Periodiske 3-måneders opfølgende undersøgelser omfattede serum CEA målinger og billeddannelse.
Resultater
minimumsgrænse for korrigeret CEA mRNA score [(CEA mRNA /GAPDH mRNA) × 10 6] blev sat til 100. femogfyrre af 123 patienter (36,6%) var positive for CEA mRNA-ekspression. CEA mRNA-ekspression signifikant korreleret med T scenen og postoperative gentagelse status (P
= 0,001). Tilbagevendende sygdom blev fundet i 44 ud af 123 tilfælde (35,8%), og 25 af disse (56,8%) var positive for CEA mRNA. Af disse patienter CEA mRNA var mere følsomme end serum CEA i angivelse gentagelser. Tre års sygdomsfri overlevelse for patienter positive for CEA mRNA var signifikant dårligere end patienter negative for CEA mRNA (P
< 0,001). Kun histologiske kvalitet og CEA mRNA positivitet var uafhængige faktorer for sygdomsfri overlevelse ved hjælp multivariat analyse.
Konklusioner
CEA mRNA kopi nummer i perifert blod ved første diagnosticering var signifikant associeret med tilbagefald i gastrisk adenocarcinom patienter. Real-time RT-PCR påvisning af CEA mRNA niveauer ved første diagnose synes at være en lovende indikator for tilbagefald i gastrisk adenocarcinom patienter.
Baggrund
mavekræft forblev den førende dødsårsag kræft på verdensplan i hele det 20. århundrede. Den eneste dokumenterede helbredende behandling er kirurgisk resektion af alle grove og mikroskopiske læsioner. Men trods undergår helbredende gastrektomi, herunder udvidet lymfeknude dissektion og adjuverende kemoterapi, kræft opstår igen, både regionalt og fjerne steder i størstedelen af ​​patienterne [1]. Diagnose af tilbagefald med fælles opfølgning protokoller normalt er lavet på et sent tidspunkt, hvilket, i et omfang, udelukker muligheden for effektiv behandling [2]. Overvågning af cirkulerende tumorceller (CTCs) synes at tilbyde større mulighed for tidligere diagnosticering af tilbagevendende sygdom.
Begrebet undersøge metastatiske proces i perifert blod opstod i det 19. århundrede, da T.R. Ashworth først beskrevet fænomenet CTCs, og S. Paget hypotese et ikke-tilfældigt mønster af cancer metastasization (den "frø og jord 'teori) [3, 4]. Efterfølgende blev den maligne karakter af CTCs bekræftet ved at påvise, de besidder tumorspecifikke kromosomafvigelser [5, 6], og at de vokser ex vivo som cellelinier med en malign fænotype [7]. Flere tilgange til påvisning CTCs er blevet beskrevet og kan klassificeres i PCR-baserede fremgangsmåder og cytometriske metoder [8].
Med fremkomsten af ​​kvantitativ real-time PCR-teknikker [9], præcis kvantificering af en målsekvens er blevet mulig . Kvantitativ PCR giver efterforskerne ikke kun med tekniske fordele, men også med applikativ fordele, såsom definitionen af ​​cutoff-værdier angiver mRNA ekspressionsniveauer af klinisk relevans i kræftpatienter sammenlignet med raske forsøgspersoner. Real-time PCR giver også muligheder for at korrelere target-sekvens belastning med kliniske resultater [10] eller respons på terapi [11].
CEA, oprindeligt beskrevet som et tumorassocieret coloncancer antigen, blev klonet i 1987 og er nu anerkendt som et medlem af immunglobulin proteinsuperfamilien [12]. Mange undersøgelser har rapporteret påvisning af gastriske celler i blod [13], knoglemarv [14], og peritoneal vask [15] af mavecancerpatienter ved hjælp af real-time PCR for CEA mRNA.
Målet med denne undersøgelse var at vurdere effektiviteten af ​​CEA mRNA realtids-PCR-teknik til tidlig påvisning af tumor tilbagefald. For at opfylde dette mål, forholdet mellem klinisk recidiv og blodets indhold af CEA mRNA præoperativt blev undersøgt i gastrisk adenocarcinom patienter.
Metoder
Patienter
Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra enhver patient om brug af blodprøver til forskning i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer vores hospital. Mellem februar 2002 og december 2006 blev i alt 123 konsekutive patienter med gastrisk adenocarcinom på Cancer Center of Sun Yat-sen University indskrevet i denne undersøgelse. Alle patienter fik radikal resektion og D2 lymphadenectomy. Ved lejemål var til rådighed til påvisning 15 lymfeknuder. Ingen peritoneal udbredelse blev fundet. Klare registreringer af serum CEA forandring og billedbehandling evaluering før operationen og hver tredje måned efter operationen var påkrævet. Patienter, som havde positiv lymfeknude blev anbefalet at modtage adjuverende kemoterapi, men til sidst kun treogfirs patienter gennemgik adjuverende kemoterapi. De regimer inkluderet CAPOX (Capecitabine + Oxaliplatin, 16 tilfælde, med en median cyklus på 4), folfox6 (56 tilfælde, med en median cyklus af 6), taxol + cisplatin (4 tilfælde, med en median cyklus på 4), taxol + 5FU /CF (fluorouracil /Leucovorin, 7 sager, med en median cyklus af 6). Tilbagevendende sygdom, herunder lokale tilbagefald og fjernmetastaser, blev opdaget af computertomografi undersøgelse. Nye læsioner påvist ved billeddiagnostisk undersøgelse i opfølgning udnævnelser blev betragtet som en gentagelse. Biopsi blev ikke gjort rutinemæssigt at bestemme histologisk gentagelse. Alle billeddannelse blev evalueret ved mindst to uafhængige observatører, herunder radiologer. Den mediane opfølgningsperiode var 37,0 måneder (interval, 3.0-73.6 måneder).
Blodprøver
Blodprøver blev indsamlet ved første diagnosticering en eller to dage før operationen. De første 3 ml blod blev kasseret for at forhindre epidermal kontaminering, og derefter en blodprøve 5-ml blev opnået fra det perifere vene. Perifere blodprøver opnået fra 30 ikke-kræftpatienter frivillige blev anvendt som negative kontroller
Alle patienter skal skriftligt informeret samtykke.; vi opnåede separat samtykke til anvendelse af blodprøven. Undersøgelse godkendelse blev opnået fra uafhængige etiske udvalg på Cancer Center of Sun Yat-Sen University. Undersøgelsen blev gennemført i overensstemmelse med de etiske standarder af World Medical Association Helsinki Deklarationen.
Pre-behandling af blodprøver
Blodprøver blev opsamlet i EDTA-holdige rør. Prøve behandling blev udført inden for 2 timer efter blod tilbagetrækning. Blod blev overført til en 30-ml Falcon-rør og centrifugeret ved 1.800 rpm ved stuetemperatur i 20 minutter. Serum blev fjernet, og cellerne blev resuspenderet i 5 ml saltvand og 0,3 ml RNA senere løsning. Efter grundig blanding blev blodlegemer blandingen holdes natten over ved 4 ° C og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse.
RNA-ekstraktion og cDNA-syntese
Totalt RNA fra perifere blodprøver blev ekstraheret under anvendelse RNAprep Cell Kit (Tiangen , Beijing, Kina) efter protokollen tilvejebragt af producenten. RNA integritet blev kontrolleret ved elektroforese og kvantificeret ved absorption ved 260 og 280 nm ved anvendelse af en UV-synlig spektrofotometer (Beckman Coulter Du ® 800, Fullerton, CA). Til revers transkription, 1 ug af total RNA, 1 pi oligo (dT) 15 og 1 pi dNTP blev fortyndet i 10 pi RNase-frit vand, inkuberes 10 minutter ved 37 ° C og 1 pi 25 mmol /l EDTA blev tilsat. En 11 pi alikvot af reaktionsblandingen blev inkuberet i 10 minutter ved 65 ° C og hurtigt afkølet på is i 2 minutter. cDNA blev lagret ved -80 ° C indtil anvendelse. cDNA-syntese blev udført under anvendelse af TIANScript M-MLV-fremgangsmåden (Tiangen Biotech, Beijing, Kina). Salg Cellelinjer
at forberede CEA-specifikke RT-PCR, to cellelinjer, SW-480 (coloncancercellelinie ) og SC-7901 (gastrisk cancercellelinie) blev anvendt. Lymfocytter blev indsamlet fra raske frivillige uden epitel malignitet. Efter lymfocytter blev isoleret fra perifert blod ved gradient centrifugering blev mononukleære cellelag opsamlet. Cellelinier blev serielt fortyndet (10 gange) i 2 x 10 7 Hvis til 5 x 10 7 lymfocytter at give carcinoma celle: lymfocyt-forhold spænder fra 1:10 til 1:10 7.
CEA mRNA Analyse af Real-Time kvantitativ PCR
