Der Nachweis von carcinoembryonales Antigen Boten-RNA im Blut quantitative Echtzeit-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion umkehren mit erneuten Auftretens von Magen adenocarcinoma

Nachweis von carcinoembryonales Antigen Boten-RNA im Blut zur Vorhersage mittels quantitativer Echtzeit-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion Reverse Wiederholung von Adenokarzinom des Magens zur Vorhersage
Abstrakt
Hintergrund
die Existenz von zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) im peripheren Blut als Indikator für Tumorrezidiv wurde nicht eindeutig festgelegt, vor allem für Patienten mit Magenkrebs. Wir führten eine retrospektive Analyse der Beziehung zwischen CTCs im peripheren Blut bei der Erstdiagnose und klinisch-pathologische Befunde bei Patienten mit Magenkarzinom.
Methods
Blutproben von 123 Magenkarzinom-Patienten bei der Erstdiagnose erhalten wurden. mRNA wurde für carcinoembryonales Antigen (CEA) mRNA-Nachweis unter Verwendung von Echtzeit-RT-PCR extrahiert und verstärkt. Regelmäßige 3-Monats-Follow-up-Untersuchungen enthalten Serum-CEA-Messungen und Bildgebung.
Ergebnisse | Die Mindestschwelle für korrigierte CEA mRNA Score [(CEA mRNA /GAPDH mRNA) × 10 6] bei 100 gesetzt wurde. fünfundvierzig von 123 Patienten (36,6%) waren für CEA-mRNA-Expression positiv. CEA-mRNA-Expression signifikant mit T-Stadium und postoperativen Rezidivstatus (P
= 0,001) korreliert. Ein Rezidiv wurde in 44 von 123 Fällen (35,8%) und 25 von ihnen (56,8%) waren positiv für CEA mRNA gefunden. Von diesen Patienten war CEA mRNA empfindlicher als Serum-CEA in Wiederholung anzeigt. Drei-Jahres-krankheitsfreie Überleben der Patienten positiv für CEA mRNA war signifikant schlechter als der Patienten negativ für CEA mRNA (P
< 0,001). Nur waren histologischen Grad und CEA mRNA Positivität unabhängige Faktoren für das krankheitsfreie Überleben multivariate Analyse.
Schlussfolgerungen
CEA mRNA Zahl im peripheren Blut bei der Erstdiagnose kopieren signifikant mit Wiederauftreten der Krankheit in einem Adenokarzinom des Magens Patienten in Verbindung gebracht wurde. Real-time RT-PCR-Nachweis von CEA-mRNA-Spiegel bei der Erstdiagnose erscheint in einem Adenokarzinom des Magens Patienten eine vielversprechende Prädiktor für ein Rezidiv zu sein.
Hintergrund
Magenkrebs die häufigste Ursache der Krebssterblichkeit weltweit im Laufe des 20. Jahrhunderts geblieben. Die einzige nachgewiesene Heilbehandlung ist die chirurgische Resektion aller Brutto-und mikroskopische Läsionen. Doch trotz kurativer Gastrektomie unterzogen, einschließlich der erweiterten Lymphadenektomie und eine adjuvante Chemotherapie, kehrt Krebs sowohl regional als auch entfernten Standorten in der Mehrzahl der Patienten [1]. Diagnose Rezidiv mit gemeinsamen Follow-up-Protokolle gewöhnlich in einem späten Stadium durchgeführt wird, die, in einem Ausmaß, was die Möglichkeit einer wirksamen Behandlung ausschließt [2]. Die Überwachung von Tumorzellen (CTCs) zirkulierenden scheint für eine frühere Diagnose von Rezidiven größere Möglichkeit zu bieten.
