Detectie van carcino-antigeen boodschapper-RNA in het bloed met behulp van kwantitatieve real-time reverse transcriptase-polymerase-kettingreactie om herhaling van maagdarmkanker voorspellen

Detectie van carcino-antigeen boodschapper-RNA in het bloed met behulp van kwantitatieve real-time reverse transcriptase-polymerase-kettingreactie om herhaling van maagdarmkanker voorspellen
Abstracte achtergrond
Het bestaan ​​van circulerende tumorcellen (CTC's) in het perifere bloed als een indicator terugkeer van de tumor is niet duidelijk vastgesteld, in het bijzonder voor maagkanker patiënten. Voerden we een retrospectieve analyse van de relatie tussen CTCs in perifeer bloed bij de initiële diagnose en Clinicopathologische bevindingen bij patiënten met maagcarcinoom.
Methods
Bloedmonsters werden verkregen van 123 maagcarcinoom patiënten eerste diagnose. mRNA werd geëxtraheerd en geamplificeerd voor carcino-embryonaal antigeen (CEA) mRNA detectie middels real-time RT-PCR. Periodieke 3 maanden follow-up onderzoek opgenomen serum CEA metingen en beeldvorming.
Resultaten
De minimumdrempel voor gecorrigeerd CEA mRNA scoren [(CEA mRNA /GAPDH mRNA) × 10 6] is vastgesteld op 100. vijfenveertig van 123 patiënten (36,6%) waren positief voor CEA mRNA expressie. CEA mRNA expressie significant gecorreleerd met T-stadium en postoperatieve herhaling status van (P
= 0,001). Terugkerende ziekte werd gevonden in 44 van 123 gevallen (35,8%) en 25 van deze (56,8%) waren positief voor CEA mRNA. Van deze patiënten CEA mRNA gevoeliger dan serum CEA in herhaling aangeeft. Drie-jaars ziektevrije overleving van patiënten positief voor CEA mRNA was significant slechter dan van de patiënten negatief voor CEA mRNA (P Restaurant < 0,001). Alleen histologische graad en CEA mRNA positiviteit waren onafhankelijke factoren voor ziektevrije overleving met behulp van multivariate analyse.
Conclusies
CEA mRNA aantal kopieën in het perifere bloed bij de eerste diagnose was significant geassocieerd met de ziekte recidief bij adenocarcinoom van de maag patiënten. Real-time RT-PCR detectie van CEA mRNA-niveaus bij de initiële diagnose lijkt een veelbelovende voorspeller voor de ziekte van recidief bij adenocarcinoom van de maag patiënten. Achtergrond
Maagkanker bleef de belangrijkste oorzaak van kankersterfte in de wereld in de 20e eeuw. De enige bewezen curatieve behandeling is chirurgische resectie van alle grove en microscopische laesies. Echter, ondanks curatieve gastrectomy, inclusief uitgebreide lymfeklierdissectie en adjuvante chemotherapie ondergaan, kanker terugkeert in zowel regionaal als verre sites in de meerderheid van de patiënten [1]. Diagnose van recidief met gemeenschappelijke follow-up protocollen meestal gemaakt in een laat stadium, die, tot op zekere hoogte, verzet zich tegen de mogelijkheid van een effectieve behandeling [2]. Surveillance van circulerende tumorcellen (CTC's) lijkt grotere mogelijkheid voor eerdere diagnose van recidiverende ziekte te bieden.
Het concept van het onderzoek naar de metastatische proces in het perifere bloed is ontstaan ​​in de 19e eeuw, toen T.R. Ashworth beschreven eerste het fenomeen van de CTC, en S. Paget hypothese een niet-willekeurig patroon van kanker metastasering (het 'zaad en bodem' theorie) [3, 4]. Vervolgens worden de kwaadaardige aard van CTCs werd bevestigd door aan te tonen dat zij over tumor-specifieke chromosomale afwijkingen [5, 6] en dat zij ex vivo groeien cellijnen met een maligne fenotype [7]. Verschillende benaderingen CTCs detecteren zijn beschreven en kunnen worden onderverdeeld in PCR-gebaseerde werkwijzen en cytometrische methoden [8].
