Rilevamento di carcinoembrionario RNA messaggero antigene nel sangue usando quantitativa in tempo reale inversa reazione a catena della polimerasi trascrittasi-per prevedere il ripetersi di adenocarcinoma gastrico

Rilevamento di carcinoembrionario RNA messaggero antigene nel sangue usando quantitativa in tempo reale inversa reazione a catena della polimerasi trascrittasi-per prevedere il ripetersi di adenocarcinoma gastrico
Abstract
sfondo
L'esistenza di cellule tumorali circolanti (CTC) nel sangue periferico come indicatore di recidiva del tumore non è stato chiaramente stabilito, in particolare per i pazienti affetti da cancro gastrico. Abbiamo condotto un'analisi retrospettiva del rapporto tra CTC nel sangue periferico a risultati di diagnosi e clinicopatologiche iniziale in pazienti con carcinoma gastrico.
Metodi
I campioni di sangue sono stati ottenuti da 123 pazienti con carcinoma gastrico al momento della diagnosi iniziale. mRNA è stato estratto e amplificato per l'antigene carcinoembrionario (CEA) mRNA rilevamento utilizzando real-time RT-PCR. Periodici 3 mesi esami di follow-up comprendeva misure siero CEA e di imaging.
Risultati
La soglia minima per la corretta CEA mRNA punteggio [(CEA mRNA /GAPDH mRNA) × 10 6] è stato fissato a 100. quarantacinque di 123 pazienti (36,6%) sono risultati positivi per l'espressione di mRNA CEA. espressione di mRNA CEA significativamente correlata con stadio T e lo stato di recidiva postoperatoria (p
= 0,001). recidiva di malattia è stato trovato in 44 dei 123 casi (35,8%), e 25 di questi (56,8%) sono risultati positivi per la CEA mRNA. Di questi pazienti, il CEA mRNA era più sensibile del CEA nel siero nell'indicare recidiva. Tre anni di sopravvivenza libera da malattia di pazienti positivi per il CEA mRNA era significativamente più poveri di pazienti negative per CEA mRNA (P
< 0,001). Solo grado istologico e CEA mRNA positività sono stati fattori indipendenti per la sopravvivenza libera da malattia utilizzando l'analisi multivariata.
Conclusioni
CEA mRNA il numero della copia nel sangue periferico al momento della diagnosi iniziale era significativamente associata a recidiva di malattia in pazienti con adenocarcinoma gastrico. Rilevamento in tempo reale RT-PCR dei livelli di mRNA CEA al momento della diagnosi iniziale sembra essere un fattore predittivo promettente per recidiva di malattia nei pazienti con adenocarcinoma gastrico.
Sfondo
cancro gastrico è rimasta la principale causa di mortalità per cancro in tutto il mondo per tutto il 20 ° secolo. L'unico trattamento curativo provata è la resezione chirurgica di tutte le lesioni macroscopiche e microscopiche. Tuttavia, nonostante in fase di gastrectomia curativo, tra cui estesa dissezione linfonodale e chemioterapia adiuvante, il cancro si ripete sia regionale, nonché siti distanti nel maggior parte dei pazienti [1]. La diagnosi di recidiva con protocolli comuni di follow-up di solito è fatto in una fase tardiva, che, in una certa misura, preclude la possibilità di un trattamento efficace [2]. Sorveglianza delle cellule tumorali circolanti (CTC) sembra offrire una maggiore possibilità di diagnosi precoce delle recidive.
Il concetto di indagare il processo metastatico nel sangue periferico origine nel 19 ° secolo, quando T.R. Ashworth primo descrisse il fenomeno della CTC, e S. Paget ipotizzato un modello non casuale di metastatizzazione del cancro (il 'seme e suolo' teoria) [3, 4]. Successivamente, la natura maligna di CTC stato confermato dimostrando di possedere aberrazioni cromosomiche tumore-specifici [5, 6] e che crescono ex vivo come linee cellulari con un fenotipo maligno [7]. Diversi approcci per rilevare CTC sono stati descritti e possono essere classificati in metodi basati sulla PCR e metodi di citometria a [8].
Con l'avvento del quantitativa in tempo reale le tecniche di PCR [9], precisa quantificazione di una sequenza bersaglio è diventato possibile . PCR quantitativa fornisce gli investigatori non solo con i vantaggi tecnici, ma anche con vantaggi applicativi, come ad esempio la definizione di valori di cutoff che indicano mRNA livelli di espressione di rilevanza clinica nei pazienti affetti da cancro rispetto ai soggetti sani. Real-time PCR offre anche la possibilità di correlare carico target-sequenza con esito clinico [10] o la risposta alla terapia [11].