Das Konzept des metastatischen Prozesses im peripheren Blut im 19. Jahrhundert entstanden die Untersuchung, wenn T. R. Ashworth beschriebenen ersten, das Phänomen der CTCs und S. Paget ein nicht-zufälliges Muster von Krebsmetastasierung Hypothese (die "Saat- und Erdreich Theorie) [3, 4]. Anschließend wurde die maligne Natur der CTCs bestätigt durch den Nachweis, daß sie tumorspezifische Chromosomenaberrationen besitzen [5, 6], und dass sie wachsen ex vivo als Zelllinien mit einem malignen Phänotyp [7]. Verschiedene Ansätze CTCs zu erkennen, wurden beschrieben und können in PCR-basierten Methoden und zytometrischer Methoden klassifiziert werden [8]. Mit dem Aufkommen der quantitativen real-time PCR-Verfahren [9], genaue Quantifizierung einer Zielsequenz
ist möglich geworden, . Quantitative PCR bietet Ermittler nicht nur technische Vorteile, sondern auch mit applikative Vorteile, wie die Definition der Abschneidewerte mRNA-Expressionsniveaus von klinischer Relevanz bei Krebspatienten im Vergleich zu gesunden Probanden hindeutet. Real-time PCR bietet auch die Möglichkeiten Zielsequenz-Last mit dem klinischen Ergebnis des Korrelierens [10] bzw. Reaktion auf die Therapie [11].
CEA, die ursprünglich als ein Tumor-assoziiertes Antigen beschrieben Darmkrebs, wurde 1987 kloniert und jetzt als ein Mitglied der Immunglobulin-Superfamilie-Protein erkannt [12]. Viele Studien haben Nachweis von Magen-Zellen im Blut berichtet [13], Knochenmark [14], und Peritonealdialyse Waschen [15] von Magenkrebs-Patienten von für CEA mRNA real-time PCR.
Das Ziel dieser Studie war es, die Wirksamkeit der CEA-mRNA-Echtzeit-PCR-Technik zur Früherkennung von Rezidiven bewerten. Um dieses Ziel zu erreichen, ist die Beziehung zwischen der klinischen Rezidiv und Blutspiegel von CEA mRNA präoperativ wurde in einem Adenokarzinom des Magens Patienten untersucht.
Methoden
Patienten
Eine schriftliche Einverständniserklärung von jedem Patienten über die Verwendung von Blutproben erhalten wurde Forschung in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts unseres Krankenhauses. Zwischen Februar 2002 und Dezember 2006 wurden insgesamt 123 konsekutive Patienten mit einem Adenokarzinom des Magens bei Cancer Center von Sun Yat-sen-Universität in die Studie eingeschlossen. Alle Patienten erhielten eine radikale Resektion und D2-Lymphadenektomie. Bei Leasing 15 Lymphknoten waren für den Nachweis zur Verfügung. Keine Peritonealdialyse Verbreitung gefunden. Klare Aufzeichnungen von Serum-CEA Änderung und Imaging-Auswertung vor der Operation und dann alle drei Monate nach der Operation erforderlich waren. Patienten, die positive Lymphknoten aufwiesen, wurden empfohlen eine adjuvante Chemotherapie erhalten, aber schließlich nur dreiundachtzig Patienten wurde eine adjuvante Chemotherapie. Die Therapien enthalten CAPOX (Capecitabin + Oxaliplatin, 16 Fälle mit einem Median-Zyklus von 4), FOLFOX6 (56 Fälle mit einem Median-Zyklus von 6), Taxol + Cisplatin (4 Fälle mit einem Median-Zyklus von 4), Taxol + 5FU /CF (Fluorouracil /Leucovorin, 7 Fällen mit einem Median-Zyklus von 6). Ein Rezidiv, einschließlich lokaler Rückfall und Fernmetastasen wurde durch Computertomographie Untersuchung festgestellt. Neue Läsionen, die durch bildgebende Untersuchung in Folgeterminen festgestellt wurden als Wiederholung angesehen. Biopsy wurde nicht routinemäßig durchgeführt histologischen Wiederholung zu bestimmen. Alle Abbildungs ​​wurde durch mindestens zwei unabhängige Beobachter, einschließlich Radiologen bewertet. Die mediane Nachbeobachtungszeit betrug 37,0 Monate (Bereich: 3,0-73,6 Monate).
Blutproben