Kvantitativ PCR blev udført ved hjælp af Sequence Detector System, ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System). PCR-primere og TaqMan prober blev konstrueret under anvendelse af primeren Express 1.0 software program. I dette assay blev husholdning genet glyceraldehyd 3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) anvendt som en intern kontrol for at normalisere variationer i integritet og det samlede RNA ekstraheret. De real-time PCR assays for GAPDH og CEA blev udført i separate rør. CEA mRNA værdier blev justeret mod GAPDH mRNA værdier, og de relative CEA mRNA scoringer blev præsenteret som (CEA mRNA /GAPDH mRNA) × 10 6 for hver prøve.
5 pi af prøven cDNA blev anvendt til real- time PCR i en reaktionsblanding 20 pi bestående af 10 pmol passende primere (Invitrogen samarbejde, Japan) og 5 pmol TaqMan probe (Invitrogen samarbejde, Japan). Reporter-farvestof (6-carboxy-fluorescein: FAM) blev kovalent bundet til 5'-enden af ​​proben, og quencher farvestof (6-carboxy-tetramethyl-rhodamin: TAMRA) blev bundet til 3'-enden af ​​proben. Temperaturprofilen anvendes til amplifikation var som følger: denaturering i 1 cyklus ved 95 ° C i 10 minutter efterfulgt af 40 cyklusser ved 95 ° C i 10 sekunder, 60 ° C i 15 sekunder og 72 ° C i 5 sekunder. Kvantificering blev udført ved ABI Prism 7500 Sequence detektorsystem. Hvert sæt af prøver og serielt-fortyndede eksterne kontroller blev opformeret i to eksemplarer. Den gennemsnitlige værdi af de dubletter blev brugt som den kvantitative værdi.
En CEA-specifik oligonucleotidprimer er designet baseret på rapporten af ​​Gerhard et al.
[16]. Sekvenserne var: 5'-TGTCGGCATCATGATTGG-3 '(sense) og 5'-GCAAATGCTTTAAGGAAGAAGC-3' (antisense). Fluorescerende og LC-Red probesekvenser anvendt til CEA identifikation var: 5'-CCTGAAATGAAGAAACTACACCAGGGC-fluorescein og 5'-LC-Red 640-GCTATATCAGAGCAACCCCAACCAGC-phosphat
Real-time PCR overvågning blev opnået ved måling af fluorescenssignalet ved udgangen. af annealing fase af hver cyklus. Primersekvenserne anvendt til GAPDH-amplifikation var: 5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3 '(sense) og 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' (antisense). Probesekvenserne anvendt til GAPDH identifikation var: 5'-TCAACAGCGACACCCACTCCT-fluorescein og 5'-LC-Red 640-CACCTTTGACGCTGGGGCT-phosphat
Bestemmelse af CEA i serumprøver
Præoperative serumprøver blev også anvendt til analyse. tumormarkør CEA ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt enzym immunoassay kit (Cobas Core EIA, Roche, Basel, Schweiz). . Patologisk cutoff-niveauet blev fastsat til 5 ng /ml for serum CEA
Statistiske analyser
Kaplan-Meier statistisk metode blev anvendt til analyse af kliniske træk og gentagelse; forskelle blev anslået med log-rank test. Prognostiske faktorer blev undersøgt ved univariate og multivariate analyser (log-rank test for univariat analyse og Cox proportionel risiko regressions model, baglæns trinvis (betinget LR) for multivariat analyse). Chi square og Fisher eksakte test blev anvendt til statistisk analyse. Alle statistiske analyser blev udført med SPSS16.0. . Alle P-værdier var 2-tailed, og niveauet af signifikans blev fastsat til 0,05
Resultater
Kliniske funktioner
Den 123 patienter deltog i undersøgelsen i alderen 28 til 84 år (betyder, 57.11 år median, 59 år), og forholdet mellem hanner til hunner var 82:41 (tabel 1). Iscenesættelse blev udført i overensstemmelse med Tumor-Node-Metastase (TNM) klassificering af amerikanske Blandede Cancer (AJCC, ajourført 1997). Fireogtyve tumorer blev placeret i Cardia, 3 i det gastriske fundus, 44 i det gastriske corpus, 45 i det gastriske antrum, 5 involverede hele mave, og 2 tilhørte rest gastrisk karcinom (tabel 1) .table 1 Clinicopathologic funktioner og CEA * mRNA-ekspression påvises ved real-time RT-PCR
egenskaber
Samlet antal
(N = 123)