CEA, originariamente descritto come un antigene tumore del colon associata al tumore, è stato clonato nel 1987 ed è ora riconosciuto come un membro della superfamiglia delle immunoglobuline proteine ​​[12]. Molti studi hanno riportato la rilevazione delle cellule gastriche nel sangue [13], il midollo osseo [14], e il lavaggio peritoneale [15] dei pazienti affetti da cancro gastrico mediante PCR in tempo reale per CEA mRNA.
L'obiettivo di questo studio è stato quello di valutare l'efficacia del tempo reale tecnica CEA mRNA PCR per la diagnosi precoce di recidiva. Per raggiungere questo obiettivo, la relazione tra recidiva clinica e livelli ematici di CEA mRNA preoperatorio è stato esaminato in pazienti con adenocarcinoma gastrico.
Metodi
pazienti
consenso informato scritto è stato ottenuto da ogni paziente sull'uso di campioni di sangue per la ricerca in conformità con le linee guida istituzionali del nostro ospedale. Tra il febbraio 2002 e il dicembre del 2006, per un totale di 123 pazienti consecutivi con adenocarcinoma gastrico al Cancer Center di Sun Yat-sen University sono stati arruolati in questo studio. Tutti i pazienti hanno ricevuto una resezione radicale e linfoadenectomia D2. Al contratto di locazione di 15 linfonodi erano disponibili per la rilevazione. No diffusione peritoneale è stato trovato. sono stati richiesti Cancella record di cambiamento siero CEA e la valutazione delle immagini prima dell'operazione e ogni tre mesi dopo l'operazione. I pazienti che avevano linfonodi positivi sono stati raccomandati per ricevere la chemioterapia adiuvante, ma alla fine solo ottantatré anni pazienti sono stati sottoposti a chemioterapia adiuvante. I regimi inclusi CAPOX (capecitabina + oxaliplatino, 16 casi, con un ciclo mediana di 4), FOLFOX6 (56 casi, con un ciclo mediano 6), taxolo + cisplatino (4 casi, con un ciclo mediana di 4), tassolo + 5FU /CF (fluorouracile /leucovorina, 7 casi, con un ciclo mediano 6). recidiva di malattia, tra cui ricaduta e distanti metastasi locali, è stato rilevato da un esame tomografia computerizzata. Nuove lesioni rilevate mediante esame di imaging in appuntamenti di follow-up sono stati considerati come recidiva. La biopsia non è stato fatto di routine per determinare recidiva istologico. Tutto l'imaging è stato valutato da almeno due osservatori indipendenti, tra radiologi. Il periodo mediano di follow-up è stata di 37.0 mesi (range, 3.0-73.6 mesi)
. I campioni di sangue
I campioni di sangue sono stati raccolti al momento della diagnosi iniziale di uno o due giorni prima dell'intervento chirurgico. I primi 3 ml di sangue sono stati scartati per prevenire la contaminazione epidermica, e poi un campione di sangue 5 mL è stato ottenuto dalla vena periferica. campioni di sangue periferico ottenute da 30 non-cancro pazienti volontari sono stati utilizzati come controlli negativi
Tutti i pazienti di cui il consenso informato scritto.; abbiamo ottenuto il consenso a parte per l'uso del campione di sangue. approvazione studio è stato ottenuto da comitati etici indipendenti al Cancer Center di Sun Yat-Sen University. Lo studio è stato condotto in conformità con gli standard etici del mondo Dichiarazione dei Medici di Helsinki.
Pre-trattamento dei campioni di sangue
I campioni di sangue sono stati raccolti in provette EDTA contenenti. campione di trasformazione è stato eseguito entro 2 ore dopo la sospensione del sangue. Il sangue è stato trasferito in un tubo falcon da 30 ml e centrifugato a 1.800 rpm a temperatura ambiente per 20 minuti. Serum è stato rimosso, e le cellule sono state risospese in 5 ml di soluzione salina e 0,3 mL RNA tardi soluzione. Dopo aver mescolato bene, la miscela di cellule del sangue è stata mantenuta una notte a 4 ° C e conservato a -80 ° C fino all'uso. All'estrazione
RNA e cDNA sintesi