Blutproben bei der Erstdiagnose gesammelt wurden ein oder zwei Tage vor der Operation. Die ersten 3 ml Blut verworfen epidermal Kontamination zu verhindern, und dann wurde eine 5-ml-Blutprobe wurde aus dem peripheren Vene erhalten. Periphere Blutproben von 30 Nicht-Krebspatienten Freiwilligen erhalten wurden als negative Kontrollen verwendet
Alle Patienten eine schriftliche Einverständniserklärung zur Verfügung gestellt. wir erhalten gesonderte Einwilligung zur Verwendung von Blutprobe. Studie Genehmigung wurde von unabhängigen Ethikkommissionen in den Cancer Center von Sun Yat-Sen-Universität erhalten. Die Studie wurde in Übereinstimmung mit den ethischen Standards der World Medical Association Deklaration von Helsinki durchgeführt.
Vorbearbeitung von Blutproben
Blutproben wurden in EDTA-enthaltenden Röhrchen gesammelt. Probenaufbereitung wurde innerhalb von 2 Stunden nach der Blutentnahme durchgeführt. Blut wurde in ein 30-ml-Falcon-Röhrchen überführt und für 20 Minuten bei 1800 Upm bei Raumtemperatur zentrifugiert. Serum wurde entfernt, und die Zellen wurden in 5 ml Kochsalzlösung und 0,3 ml RNA-Lösung später resuspendiert. Nach dem Mischen gut wurde das Blut Zellgemisch bei -80 ° C über Nacht bei 4 ° C und gespeichert gehalten, bis sie verwendet.
RNA-Extraktion und cDNA-Synthese
Gesamt-RNA aus peripheren Blutproben wurde mit RNAprep Zell Kit extrahiert (Tiangen , Beijing, China) nach dem Protokoll vom Hersteller zur Verfügung gestellt. RNA-Integrität durch Elektrophorese und quantifiziert durch Absorption bei 260 und 280 nm unter Verwendung eines UV-VIS Spektrophotometer (Beckman Coulter Du ® 800, Fullerton, CA) überprüft wurde. Für die reverse Transkription, 1 ug Gesamt-RNA, 1 &mgr; l Oligo (dT) 15 und 1 &mgr; l dNTP wurden in 10 &mgr; l RNase-freiem Wasser, inkubiert 10 Minuten bei 37 ° C und 1 ul von 25 mmol /L EDTA zugegeben verdünnt. Ein 11 ul Aliquot des Reaktionsgemisches wurde bei 65 ° C für 10 Minuten inkubiert und schnell für 2 Minuten auf Eis gekühlt. cDNA wurde bei -80 ° C bis zur Verwendung gelagert. cDNA-Synthese wurde durchgeführt, die TIANScript M-MLV-Methode (Tiangen Biotech, Beijing, China).
Zelllinien
für CEA-spezifische RT-PCR, zwei Zelllinien, SW-480 (Darmkrebs-Zelllinie Zur Vorbereitung ) und SC-7901 (Magenkrebs-Zelllinie) verwendet wurden. Die Lymphozyten wurden von gesunden Freiwilligen ohne epitheliale Bösartigkeit gesammelt. Nach Lymphozyten aus peripherem Blut durch Gradienten-Zentrifugation isoliert wurden, wurde die mononukleäre Zellschicht gesammelt. Zellinien wurden seriell verdünnt (10-fach) in 2 × 10 7 bis 5 x 10 7 Lymphozyten geben Karzinomzell: 1.10 bis 1.10 reicht Verhältnisse Lymphozyt 7
CEA mRNA Analyse durch quantitative Echtzeit-PCR-
Quantitative PCR wurde unter Verwendung der Sequenz-Detektorsystem, ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time-PCR-System) durchgeführt. PCR-Primer und die TaqMan-Sonden wurden entwickelt, um die Primer Express 1.0 Software-Programm. In diesem Test wurde das Housekeeping-Gen Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) als interne Kontrolle verwendet extrahiert Variationen in Integrität und die Gesamtmenge der RNA zu normieren. Die Echtzeit-PCR-Assays für GAPDH und CEA wurden in getrennten Röhren durchgeführt. CEA-mRNA-Werte wurden gegen GAPDH mRNA-Werte eingestellt, und die relativen mRNA CEA Werte wurden als (CEA mRNA /GAPDH mRNA) × 10 6 für jede Probe dargestellt.