CEA mRNA
P-værdi
Positiv
(n = 45)
Negativ
(n = 78)

Alder
≤40
13
3
10
41-50
20
9
11
51-60
39
9
30
61-70
42
18
24
> 70
9
6
3
0,063
Sex
Female
41
12
29
Mand
82
33
49
0,234
Tumor
T1
10
6
4
T2
16
3
13
T3
73
26
47
T4
24
10
14
0.001
Lymfeknude
n0
31
11
20
N1
43
15
28
N2
29
8
21
N3
20
11
9
0,261
Patologisk TNM # etape
jeg
16
7
9
II
21
6
15
III
51
17
34
IV
35
15
20
0,623
Histologi undertype
Nå differentieret adenocarcinom
3
1
2
Moderat differentieret adenocarcinom
27
7
20
Dårligt 93
37
56
0,418
Serum CEA tilstand differentieret adenocarcinom
Positiv
30
11
19
Negativ
93
34
59
0,992
Gentagelse
Ja
44
25
19
Ingen
79
20
59
0.001 Salg Modes af tilbagefald
Local gentagelse
8
4
4
bughulen
9
6
3
Lever
8
5
3
bækken
6
3
3
Flere steder i 10
5
5
andre
3 fotos 2
1
0,959
* Carcinoembryonalt antigen
# TNM betegner tumor-node-metastaser
Registreringsfølsomhed af CEA mRNA ved real-time RT-PCR
CEA mRNA blev påvist i SW -480 og SC-7901 cellelinier. Den nedre detektionsgrænse var en koncentration på 10 tumorceller pr 10 7-lymfocytter. Konventionel nested RT-PCR blev anvendt til at bekræfte følsomheden af ​​RT-PCR-produktet.
CEA mRNA-ekspression i blod
CEA mRNA-ekspression blev påvist i 9 af 30 (30,0%) ikke-cancerpatienter, og middelværdien korrigeret CEA mRNA score var 7,5 (interval, 0-92,5). Den maksimale værdi af korrigerede CEA mRNA score hos patienter uden malignitet var 92,5, så en afskæringsværdi på 100 blev anvendt i den foreliggende undersøgelse. Brug af denne cutoff-værdien, blev 45 patienter (36,6%) diagnosticeret som CEA mRNA-positive. Den gennemsnitlige korrigerede CEA mRNA score [(CEA mRNA /GAPDH mRNA) × 10 6] af de 123 patienter var 37,510.0 (range, 0-3,695,652.1) kopier Figur 1 viste fordelingen af ​​(CEA mRNA /GAPDH mRNA) × 10 6 i denne gruppe patienter. Figur 1 Fordelingen af ​​CEA ekspressionsniveau. Ratio midler (CEA mRNA /GAPDH mRNA) × 106. I betragtning af forholdet mellem nogle patienter blev nul, vi sat 0,5 til forholdet.
Forholdet mellem CEA mRNA ekspression og clinicopathologic funktioner
CEA mRNA-ekspression ikke korrelerer med alder, køn, N stadium, TNM stadie, histologisk undertype og serum CEA tilstand (tabel 1). Men patienter med postoperative gentagelse havde signifikant højere procentdel af CEA mRNA positive end dem uden tumortilbagevenden (P
= 0,001) (tabel 1). Desuden tumor dybde også positivt korreleret med CEA mRNA-ekspression (P
= 0,001).
Forholdet mellem gentagelse og CEA mRNA-ekspression samt serum CEA
tilstand for tilbagefald omfatter otte lokalt recidiv, 9 abdominal formidling undtagen lever, 8 levermetastaser, 6 bækken metastase, 3 andre steder metastase og 10 flere steder metastase. Der er ingen signifikant forskel mellem CEA mRNA udtryk og den tilstand af tilbagefald (tabel 1).
Tilbagevendende sygdom blev fundet i 44 ud af 123 sager (35,8%). Femogtyve af disse patienter (56,8%) var CEA mRNA-positive. Derimod kun 14 patienter med tilbagevendende sygdom (31,8%) var positive for præoperativ serum CEA. De særlige forhold i CEA mRNA og serum CEA at angive tilbagefald var 74,7% og 79,9%, hhv. (Tabel 2) .table 2 Sammenligning mellem CEA * mRNA og serum CEA forudsige recidiv