Met de komst van kwantitatieve real-time PCR-technieken [9], nauwkeurige kwantificering van een doelsequentie mogelijk geworden . Kwantitatieve PCR biedt onderzoekers niet alleen technische voordelen, maar ook met applicatieve voordelen, zoals de definitie van cutoff waarden aangeeft mRNA expressie klinisch relevant bij kankerpatiënten vergeleken met gezonde personen. Real-time PCR biedt ook mogelijkheden correleren doelwitspecifieke sequentie lading met klinische uitkomst [10] of respons op therapie [11].
CEA, oorspronkelijk beschreven als een tumor-geassocieerd antigen colonkanker, werd gekloneerd in 1987 en is nu erkend als een lid van de immunoglobuline superfamilie eiwitten [12]. Veel studies hebben gemeld detectie van maag cellen in bloed [13], beenmerg [14] en peritoneaal wassen [15] van gastrische kankerpatiënten met behulp van real-time PCR voor CEA mRNA. Ondernemingen De doelstelling van deze studie was evalueren van de doeltreffendheid van de CEA mRNA real-time PCR-techniek voor het vroegtijdig detecteren van tumorherval. Om dit doel te bereiken, de relatie tussen klinische recidief en bloedspiegels van CEA mRNA in preoperatief adenocarcinoom patiënten onderzocht.

Werkwijzen Patiënten
Schriftelijke toestemming werd verkregen van elke patiënt op het gebruik van bloedmonsters voor onderzoek in overeenstemming met de institutionele richtlijnen van ons ziekenhuis. Tussen februari 2002 en december 2006 een totaal van 123 opeenvolgende patiënten met adenocarcinoom van de maag op Cancer Center van Sun Yat-sen Universiteit werden opgenomen in deze studie. Alle patiënten kregen radicale resectie en D2 lymphadenectomy. Bij lease waren 15 lymfeklieren beschikbaar voor de detectie. Geen peritoneale verspreiding gevonden. Duidelijke gegevens serum CEA veranderingen en beeldvorming vóór de operatie en elke drie maanden na de operatie nodig waren. Patiënten die een positieve lymfklier hadden werden aangeraden om adjuvante chemotherapie ontvangen, maar uiteindelijk slechts drieëntachtig patiënten onderging adjuvante chemotherapie. De regimes opgenomen CAPOX (capecitabine + Oxaliplatin, 16 gevallen, met een mediane cyclus van 4), folfox6 (56 gevallen, met een mediane cyclus van 6), taxol + cisplatine (4 gevallen, met een mediane cyclus van 4), taxol + 5FU /CF (Fluorouracil /Leucovorin, 7 gevallen met een gemiddelde cyclus van 6). Terugkerende ziekte, met inbegrip van lokaal recidief en metastasen op afstand, werd ontdekt door computertomografie onderzoek. Nieuwe letsels door imaging onderzoek ontdekt in de follow-up afspraken werden beschouwd als herhaling. Biopsie werd niet routinematig gedaan om histologische herhaling te bepalen. Alle beeldvorming werd geëvalueerd door ten minste twee onafhankelijke waarnemers, waaronder radiologen. De mediane follow-up periode was 37,0 maanden (range, 3,0-73,6 maanden) Bloedmonsters
.
Bloedmonsters werden verzameld bij de eerste diagnose een of twee dagen voor de operatie. De eerste 3 ml bloed werd weggegooid epidermale besmetting te voorkomen, en vervolgens werd een 5 ml bloedmonster verkregen uit het perifere ader. Perifere bloedmonsters verkregen van 30 niet-kankerpatiënt vrijwilligers werden gebruikt als negatieve controles
Alle patiënten gaven schriftelijk toestemming.; we verkregen afzonderlijk toestemming voor het gebruik van bloedmonster. Studie goedkeuring werd verkregen van onafhankelijke ethische commissies op Cancer Center van Sun Yat-Sen University. De studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de ethische normen van de World Medical Association Verklaring van Helsinki.