5 &mgr; l der Probe cDNA für Echt verwendet wurde time PCR in einer 20 &mgr; l Reaktionsgemisch, bestehend aus 10 pmol geeigneter Primer (Invitrogen Cooperation, Japan) und 5 pmol Sonde TaqMan (Invitrogen Cooperation, Japan). Der Reporterfarbstoff (6-carboxy-fluorescein: FAM) wurde kovalent an das 5 'befestigt Ende der Sonde und der Quencher Farbstoff (6-Carboxy-Tetramethyl-Rhodamin: TAMRA) wurde zu der 3' befestigt Ende der Sonde. Das Temperaturprofil für die Amplifikation verwendet wurde, war wie folgt: Denaturierung für 1 Zyklus bei 95 ° C für 10 Minuten, 10 Sekunden bei 95 ° C nach 40 Zyklen, gefolgt, 60 ° C für 15 Sekunden und 72 ° C für 5 Sekunden. Die Quantifizierung wurde durch das ABI Prism 7500 Sequence Detektorsystem. Jeder Satz von Proben und seriell verdünnt externen Kontrollen wurden doppelt verstärkt. Der Mittelwert der Duplikate wurde als quantitativer Wert verwendet.
Ein CEA-spezifischen Oligonukleotid-Primer basierend auf dem Bericht von Gerhard entworfen wurde, et al.
[16]. Die Sequenzen waren: 5'-TGTCGGCATCATGATTGG-3 '(sense) und 5'-GCAAATGCTTTAAGGAAGAAGC-3' (Antisense). Leuchtstoff- und LC-Red Sondensequenzen für CEA Identifizierung verwendet wurden, waren: 5'-Fluorescein-CCTGAAATGAAGAAACTACACCAGGGC und 5'-LC-Red 640-GCTATATCAGAGCAACCCCAACCAGC-phosphat
Real-time PCR-Überwachung durch Messung des Fluoreszenzsignals am Ende erreicht wurde. von Annealingphase eines jeden Zyklus. Die Primersequenzen für die GAPDH-Amplifikation verwendet wurden, waren: 5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3 '(sense) und 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' (Antisense). Die Sondensequenzen für GAPDH Identifizierung verwendet wurden, waren: 5'-TCAACAGCGACACCCACTCCT-Fluorescein und 5'-LC-Red 640-CACCTTTGACGCTGGGGCT-Phosphat
Bestimmung von CEA in Serumproben
präoperative Serumproben auch zur Untersuchung verwendet wurden. Tumor CEA Marker eines im Handel erhältlichen Enzym-Immunoassay-Kit (Cobas Core-EIA, Roche, Basel, Schweiz). . Pathologische Cutoff-Ebene wurde bei 5 ng etabliert /mL für Serum-CEA
Statistische Analysen
Die Kaplan-Meier-statistische Verfahren zur Analyse von klinischen Eigenschaften und Wiederholung verwendet wurde; Unterschiede wurden mit dem Log-Rank-Test geschätzt. Die prognostische Faktoren wurden durch univariate und multivariate Analysen (Log-Rank-Test für univariate Analyse und Cox Proportional-Hazards-Regressionsmodell, rückwärts schrittweise (bedingtes LR) für multivariate Analyse) untersucht. Die Chi-Quadrat und Fisher genaue Tests wurden für die statistische Analyse verwendet. Alle statistischen Analysen wurden mit SPSS16.0 getan. . Alle P-Werte waren 2-tailed und das Signifikanzniveau bei 0,05 gesetzt wurde
Ergebnisse
Klinische Merkmale, Die 123 an der Studie teilnehmenden Patienten Alter von 28 und 84 Jahren (Mittelwert, 57,11 Jahre, Median, 59 Jahre), und das Verhältnis von Männern zu Frauen war 82:41 (Tabelle 1). Staging durchgeführt wurde nach der Tumor-Node-Metastase (TNM) Klassifikation des American Joint Committee on Cancer (AJCC, überarbeitet 1997). Vierundzwanzig Tumoren in der Cardia, 3 in der Magenfundus, 44 in der Magencorpus, 45 in der Magenantrum befanden, beteiligt 5 den ganzen Magen und 2 gehörte zu den übrigen Magenkarzinom (Tabelle 1) .Tabelle 1 Clinicopathologic Merkmale und CEA * mRNA nachgewiesen Expression mittels real-time RT-PCR
Merkmale
Gesamtzahl
(N = 123)