CEA mRNA
Serum CEA

Positive

Negative

Positive

Negative

Recurrence
Yes
25
19
14
30
Ingen
20
59
16
63
P
0,001
0,152
X
2
12,088
2.050
Følsomhed (%)
56,8
31,8
Specificitet (%)
74,7
79,7
* Carcinoembryonalt antigen
univariate og multivariate analyser af 3-års sygdomsfri overlevelse
Det 5-års samlede overlevelse 58,9% og 3-års sygdomsfri overlevelse var 63,9%. Både univariate og multivariate analyser blev anvendt til at evaluere forhold vedrørende sygdomsfri overlevelse. Ifølge univariate analyse, alder, tumor dybde, nodal metastase, blev histologisk klasse, TNM stadie, CEA mRNA positivitet og serum CEA positivitet signifikant relateret til sygdomsfri overlevelse (P
= 0,031, < 0,001, 0,001, 0,022, < 0,001, 0,001, 0,045 henholdsvis) (tabel 3). Multivariat regressionsanalyse viste, at kun histologisk kvalitet og CEA mRNA positivitet var uafhængige faktorer for sygdomsfri overlevelse (P
= 0,047 og 0,020 henholdsvis tabel 4). Tre-årige sygdomsfrie overlevelsesrater for CEA mRNA-positive patienter var signifikant lavere end for CEA mRNA negative patienter (43,9% versus 74,1%, henholdsvis P
= 0,001, figur 2) .table 3 univariat analyse af sygdoms- overlevelse i gastrisk karcinom
Parameter
sygdomsfri overlevelse, P værdiA
Age
< 59 vs. ≥59
0,031
Køn
Mand vs. kvindelig
0,433
CEA mRNA
(+) vs. (-)
0,001
Serum CEA
(+) vs. (-)
0,045
Histologisk klasse
Well /moderat vs. dårligt
0,022
pT
pTis /PT1 vs. pT2 /pT3 /pT4
< 0,001
pN
(+) vs. (-)
0,001
Stage
1/2 vs. 3/4
< 0,001
adjuverende kemoterapi agenter
CAPOX vs. mFOLFOX6 vs. Taxol + DDP vs. Taxol + 5-FU /CF
0.850
en Log-rank test
tabel 4 Multivariate analyse af sygdomsfri overlevelse i gastrisk karcinom
Faktorer