RNA totale di campioni di sangue periferico è stato estratto utilizzando Cell Kit RNAprep (Tiangen , Pechino, Cina) seguendo il protocollo fornito dal produttore. integrità dell'RNA è stata controllata mediante elettroforesi e quantificata mediante assorbimento a 260 e 280 nm utilizzando uno spettrofotometro UV-visibile (Beckman Coulter Du ® 800, Fullerton, CA). Per la trascrizione inversa, 1 mg di RNA totale, 1 ml Oligo (dT) 15 e 1 ml dNTP stati diluiti in 10 ml di acqua RNase-free, incubate 10 minuti a 37 ° C e 1 ml di 25 mmol /L EDTA è stato aggiunto. Un'aliquota 11 ml di miscela di reazione è stata incubata per 10 minuti a 65 ° C e rapidamente raffreddato in ghiaccio per 2 minuti. cDNA è stato conservato a -80 ° C fino all'uso. cDNA Synthesis è stata effettuata utilizzando il metodo TIANScript M-MLV (Tiangen Biotech, Pechino, Cina).
linee cellulari
Per preparare CEA-specifici RT-PCR, due linee cellulari, SW-480 (linea cellulare del cancro del colon ) e SC-7901 (gastrica linea di cellule di cancro) sono stati utilizzati. I linfociti sono stati raccolti da volontari sani senza malignità epiteliale. Dopo linfociti sono stati isolati da sangue periferico mediante centrifugazione gradiente, lo strato di cellule mononucleate sono state raccolte. Le linee cellulari sono stati diluiti (10 volte) in 2 × 10 7 a 5 × 10 7 linfociti per dare carcinoma a cellule: i rapporti dei linfociti vanno 1:10-01:10 7.
CEA mRNA analisi per Real-time PCR quantitativa
PCR quantitativa è stata effettuata utilizzando il sistema di rilevazione di sequenza, ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems 7500 veloce Real-time PCR System). primer PCR e le sonde TaqMan sono stati progettati utilizzando il programma software 1.0 Primer Express. In questo saggio, la pulizia gene gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) è stato utilizzato come controllo interno per normalizzare variazioni integrità e la quantità totale di RNA estratto. I saggi di PCR in tempo reale per GAPDH e CEA sono state fatte in provette separate. I valori CEA mRNA sono stati adeguati contro i valori GAPDH mRNA, ed i relativi punteggi CEA mRNA sono stati presentati come (CEA mRNA /GAPDH mRNA) × 10 6 per ogni campione.
5 ml di cDNA campione è stato utilizzato per il reale time PCR in una miscela di reazione di 20 microlitri contenente 10 pmol primers appropriati (cooperazione Invitrogen, Giappone) e 5 sonda TaqMan pmol (Invitrogen cooperazione, Giappone). Il colorante reporter (6-carbossi-fluoresceina: FAM) è covalentemente attaccata alla estremità 5 'della sonda, e il colorante quencher (6-carbossi-tetrametil-rodamina: TAMRA) era attaccato alla estremità 3' della sonda. Il profilo di temperatura usato per l'amplificazione è stato il seguente: denaturazione per 1 ciclo a 95 ° C per 10 minuti, seguiti da 40 cicli a 95 ° C per 10 secondi, 60 ° C per 15 secondi, e 72 ° C per 5 secondi. La quantificazione è stata fatta da parte del sistema di rilevazione sequenza ABI Prism 7500. Ogni set di campioni e controlli esterni in serie diluiti sono stati amplificati in duplicato. Il valore medio dei duplicati è stato utilizzato come il valore quantitativo.
Un fondo oligonucleotide specifiche CEA è stato progettato sulla base della relazione di Gerhard et al.
[16]. Le sequenze sono state: 5'-TGTCGGCATCATGATTGG-3 '(senso) e 5'-GCAAATGCTTTAAGGAAGAAGC-3' (antisenso). sequenze di sonda fluorescente e LC-rosso usato per l'identificazione CEA sono stati: 5'-CCTGAAATGAAGAAACTACACCAGGGC-fluoresceina e 5'-LC-Rosso 640-GCTATATCAGAGCAACCCCAACCAGC-fosfato Real-time PCR monitoraggio è stato ottenuto misurando il segnale di fluorescenza alla fine. di ricottura fase di ciascun ciclo. Le sequenze di primer utilizzati per l'amplificazione GAPDH sono stati: 5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3 '(senso) e 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' (antisenso). Le sequenze sonda utilizzata per l'identificazione GAPDH sono stati: 5'-TCAACAGCGACACCCACTCCT-fluoresceina e 5'-LC-Rosso 640-CACCTTTGACGCTGGGGCT-fosfato
Determinazione della CEA nei campioni di siero
campioni di siero pre-operatorio sono stati utilizzati anche per il saggio. marker tumorale CEA utilizzando un kit immunoenzimatico disponibile in commercio (Cobas core VIA, Roche, Basilea, Svizzera). livello di cut-off Patologica è stato stabilito a 5 ng /mL per CEA siero analisi statistica