Pre-processing van bloedmonsters
Bloedmonsters werden in EDTA-bevattende buizen verzameld. Monster verwerking werd uitgevoerd binnen 2 uur na bloedafname. Het bloed werd overgebracht in een 30 ml Falcon-buis en gecentrifugeerd bij 1800 rpm bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Serum werd verwijderd en cellen werden geresuspendeerd in 5 ml zoutoplossing en 0,3 ml RNA later oplossing. Na goed mengen werd de bloedcel mengsel overnacht bij 4 ° C bewaard en opgeslagen bij -80 ° C tot gebruik.
RNA-extractie en cDNA-synthese Totaal RNA
perifere bloedmonsters werd geëxtraheerd met behulp RNAprep cel kit (Tiangen , Beijing, China) volgens het protocol van de fabrikant. RNA integriteit werd gecontroleerd door elektroforese en gekwantificeerd door absorptie bij 260 en 280 nm met een UV-spectrofotometer (Beckman Coulter Du ® 800, Fullerton, CA). Voor reverse transcriptie, 1 ug totaal RNA, 1 pl Oligo (dT) 15 en 1 pl dNTP werden verdund in 10 pi RNase-vrij water, geïncubeerd 10 min bij 37 ° C en 1 pi van 25 mmol /L EDTA werd toegevoegd. Een 11 pi aliquot van het reactiemengsel werd gedurende 10 minuten bij 65 ° C en snel afgekoeld op ijs gedurende 2 minuten. cDNA werd bewaard bij -80 ° C tot gebruik. cDNA-synthese werd uitgevoerd met behulp van de methode TIANScript M-MLV (Tiangen Biotech, Beijing, China).
Cellijnen
Ter voorbereiding op CEA-specifieke RT-PCR, twee cellijnen, SW-480 (colonkanker cellijn ) en SC-7901 (maagkanker cellijn) gebruikt. Lymfocyten werden verzameld van gezonde vrijwilligers zonder epitheliale maligniteit. Na lymfocyten van perifeer bloed werden geïsoleerd door gradiënt centrifugatie werd de mononucleaire cellaag verzameld. Cellijnen werden serieel verdund (10-voudig) in 2 x 10 7 tot 5 x 10 7 lymfocyten carcinoma cell geven: lymfocyt verhoudingen variërend 1:10-01:10 7
CEA mRNA analyse van real-time kwantitatieve PCR
Kwantitatieve PCR werd uitgevoerd met behulp van de Sequence Detector System, ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System). PCR primers en TaqMan probes werden ontworpen met behulp van de Primer Express 1,0 softwareprogramma. In deze test, het huishoudingsgen glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH) als een interne controle op variaties in de integriteit en het totale RNA geëxtraheerd normaliseren. De real-time PCR assays voor GAPDH en CEA werden in afzonderlijke buisjes. CEA mRNA waarden werden gecorrigeerd op GAPDH-mRNA waarden en de relatieve CEA mRNA scores werden voorgesteld als (CEA mRNA /GAPDH mRNA) x 10 6 voor elk monster.
5 pi van het monster cDNA werd gebruikt voor real- time PCR in een 20 pi reactiemengsel bestaande uit 10 pmol geschikte primers (Invitrogen Samenwerking, Japan) en 5 pmol TaqMan sonde (Invitrogen Samenwerking, Japan). De reporter kleurstof (6-carboxy-fluoresceïne: FAM) werd covalent gehecht aan het 5 'uiteinde van de sonde en de quencher kleurstof (6-carboxy-tetramethyl-rhodamine: TAMRA) is bevestigd aan het 3' uiteinde van de probe. Het temperatuurprofiel voor amplificatie was als volgt: denaturatie gedurende 1 cyclus bij 95 ° C gedurende 10 minuten, gevolgd door 40 cycli bij 95 ° C gedurende 10 seconden, 60 ° C gedurende 15 seconden en 72 ° C gedurende 5 seconden. Kwantificering werd uitgevoerd door het ABI Prism 7500 Sequence detectorsysteem. Elke set van monsters en serieel verdunde externe controles werden versterkt in tweevoud. De gemiddelde waarde van de duplicaten werd gebruikt als de kwantitatieve waarde.