CEA mRNA
P-Wert
Positive
(n = 45)
Negative
(n = 78)

Age
≤40
13
3 10
41-50
20
9
11
51-60
39
9
30
61-70
42
18
24
> 70
9
6 3
0,063
Sex
Weiblich
41
12
29
männlich
82
33
49
0.234
Tumor
T1 10
6
4 T2
16
3
13
T3
73
26
47
T4
24
10
14
0,001
Lymphknoten
31
N0
11
20
N1
43
15
28
N2

8 21
N3
20
11
9
0.261
Pathologische TNM # stage
I 16
7

9
II
21
6 15
III
51
17
34
IV
35
15
20
0,623
Histologie Subtyp
gut differenzierten Adenokarzinom
3 seite 1 von 2
Mäßig Adenokarzinom differenziert
27
7
20
Poorly differenziertes Adenokarzinom
93
37
56
0.418
Serum CEA Zustand
Positive
30
11
19
Negative
93

59
0.992
Recurrence
Ja
44
25
19
No
79
20
59
0,001
Modi der Wiederholung
Lokalrezidiv
8 4
4 Bauchhöhle
9
6 3
Leber
8
5
3
Becken
6 3
3
Mehrere Standorte 10
5
5
andere
3
2 seite 1 von 0.959
* Carcinoembryonic Antigen
# TNM Tumor-Knoten-Metastasierung
Nachweisempfindlichkeit von CEA-mRNA durch real-time RT-PCR
CEA-mRNA wurde in SW erkannt bezeichnet -480 und SC-7901-Zelllinien. Die untere Nachweisgrenze war eine Konzentration von 10 Tumorzellen pro 10 7 Lymphozyten. Herkömmliche nested RT-PCR wurde verwendet, um die Sensitivität der RT-PCR-Produkts zu bestätigen.
CEA-mRNA-Expression im Blut
CEA-mRNA-Expression in 9 von 30 (30,0%) Nicht-Krebspatienten und der Mittelwert ermittelt wurde korrigiert CEA mRNA-Score betrug 7,5 (Bereich: 0 bis 92,5). Der Maximalwert der korrigierten CEA mRNA-Score bei Patienten ohne war Bösartigkeit 92,5, so dass ein Cutoff-Wert von 100 wurde in der vorliegenden Studie verwendet. Unter Verwendung dieses Cutoff-Wert, 45 Patienten (36,6%) wurden als CEA-mRNA positive diagnostiziert. Die mittlere korrigierte CEA mRNA-Score [(CEA mRNA /GAPDH mRNA) × 10 6] der 123 Patienten betrug 37,510.0 (Bereich 0-3,695,652.1) Kopien 1 Abbildung die Verteilung der (CEA mRNA /GAPDH mRNA) zeigte × 10 6 in dieser Gruppe von Patienten. Abbildung 1 Die Verteilung der CEA-Expressionsniveau. Die Verhältnismittel (CEA mRNA /GAPDH mRNA) × 106 Betrachtet man das Verhältnis von einigen Patienten Null waren wir 0,5 bis das Verhältnis hinzugefügt.
Beziehung zwischen CEA-mRNA-Expression und klinisch-pathologische Merkmale
CEA-mRNA-Expression nicht mit korrelierte Alter, Geschlecht, N-Stadium, TNM-Stadium, histologische Subtyp und Serum-CEA Zustand (Tabelle 1). Jedoch Patienten mit postoperativen Rezidiv hatten signifikant höheren Prozentsatz der CEA-mRNA-positive als solche ohne Tumorrezidiv (P
= 0,001) (Tabelle 1). Dabei auch Tumortiefe positiv mit CEA-mRNA-Expression (P
= 0,001).
Beziehung zwischen Rezidiv und CEA-mRNA-Expression als auch korreliert als Serum-CEA
Der Modus der Wiederholung 8 Lokalrezidiv, 9 Bauch Verbreitung umfasst außer Leber, 8 Lebermetastasen, 6 Beckenmetastasen, 3 anderen Standorten Metastasierung und 10 Metastasen mehrere Standorte. Es gibt keinen signifikanten Unterschied zwischen der CEA-mRNA-Expression und die Art der Wiederholung (Tabelle 1).
Rezidiv wurde in 44 von 123 Fällen (35,8%) gefunden. Fünfundzwanzig dieser Patienten (56,8%) waren CEA mRNA-positiv. Im Gegensatz dazu waren nur 14 Patienten mit rezidivierender Erkrankung (31,8%) positiv für die präoperative Serum-CEA. Die Besonderheiten der CEA mRNA und Serum-CEA Wiederholung, um anzuzeigen, waren 74,7% und 79,9%, respectively. (Tabelle 2) .Tabelle 2 Vergleich zwischen CEA * mRNA und Serum-CEA in Wiederholung der Vorhersage

CEA mRNA
Serum CEA

Positive

Negative

Positive

Negative

Recurrence
Yes
25
19
14
30
No
20
59
16
63
P
0.001
0.152
X 2
12,088
2,050
Empfindlichkeit (%)
56,8
31,8
Spezifität (%)
74,7
79,7
* Carcinoembryonic Antigen
Univariate und multivariate Analysen von 3-Jahres krankheitsfreie Überleben
Die 5-Jahres war das Gesamtüberleben 58,9% und 3-Jahres krankheitsfreie Überleben betrug 63,9%. Beide univariate und multivariate Analysen wurden verwendet, Faktoren zu bewerten, um das krankheitsfreie Überleben im Zusammenhang. Nach univariaten Analyse, Alter, Tumordicke, wurden Lymphknotenmetastasen, histologischen Grad, TNM-Stadium, CEA mRNA Positivität und Serum-CEA-Positivität auf das krankheitsfreie Überleben (P
signifikant mit = 0,031, < 0,001, 0,001, 0,022, < 0,001, 0,001, 0,045 bzw.) (Tabelle 3). Multivariate Regressionsanalyse zeigte, dass nur histologischen Grad und CEA mRNA Positivität waren unabhängige Faktoren für das krankheitsfreie Überleben (P
= 0,047 und 0,020 bzw. Tabelle 4). Drei-Jahres krankheitsfreie Überlebensraten für CEA mRNA-positiven Patienten waren signifikant niedriger als für CEA mRNA-negativen Patienten (43,9% versus 74,1%, p = 0.001
, Abbildung 2) .Tabelle 3 Univariate Analyse von krankheits- freie Überleben bei Magenkarzinom
Parameter
krankheitsfreie Überleben, P Werta
Alter
< 59 vs. ≥59
0,031
Gender
männlich vs. weiblich
0.433
CEA mRNA
(+) vs. (-)
0,001
Serum CEA
(+) vs. (-)
0,045
Grading
Well /mäßig vs. schlecht
0,022
pT
pTis /pT1 vs pT2 /pT3 /pT4
< 0,001
pN
(+) vs. (-)
0,001
Bühne
1/2 vs. 3/4
< 0,001
adjuvante Chemotherapien
CAPOX vs. mFOLFOX6 vs. Taxol + DDP vs. Taxol + 5FU /CF
0.850 TÜV-Log-Rank-Test
Tabelle 4 Multivariate Analyse von krankheitsfreie Überleben in Magenkarzinom
Factors
Merkmale
Hazard Ratio Bei
95% CI Bei
P
value