Il metodo statistico di Kaplan-Meier è stato utilizzato per analizzare le caratteristiche cliniche e ricorrenza.; differenze sono stati stimati con il log-rank test. I fattori prognostici sono stati esaminati da analisi univariata e multivariata (log-rank test per l'analisi univariata e rischi proporzionali di Cox modello di regressione, per passi all'indietro (condizionale LR) per l'analisi multivariata). I test esatto chi-quadrato e Fisher sono stati utilizzati per l'analisi statistica. Tutte le analisi statistiche sono state fatte con SPSS16.0. . Tutti i valori di P erano 2 dalla coda, e il livello di significatività è stato fissato a 0,05
Risultati
Caratteristiche cliniche
I 123 pazienti arruolati nello studio di età compresa tra 28 e 84 anni (media 57.11 anni, mediana, 59 anni), e il rapporto tra maschi e femmine era 82:41 (Tabella 1). Messa in scena è stata eseguita secondo la classificazione Tumor-Node-Metastasi (TNM) del Joint Committee on Cancer (AJCC, rivisto 1997). Ventiquattro tumori sono stati situati nel cardias, 3 nel fondo gastrico, 44 ​​nel corpus gastrica, 45 nel gastrico, 5 coinvolto l'intero stomaco, e 2 appartenevano al carcinoma gastrico residuo (Tabella 1) .table 1 clinicopatologico caratteristiche e CEA * espressione di mRNA rilevata mediante real-time RT-PCR
caratteristiche
numero totale
(N = 123)
CEA mRNA
valore P
positiva (n = 45)
negativo (n = 78)