Kendetegn
Hazard ratio
95% CI
P value

Unfavorable

Favorable

Age
≥59
<59
1.018
0.986-1.050
0.273
Histological grade
Poorly
Well/moderately
0.412
0.171-0.990
0.047
pT
2/3/4
Tis/1
1.673
0.100-8.690
0.947
pN
(+)
(-)
2.030
0.264-15.611
0.497
Stage
3/4
½
1.437
0.124-16.613
0.771
CEA mRNA
(+) Hotel (-)
2,243
1,138-4,424
0,020
Serum CEA
(+) Hotel (-)
1,130
0,582-2,194
0,717
CI, konfidensinterval; pT, dybde af tumorinvasion
Figur 2 sygdomsfri overlevelse for patienter i henhold til CEA mRNA-ekspression. Tre års sygdomsfri overlevelse for CEA mRNA-positive patienter var signifikant lavere end for CEA mRNA-negative patienter (43,9% versus 74,1%, henholdsvis; P
= 0,001).
Diskussion
semi -quantitative karakter af traditionel PCR-teknologi har gjort det vanskeligt at skelne baseline genekspressionsniveauer i normale væv fra forøgede genekspressionsniveauer i cancer, hvilket øger bekymring for falsk-positive resultater [17]. I vores undersøgelse blev real-time PCR af CEA mRNA anvendes til at undersøge muligheden for perifert blod som en kilde til CTC påvisning og forudsigelse af cancer tilbagefald i gastrisk carcinom patienter. Real-time kvantitativ CEA mRNA analyse hos kræftpatienter udføres ofte baseret på CEA mRNA positivitet, som bestemmes ved hjælp af en cutoff niveau [13]. CEA mRNA kan detekteres i patienter med benign sygdom samt raske frivillige, så cutoff niveauer er sædvanligvis bestemt ved maksimal ekspression i ikke-maligne patienter [18, 19]. Setoyama T et al. fundet, at den maksimale værdi af CEA mRNA hos patienter uden malignitet var 8,6, de derfor indstille cutoff værdi som 9,0 [20]. Schuster R et al. [21] også brugt den maksimale værdi af raske frivillige baggrund som cut-off værdi for CEA mRNA detektion i patienter med tarmkræft. I vores undersøgelse, vi brugte også den maksimale værdi af korrigeret CEA mRNA score hos patienter uden malignitet som cutoff-værdien. Ved at etablere en afskæringsværdi på 100 for normaliserede CEA mRNA-niveauer, kan vi skelne cancerpatienter fra patienter uden cancer og dermed mere sikkert overveje ekspressionen af ​​CEA mRNA som en markør for cirkulerende tumorceller.
Vi fandt, at 10 patienter med T1 tumor, 6 patienter havde positiv CEA-mRNA-ekspression. Men ingen registrering af tilbagefald blev fundet i de 10 patienter. Det ser ud til, at der ikke er nogen sammenhæng mellem CEA mRNA-ekspression og tilbagefald i T1 tumor. Det er svært at forklare den høje positive rate af CEA-mRNA i T1 patienter, men vi fandt, at CEA mRNA-ekspression var lav i de 6 T1 patienter, der spænder fra 4320 eksemplarer til 44 600 kopier. Ikeguchi M [22] rapporterede, at 12,5% af scenen I gastrisk karcinom patienter udtrykte CK20 mRNA og de mente, at det er fremkaldt ved en lille CK20 udtryk i perifere hvide blodlegemer.
Få rapporter har vurderet tilstanden af ​​CTCs i gastrisk carcinompatienter før behandling. Ikeguchi og Kaibara rapporteret [23], at de ikke kunne finde nogen kræftceller i perifert blod fra ubehandlede gastrisk karcinom patienter. Forfatterne spekuleret, at cancerceller ikke synes at let migrere til det perifere blod fra primære tumorer hos patienter med ubehandlet gastrisk karcinom. Derimod Miyazono et al.
[24] viste, at den positive sats for CEA mRNA af gastrisk karcinom patienter var 8,8% før operation. Tilstedeværelsen af ​​CTCs før behandling og dens forhold til det kliniske resultat er således fortsat kontroversiel. I denne undersøgelse vurderede vi den kliniske betydning af CTCs i blod før operation ved hjælp af real-time RT-PCR til påvisning ekspression af CEA mRNA. Den positive rate af CEA mRNA før nogen behandling er 36,6%. Yderligere fil 1 viser den positive rate af mRNA markører fra litteratur til påvisning af tumorceller ved real-time RT-PCR.
O'Sullivan et al.
[25] foreslog, at præoperativ detektering af mikrometastase kan afspejle enten forbigående udgydelse af celler, metastatisk potentiale eller residual sygdom. I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at CTCs blev påvist i blod før behandling i forhold til tilbagefald. Adskillige rapporter har vist, at præoperativ detektering af cirkulerende cancerceller var en klar markering af dårlig patientoverlevelse, fordi mange tilfælde med cirkulerende kræftceller præoperativt udviste enten forlænget lymfeknudemetastase eller fjernt metastase, således prognosen for disse patienter var dårlig [26-28 ]. I aktuelle undersøgelse fandt vi, at ekspressionen af ​​CEA mRNA var signifikant relateret til recidiv. Endvidere patienter med positiv CEA mRNA havde kortere 3-års sygdomsfri overlevelse resultat. Forekomsten af ​​tilbagefald var signifikant højere hos patienter positive for CEA mRNA end i dem negativt.