Unfavorable

Favorable

Age
≥59
<59
1.018
0.986-1.050
0.273
Histological grade
Poorly
Well/moderately
0.412
0.171-0.990
0.047
pT
2/3/4
Tis/1
1.673
0.100-8.690
0.947
pN
(+)
(-)
2.030
0.264-15.611
0.497
Stage
3/4
½
1.437
0.124-16.613
0.771
CEA mRNA
(+)
(-)
2,243
1,138-4,424
0,020
Serum CEA
(+)
(-)
1,130
0,582-2,194
0.717
CI, Konfidenzintervall; pT, die Tiefe der Tumorinvasion
2 krankheitsfreie Überleben der Patienten Abbildung gemäß CEA-mRNA-Expression. Drei-Jahres krankheitsfreie Überleben der CEA-mRNA-positiven Patienten signifikant niedriger war als die der CEA-mRNA-negativen Patienten (43,9% versus 74,1%, p
= 0,001).
Diskussion
Der halb -quantitative Natur der herkömmlichen PCR-Technologie hat es schwierig gemacht Basisgenexpressionsniveaus in normalen Geweben von erhöhten Genexpressionsniveaus in Krebs zu unterscheiden, wodurch die Sorge um falsch-positive Ergebnisse zunehmende [17]. In unserer Studie wurde real-time PCR von CEA mRNA verwendet, um die Möglichkeit der peripheren Blut als Quelle für die CTC-Erkennung und Vorhersage von Krebsrezidiv bei Magenkarzinompatienten zu untersuchen. Real-time quantitative CEA mRNA-Analyse bei Krebspatienten wird häufig basierend auf CEA mRNA Positivität durchgeführt, die einen Cutoff-Ebene wird unter Verwendung [13]. CEA mRNA kann bei Patienten mit gutartigen Erkrankungen sowie gesunden Probanden nachgewiesen werden, so dass die Cutoff-Ebenen sind in der Regel durch maximalen Ausdruck in nicht-malignen Patienten bestimmt [18, 19]. Setoyama T et al. festgestellt, dass war der maximale Wert von CEA-mRNA bei Patienten ohne Bösartigkeit 8.6, stellen sie daher den Cutoff-Wert als 9,0 [20]. Schuster R et al. [21] verwendet, auch den maximalen Wert von gesunden Freiwilligen Hintergrund als der Cut-off-Wert für die CEA mRNA-Nachweis in Patienten mit Darmkrebs. In unserer Studie haben wir auch den maximalen Wert der korrigierten CEA mRNA-Score bei Patienten ohne Bösartigkeit als Cutoff-Wert. ein Cutoff-Wert von 100 für normierte CEA-mRNA-Spiegel durch den Aufbau, können wir Krebspatienten von Nicht-Krebspatienten und daher mehr sicher halten die Expression von CEA mRNA als Marker für zirkulierende Tumorzellen unterscheiden.
Wir fanden, dass 10 Patienten mit T1-Tumor, hatten 6 Patienten positive CEA-mRNA-Expression. Aber keine Aufzeichnung Wiederholung wurde in den 10 Patienten gefunden. Es scheint, dass es zwischen der CEA-mRNA-Expression und Rezidiv keine Beziehung in T1 Tumor ist. Es ist schwer, die hohe positive Rate von CEA-mRNA in T1 Patienten zu erklären, aber wir fanden heraus, dass die CEA-mRNA-Expression in den 6 T1 Patienten niedrig war, von 4320 Kopien bis 44 600 Exemplaren. Ikeguchi M [22] berichteten, dass 12,5% der Phase I Magenkarzinom-Patienten CK20-mRNA exprimiert, und sie betrachtet, dass sie durch einen kleinen CK20-Expression in peripheren weißen Blutzellen induziert.
Wenige Berichte beurteilt haben den Zustand der CTCs in Magen Karzinom-Patienten vor der Behandlung. Ikeguchi und Kaibara berichtet [23], dass sie keine Krebszellen im peripheren Blut von unbehandeltem Magenkarzinom-Patienten finden konnten. Die Autoren spekulierten, dass Krebszellen anscheinend nicht leicht von primären Tumoren in Patienten mit unbehandelter Magenkarzinom in das periphere Blut zu migrieren. Im Gegensatz dazu Miyazono et al.
[24] zeigten, dass die positive Rate für CEA mRNA von Magenkarzinom-Patienten 8,8% vor der Operation war. Die Anwesenheit von CTCs vor der Behandlung und seine Beziehung mit dem klinischen Ergebnis bleibt somit umstritten. In dieser Studie haben wir die klinische Bedeutung der CTCs in Blut vor der Operation durch Echtzeit-RT-PCR unter Verwendung von mRNA-Expression von CEA zu detektieren. Die positive Rate von CEA mRNA vor jeder Behandlung beträgt 36,6%. Weitere Datei 1 zeigt die positive Rate der mRNA-Marker in der Literatur für den Nachweis von Tumorzellen durch Echtzeit-RT-PCR.
O'Sullivan et al.
[25] vorgeschlagen, dass die präoperative Nachweis von Mikrometastasen reflektieren können entweder transient vergießen von Zellen, metastatische Potential oder Resterkrankung. In der vorliegenden Studie haben wir festgestellt, dass CTCs im Blut nachgewiesen wurden vor der Behandlung in Bezug auf Wiederholung. Mehrere Berichte haben gezeigt, dass die präoperative Erkennung von Krebszellen von zirkulierenden eine klare Markierung der schlechten Überleben der Patienten war, weil viele Fälle mit Krebszellen zirkulierenden präoperativ entweder Metastasen oder Fernmetastasen erweiterten Lymphknoten zeigte, so ist die Prognose dieser Patienten war schlecht [26-28 ]. In der aktuellen Studie haben wir festgestellt, dass die Expression von CEA-mRNA Wiederauftreten der Krankheit signifikant verbunden war. Darüber hinaus Patienten mit positiven CEA mRNA hatte kürzere 3-Jahres krankheitsfreie Überleben Ergebnis. Die Inzidenz eines erneuten Auftretens war signifikant höher bei Patienten positiv für CEA mRNA als bei denen, negativ. Die Sensitivität der CEA-mRNA-Expression