Età
≤40
13
3 10
41-50
20
9
11
51-60
39
9
30
61-70
42
18
24
> 70
9 Pagina 6 3
0.063
Sex
Donna
41
12
29
Maschio
82
33
49
0,234
Tumore
T1 10
6 4
T2
16 3
13
T3
73
26
47
T4
24
10
14
0.001
linfonodo
N0
31
11
20
N1
43
15
28
N2
29 Pagina 8
21
N3
20
11
9
0,261
patologica TNM # stadio
I
16
7
9
II
21
6
15
III
51
17
34
IV
35
15
20
0,623
Istologia sottotipo
ben differenziato adenocarcinoma 3
1 2
moderatamente differenziato adenocarcinoma
27 7
20
mal adenocarcinoma differenziata
93
37
56
0,418
Siero CEA condizione
positivo
30
11
19
negativo
93
34
59
0.992
Ricorrenza
Sì
44
25
19
No
79
20
59
0.001
Modalità di recidiva
recidiva locale Pagina 8 Pagina 4 4
cavità addominale
9 Pagina 6 3
Fegato
8
5 3
pelvici
6 3
3
siti multipli 10
5
5
altri 3
2
1 0,959
* dell'antigene carcinoembrionario
# TNM denota tumore-node-metastasi
sensibilità di rilevazione del CEA mRNA mediante real-time RT-PCR
CEA mRNA è stato individuato in SW -480 e SC-7901 linee di cellule. Il limite inferiore di rilevamento è stata una concentrazione di 10 cellule tumorali per 10 7 linfociti. Conventional nested RT-PCR è stato impiegato per confermare la sensibilità del prodotto RT-PCR.
Espressione CEA mRNA nel sangue
espressione CEA mRNA è stato rilevato in 9 su 30 (30,0%) pazienti non tumorali, e la media corretto punteggio CEA mRNA era 7.5 (range 0-92,5). Il valore massimo di corretto punteggio CEA mRNA nei pazienti senza neoplasia era 92,5, quindi un valore di cut-off di 100 è stato utilizzato in questo studio. Usando questo valore soglia, 45 pazienti (36,6%) sono stati diagnosticati come CEA mRNA-positivo. Il tempo medio corretto CEA mRNA valutazione [(CEA mRNA /GAPDH mRNA) × 10 6] dei 123 pazienti era 37,510.0 (range, 0-3,695,652.1) copie figura 1 hanno mostrato la distribuzione di (CEA mRNA /GAPDH mRNA) × 10 6 in questo gruppo di pazienti. Figura 1 La distribuzione del livello di espressione di CEA. I mezzi Ratio (CEA mRNA /GAPDH mRNA) × 106. Considerando il rapporto tra alcuni pazienti sono stati pari a zero, abbiamo aggiunto 0,5 per il rapporto.
Relazione tra CEA mRNA espressione e clinicopatologici caratteristiche
espressione dell'mRNA CEA non correlano con età, sesso, stadio N, stadio TNM, sottotipo istologico e la condizione siero CEA (Tabella 1). Tuttavia, i pazienti con recidiva postoperatoria era significativamente più alta percentuale di CEA mRNA positivo rispetto a quelli senza recidiva del tumore (P = 0,001
) (Tabella 1). Inoltre, la profondità del tumore anche positivamente correlata con l'espressione di mRNA CEA (P
= 0,001).
Relazione tra recidiva e l'espressione di mRNA CEA nonché
siero CEA La modalità di recidiva comprende 8 recidive locali, 9 diffusione addominale esclusi i fegati, 8 metastasi epatiche, 6 metastasi pelvica, altri 3 siti metastasi e 10 più siti metastasi. Non vi è alcuna differenza significativa tra l'espressione di mRNA CEA e la modalità di recidiva (Tabella 1).
Malattia ricorrente è stato trovato in 44 dei 123 casi (35,8%). Venticinque di questi pazienti (56,8%) erano CEA mRNA-positivo. Al contrario, solo 14 pazienti con recidiva di malattia (31,8%) sono risultati positivi per preoperatoria CEA siero. Le specificità del CEA mRNA e siero CEA per indicare recidiva erano 74,7% e 79,9%, rispettivamente. (Tabella 2) .table 2 Confronto tra CEA * mRNA e CEA siero nel predire la recidiva