Følsomhed CEA mRNA-ekspression til at forudsige gentagelse er kun 56,8%. Nitten af ​​halvfjerds-otte patienter (24,4%) med negativ CEA mRNA-ekspression havde tumor tilbagefald. Setoyama et al.
[20] viste, at 8 af 69 (11,6%) esophageal carcinoma patienter med negativ CEA mRNA-ekspression havde tumor tilbagefald, og 6 patienter havde lymfeknude gentagelse. En hyppigt anvendt forklaring på påvisning fiasko er, at cirkulerende celler ikke homogent fordelt og ikke-tiden afstødes i omløb [29, 30]. Endvidere ideelle markør (ingen illegitim ekspression i blod, høj ekspression i tumorceller) er endnu ikke blevet fundet. Beyond CEA mRNA, andre transkripter, herunder cytokeratin (CA) 18 [31], matrixmetalloproteinase (MMP) -7 [32], CK 20 [33], urokinase-plasminogenaktivator-receptor (uPAR), CK 19 og CK 7 [ ,,,0],34], er blevet forsøgt som potentielle markører for CTCs. Imidlertid bør tumorcellen stald være en relativt sjælden begivenhed. Således, uanset om perifert blod er et egnet rum til tidlig påvisning af micrometastases er stadig kontroversiel. Andre rum såsom knoglemarv eller bughulen er kendt for at give højere afsløring satser, sandsynligvis på grund af et større antal tumorceller til stede [35-37].
Andet vigtigt spørgsmål er falsk positiv ekspression af CEA mRNA. Tyve patienter (44,4%), der havde positiv CEA mRNA-ekspression optog ikke tilbagefald i opfølgningen. En årsag kan være den relativt korte opfølgningsperiode.
Alternativt kan det være helt rimeligt, fordi nogle få carcinomceller kaste ind i blodbanen lykkes oprettelse metastatisk sygdom [25]. Disse cirkulerende kræftceller måske ikke tillægger fjerntliggende organer og måske ikke vokse. For nylig Méhes et al.
[38] undersøgt morfologien af ​​cirkulerende cancerceller og fandt, at størstedelen af ​​cirkulerende brystcancerceller var i en tilstand af apoptose. I det perifere blod af cancerpatienter, blev observeret eksistensen af ​​tumor celle-lymfocyt-kompleks [39]. Disse resultater viser, at makrofager eller lymfocytter kunne spille en vigtig rolle i induktionen af ​​cirkulerende tumorceller apoptose og antitumor immunrespons hos værten. Disse immuniserede makrofager kan sensibilisere de cytotoksiske T-lymfocytter hos værten, og de sensibiliserede T-lymfocytter kan angribe de tilbageværende mikrometastatiske kræft læsioner af patienterne [23]. For at tydeliggøre denne hypotese, yderligere undersøgelser vedrørende sammenhængen mellem eksistensen af ​​cirkulerende kræftceller og værten immunrespons er nødvendige.
Den aktuelle undersøgelse var retrospektiv analyse, og patienter, der skal modtage adjuverende kemoterapi blev ikke indstillet i forvejen. Generelt blev patienter, som havde positiv lymfeknude anbefales at modtage adjuverende kemoterapi. Indtil nu, er der ingen standard kriterier for adjuverende kemoterapi af mavekræft i Kina. Vores undersøgelse viste, at CEA mRNA kopiantal i perifert blod ved første diagnosticering var signifikant associeret med tilbagefald i gastrisk adenocarcinom patienter. I synspunkt for fornyet vi derfor foreslå, at patienter, der har positiv CEA mRNA-ekspression præoperativt modtager adjuverende kemoterapi efter radikal resektion.
Konklusioner
I denne undersøgelse, følsomheden af ​​CEA mRNA var højere end for serum CEA. Ifølge multivariat regressionsanalyse, CEA mRNA positivitet var en uafhængig faktor for tilbagefald. Den nuværende undersøgelse bekræftede, at en sådan metode var lovende for tidlig påvisning af CTCs hos patienter med gastrisk karcinom før behandling; patienter med positiv CEA mRNA kan have en højere risiko for tilbagefald, selv efter kurativ resektion. Men en stor randomiseret prospektivt studie berettiget til at definere den rolle, CEA mRNA detektion i blodet
Forkortelser
RT-PCR:.
Revers transkriptase-polymerasekædereaktion