Een CEA-specifieke oligonucleotide primer werd ontworpen op basis van het rapport van Gerhard et al.
[16]. De sequenties waren: 5'-TGTCGGCATCATGATTGG-3 '(sense) en 5'-GCAAATGCTTTAAGGAAGAAGC-3' (antisense). Fluorescerende en LC-Red probe sequenties voor identificatie CEA waren: 5'-fluoresceïne-CCTGAAATGAAGAAACTACACCAGGGC en 5'-LC-Red 640-GCTATATCAGAGCAACCCCAACCAGC fosfaat
real-time PCR controle werd bereikt door het meten van het fluorescentiesignaal aan het einde. annealen van elke cyclus. De primer sequenties voor GAPDH amplificatie waren: 5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3 '(sense) en 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' (antisense). De probe sequenties voor identificatie GAPDH waren: 5'-fluoresceïne-TCAACAGCGACACCCACTCCT en 5'-LC-Red 640-CACCTTTGACGCTGGGGCT fosfaat
Bepaling van CEA in serummonsters
Preoperatieve serummonsters werden ook gebruikt voor het testen. tumormarker CEA met behulp van een commercieel verkrijgbare enzym immunoassay kit (Cobas Core EIA, Roche, Basel, Zwitserland). . Pathologisch afsnijdniveau werd vastgesteld op 5 ng /ml serum CEA
Statistische analyses
Kaplan-Meier statistische methode werd gebruikt voor het analyseren van klinische kenmerken en herhaling; verschillen werden geschat met de log-rank test. Prognostische factoren werden onderzocht door univariate en multivariate analyses (log-rank test voor univariate analyse en Cox proportionele risico's regressie model, achteruit stapsgewijs (voorwaardelijke LR) voor multivariate analyse). De chi-kwadraat Fisher exact test werd gebruikt voor statistische analyse. Alle statistische analyses werden gedaan met SPSS16.0. . Alle P-waarden waren 2 staart, en het niveau van significantie werd vastgesteld op 0.05
Resultaten
Klinische kenmerken Ondernemingen De 123 patiënten die deelnamen aan de studie leeftijd van 28-84 jaar (gemiddeld 57,11 jaar, mediaan, 59 jaar), en de verhouding van mannetjes vrouwtjes was 82:41 (Tabel 1). Staging werd uitgevoerd volgens de Tumor-Node-metastase (TNM) indeling van het Gemengd Comité Amerikaanse on Cancer (AJCC, herziene versie van 1997). Vierentwintig tumoren in de cardia, 3 in de maag fundus, 44 in de maag corpus, 45 in de maag antrum, 5 betrokken de hele maag en 2 was het overblijfsel maagcarcinoom (tabel 1) .table 1 Clinicopathologische functies en CEA * mRNA expressie gedetecteerd door real-time RT-PCR
kenmerken
Totaal aantal
(N = 123)

CEA mRNA
P-waarde
Positieve
(n = 45)
Negatief
(n = 78)

Age
≤40
13
3
10

• DNA polymeraseη eiwitexpressie voorspelt respons op de behandeling en overleving van gemetastaseerd adenocarcinoom van de maag patiënten behandeld met oxaliplatin gebaseerde chemotherapy
• De effectiviteit van echografie in het verifiëren van de plaatsing van een neussonde bij patiënten met een laag bewustzijn bij een noodsituatie center