CEA mRNA
Siero CEA

Positive

Negative

Positive

Negative

Recurrence
Yes
25
19
14
30
No
20
59
16
63
P
0,001 0,152

X 2
12,088
2.050
Sensibilità (%) 56,8

31,8
Specificità (%) 74,7

79,7
* dell'antigene carcinoembrionario
univariata e multivariata analisi di sopravvivenza a 3 anni libera da malattia
La sopravvivenza a 5 anni è stata del 58,9% e 3 anni di sopravvivenza libera da malattia era 63,9%. Entrambe le analisi univariata e multivariata sono stati usati per valutare i fattori relativi alla sopravvivenza libera da malattia. Secondo l'analisi univariata, l'età, la profondità del tumore, metastasi linfonodali, grado istologico, stadio TNM, CEA mRNA positività e siero CEA positività erano significativamente correlati alla sopravvivenza libera da malattia (P = 0,031
, < 0.001, 0.001, 0.022, < 0,001, 0,001, 0,045, rispettivamente) (Tabella 3). L'analisi di regressione multivariata ha mostrato che solo il grado istologico e CEA mRNA positività sono stati fattori indipendenti per la sopravvivenza libera da malattia (P = 0.047
e 0.020, rispettivamente tabella 4). i tassi di sopravvivenza libera da malattia a tre anni per i pazienti CEA mRNA-positivi erano significativamente più bassi rispetto ai pazienti negativi CEA di mRNA (43,9% contro 74,1%, rispettivamente; p = 0,001
, figura 2) .table 3 L'analisi univariata di da malattia La sopravvivenza libera nel carcinoma gastrico
Parametro
sopravvivenza libera da malattia, P valoreA
Età
< 59 vs ≥59
0,031
genere
Maschio contro femmina
0,433
CEA mRNA
(+) vs. (-)
0.001
Serum CEA
(+) vs. (-)
0.045
grado istologico
Bene /moderatamente contro mal
0,022
pT
pTis /pT1 vs. pT2 /pT3 /pT4
< 0,001
pN
(+) vs. (-)
0.001
fase
1/2 contro 3/4
< 0.001 agenti chemioterapici adiuvanti