CTCs:
Cirkulerende tumorceller
CEA:
Carcinoembryonalt Antigen
CA19-9:
Kulhydrat Antigen 19-9
TNM:
Tumor-Node-Metastase
AJCC:
amerikanske Blandede Udvalg om kræft
GAPDH:
Glyceraldehyd 3-phosphat-dehydrogenase
MMP-7:
matrixmetalloproteinase-7


uPAR:.
urokinase-plasminogenaktivator Receptor
erklæringer
Tak
Disse arbejde blev finansieret af National Natural Science Foundation of China tilskud 30672408, Guangzhou Bureau for Videnskab og Teknologi giver 2006Z3-E0041 og Sun Yat-sen University 985 Program Indledning Fund (Kina). Vi takker taknemmeligt medarbejderne i afdelingen for Medicinsk Onkologi og GI kirurgi Onkologi på Sun Yat-sen University Cancer Center for deres forslag og hjælp

• DNA polymeraseη proteinekspression forudsiger behandlingsrespons og overlevelse af metastatisk gastrisk adenocarcinom patienter behandlet med oxaliplatin-baserede chemotherapy
• Effektiviteten af ​​ultralyd i at kontrollere placeringen af ​​en nasogastrisk sonde hos patienter med lavt bevidsthed på en nødsituation center