Wiederholung vorherzusagen nur 56,8% beträgt. Nineteen von achtundsiebzig Patienten (24,4%) mit negativen CEA-mRNA-Expression hatte ein Tumorrezidiv. Setoyama et al.
[20] zeigten, dass 8 von 69 (11,6%) Ösophagus-Karzinom Patienten mit negativem CEA-mRNA-Expression Tumorrezidiv hatte, und 6 Patienten Lymphknoten Rezidiv hatte. Eine häufig verwendete Erklärung der Erkennung Fehler ist, dass zirkulierende Zellen nicht homogen verteilt und nicht kontinuierlich in Umlauf Schuppen [29, 30]. Darüber hinaus ist die ideale Marker (keine illegitime Expression im Blut, hoher Expression in Tumorzellen) wurde noch nicht gefunden worden. Jenseits CEA mRNA, anderen Transkripten, einschließlich Cytokeratin (CA) 18 [31], Matrix-Metalloproteinase (MMP) -7- [32], CK 20 [33], Urokinase-Plasminogenaktivator-Rezeptor (uPAR), CK 19 und CK 7 [ ,,,0],34], wurden als potentielle Marker für CTCs versucht worden. Jedoch sollte die Tumorzelle Webfach ein relativ seltenes Ereignis. Somit ob peripherem Blut ein geeignetes Fach zur Früherkennung von Mikrometastasen ist noch umstritten. Andere Fächer wie Knochenmark oder Bauchhöhle sind bekannt höhere Erkennungsraten zu liefern, wahrscheinlich aufgrund einer größeren Anzahl von Tumorzellen [35-37].
Ein weiteres wichtiges Thema ist falsch positive Expression von CEA-mRNA. Zwanzig Patienten (44,4%), die positive CEA-mRNA-Expression hatten, nicht erneut in der Follow-up aufzunehmen. Ein Grund dafür könnte die relativ kurze Nachbeobachtungszeit sein.
Alternativ kann dies durchaus sinnvoll, weil nur wenige Karzinom Schuppen Zellen in den Blutstrom in Gründung metastatische Erkrankung erfolgreich [25]. Diese zirkulierenden Krebszellen möglicherweise nicht auf andere Organe bringen und möglicherweise nicht wachsen. Vor kurzem Méhes et al.
[38] untersuchten die Morphologie von zirkulierenden Krebszellen, und festgestellt, dass die Mehrzahl der Brustkrebszellen in einem Zustand der Apoptose zirkulierte. Im peripheren Blut von Krebspatienten wurde die Existenz der Tumorzelllymphozyten Komplex beobachtet [39]. Diese Ergebnisse zeigen, dass Makrophagen oder Lymphozyten könnten eine wichtige Rolle bei der Induktion von zirkulierenden Tumorzellapoptose und die Antitumor-Immunantwort des Wirts spielen. Diese immunisierten Makrophagen können die zytotoxischen T-Lymphozyten des Wirts zu sensibilisieren, und die sensibilisierten T-Lymphozyten kann die Rest micrometastatic Krebsläsionen der Patienten [23] angreifen. Um diese Hypothese zu klären, weitere Untersuchungen den Zusammenhang zwischen dem Vorhandensein von zirkulierenden Krebszellen und Immunantwort des Wirts hinsichtlich notwendig sind.
Die aktuelle Studie war retrospektive Analyse, und Patienten, die eine adjuvante Chemotherapie erhalten sollten wurden nicht vor der Zeit eingestellt. Im Allgemeinen Patienten, die positive Lymphknoten aufwiesen, wurden empfohlen eine adjuvante Chemotherapie erhalten. Bis jetzt gibt es keine einheitlichen Kriterien für die adjuvante Chemotherapie von Magenkrebs in China. Unsere Studie hat gezeigt, dass die CEA mRNA Kopienzahl im peripheren Blut bei der Erstdiagnose signifikant mit Wiederauftreten der Krankheit in einem Adenokarzinom des Magens Patienten in Verbindung gebracht wurde. Im Hinblick auf die Wiederholung, empfehlen wir daher, dass Patienten, die positive CEA-mRNA-Expression präoperativ haben erhalten eine adjuvante Chemotherapie nach radikaler Resektion.
Schlussfolgerungen
In dieser Studie betrug die Sensitivität von CEA mRNA höher als die des Serum-CEA. Außerdem war nach multivariate Regressionsanalyse, CEA mRNA Positivität ein unabhängiger Faktor für Rezidiv. Die vorliegende Studie bestätigt, dass ein solches Verfahren wurde vor der Behandlung bei Patienten mit Magenkarzinom für die Früherkennung von CTCs vielversprechend; Patienten mit positiven CEA mRNA kann ein höheres Risiko für ein Rezidiv haben, auch nach kurativer Resektion. Allerdings ist eine große randomisierte prospektive Studie gerechtfertigt, um die Rolle der CEA mRNA-Nachweis im Blut zu definieren
Abkürzungen
RT-PCR.
Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion

CTCs:
zirkulierende Tumorzellen
CEA:
Carcinoembryonic Antigen
CA19-9:
Carbohydrate Antigen 19-9
TNM:
Tumor-Node-Metastasierung
AJCC:
American Joint Committee on Cancer
GAPDH:
Glyceraldehyde 3-Phosphat-Dehydrogenase
MMP-7:
Matrix Metalloproteinase-7


uPAR.
Urokinase-Typ Plasminogen-Aktivator-Rezeptor
Erklärungen
Danksagung
Diese Arbeit durch National Natural Science Foundation of China Zuschuss 30672408 finanziert wurde, Guangzhou Bureau of Science and Technology gewähren 2006Z3-E0041 und Sun Yat-sen-Universität 985 Programm Initiation Fonds (China). Wir danken danken für die Mitarbeiter in der Abteilung für Medizinische Onkologie und GI Chirurgie Onkologie bei Sun Yat-sen University Cancer Center für ihre Anregung und Unterstützung | Elektronische Zusatzmaterial
12967_2009_529_MOESM1_ESM.DOC Weitere Datei. 1: Daten aus der Literatur für Nachweis von Tumorzellen durch Echtzeit-RT-PCR von mRNA-Marker. Es zeigt die positive Rate der mRNA-Marker aus der Literatur zum Nachweis von Tumorzellen durch Echtzeit-RT-PCR. (DOC 58 KB) Autoren 'Original vorgelegt Dateien für Bilder
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