CAPOX contro mFOLFOX6 vs. Taxol + DDP vs. Taxol + 5-FU /CF
0,850
un log-rank test
Tabella 4 analisi multivariata della sopravvivenza libera da malattia nel carcinoma gastrico
Fattori

Caratteristiche
Hazard ratio
95% CI
P value

Unfavorable

Favorable

Age
≥59
<59
1.018
0.986-1.050
0.273
Histological grade
Poorly
Well/moderately
0.412
0.171-0.990
0.047
pT
2/3/4
Tis/1
1.673
0.100-8.690
0.947
pN
(+)
(-)
2.030
0.264-15.611
0.497
Stage
3/4
½
1.437
0.124-16.613
0.771
CEA mRNA
(+)
(-)
2.243
1,138-4,424
0,020
Serum CEA
(+)
(-)
1.130
0,582-2,194
0.717
CI, intervallo di confidenza; Pt, profondità di invasione tumorale
figura la sopravvivenza libera da malattia 2 dei pazienti secondo l'espressione di mRNA CEA. Tre anni di sopravvivenza libera da malattia del CEA pazienti mRNA-positivi era significativamente più bassa rispetto a quella dei pazienti CEA mRNA-negativi (43,9% contro 74,1%, rispettivamente; p = 0,001
).
Discussione
Il semi la natura -quantitative della tecnologia PCR tradizionale è reso difficile differenziare livelli basali di espressione genica nei tessuti normali da un aumento dei livelli di espressione genica nel tumore, aumentando così la preoccupazione per i risultati falsi positivi [17]. Nel nostro studio, real-time PCR di mRNA CEA è stato utilizzato per studiare la possibilità di sangue periferico come fonte per la rilevazione CTC e la previsione di recidiva del tumore nei pazienti carcinoma gastrico. Real-time quantitativa analisi CEA mRNA nei pazienti affetti da cancro è spesso eseguita in base a CEA mRNA positività, che è determinato con un livello di cut-off [13]. CEA mRNA può essere rilevato in pazienti con malattia benigna e volontari sani, così i livelli di taglio sono solitamente determinata dalla massima espressione in pazienti non maligne [18, 19]. Setoyama T et al. ha rilevato che il valore massimo di CEA mRNA nei pazienti senza neoplasia era 8.6, hanno quindi impostare il valore di cut-off come 9.0 [20]. Schuster R et al. [21] usato anche il valore massimo di fondo volontario sano come il valore di cut-off per la rilevazione CEA mRNA nei pazienti affetti da cancro del colon-retto. Nel nostro studio, abbiamo usato anche il valore massimo di corretto punteggio CEA mRNA nei pazienti senza malignità come valore cut-off. Attraverso la creazione di un valore soglia di 100 per normalizzati i livelli di CEA di mRNA, possiamo distinguere i malati di cancro nei pazienti, non-cancro e, di conseguenza, considerare con maggiore fiducia l'espressione di mRNA CEA come marcatore di cellule tumorali circolanti.
Abbiamo scoperto che 10 i pazienti con tumore T1, 6 pazienti hanno avuto positivi espressione CEA-mRNA. Ma nessun record di recidiva è stato trovato in 10 pazienti. Sembra che non vi è alcuna relazione tra l'espressione CEA mRNA e recidiva in T1 tumore. E 'difficile spiegare l'alto tasso positivo di CEA-mRNA nei pazienti T1, ma abbiamo scoperto che l'espressione di mRNA CEA è stata bassa nei 6 pazienti T1, che vanno da 4320 copie a 44 600 copie. Ikeguchi M [22] ha riferito che il 12,5% della fase I pazienti con carcinoma gastrico espresso CK20 mRNA e hanno ritenuto che è stata indotta da una piccola espressione CK20 nelle cellule bianche del sangue periferico.
Alcuni rapporti hanno valutato la condizione di CTC in gastrica pazienti affetti da carcinoma prima del trattamento. Ikeguchi e Kaibara riportato [23] che non riuscivano a trovare eventuali cellule tumorali nel sangue periferico di pazienti non trattati carcinoma gastrico. Gli autori hanno ipotizzato che le cellule tumorali non sembrano migrare facilmente al sangue periferico da tumori primari in pazienti con carcinoma gastrico non trattata. Al contrario, Miyazono et al.
[24] hanno mostrato che il tasso di positivo per il CEA mRNA dei pazienti con carcinoma gastrico è stato del 8,8% prima del funzionamento. La presenza di CTC prima del trattamento e il suo rapporto con l'esito clinico rimane così controverso. In questo studio, abbiamo valutato il significato clinico di CTC nel sangue prima del funzionamento utilizzando real-time RT-PCR per rilevare l'espressione di mRNA CEA. Il tasso positivo di CEA mRNA prima di qualsiasi trattamento è 36,6%. file aggiuntivo 1 mostra il tasso positivo di marcatori mRNA di letteratura per il rilevamento delle cellule tumorali mediante real-time RT-PCR.
O'Sullivan et al.
[25] ha suggerito che la diagnosi preoperatoria di micrometastasi può riflettere sia transitorio spargimento di cellule, potenziale metastatico, o malattia residua. Nel presente studio, abbiamo scoperto che CTC sono stati rilevati nel sangue prima del trattamento in relazione alla ricorrenza. Diversi studi hanno dimostrato che la diagnosi preoperatoria delle cellule tumorali circolanti è stato un chiaro indicatore di scarsa sopravvivenza del paziente, perché molti casi con le cellule tumorali circolanti nel preoperatorio hanno mostrato sia estesa metastasi linfonodali o metastasi a distanza, quindi la prognosi di questi pazienti era povera [26-28 ]. In questo studio, abbiamo scoperto che l'espressione di CEA mRNA era significativamente correlata alla malattia recidiva. Inoltre, i pazienti con positivi CEA mRNA avevano più breve di 3 anni esito sopravvivenza libera da malattia. L'incidenza di recidiva era significativamente più alta nei pazienti positivi per il CEA mRNA che in quelli negativi.
La sensibilità di espressione dell'mRNA CEA per predire ricorrenza è solo del 56,8%. Diciannove dei settantotto pazienti (24,4%) con l'espressione negativa CEA mRNA ha avuto una recidiva del tumore. Setoyama et al.
[20] ha mostrato che 8 su 69 (11,6%) pazienti con carcinoma esofageo con negativo espressione dell'mRNA CEA hanno avuto recidive del tumore, e 6 pazienti avevano linfonodo recidiva. Una spiegazione di uso frequente di errori di rilevamento è che le cellule circolanti non sono distribuiti in modo omogeneo e non continuo capannone in circolazione [29, 30]. Inoltre, il marcatore ideale (nessuna espressione illegittima nel sangue, alta espressione in cellule tumorali) non è stata ancora trovata. Al di là di CEA mRNA, altre trascrizioni, tra cui citocheratina (CA) 18 [31], metalloproteinasi della matrice (MMP) -7 [32], CK 20 [33], Urokinase di tipo recettore attivatore del plasminogeno (uPAR), CK 19 e CK 7 [ ,,,0],34], sono stati provati come potenziali marker di CTC. Tuttavia, il capannone cellule tumorali dovrebbe essere un evento relativamente raro. Così, se il sangue periferico è un vano adatto per la diagnosi precoce di micrometastasi è ancora controverso. Altri comparti come il midollo osseo o cavità addominale sono noti per fornire tassi di rilevamento superiori, probabilmente a causa di un maggior numero di cellule tumorali presenti [35-37].
Un'altra questione importante è falsa espressione positiva del CEA mRNA. Venti pazienti (44,4%) che hanno avuto espressione positiva mRNA CEA non registrare recidive nel follow-up. Uno dei motivi potrebbe essere il relativamente breve periodo di follow-up.
In alternativa, questo può essere abbastanza ragionevole perché poche cellule di carcinoma capannone nel flusso sanguigno riescono a stabilire malattia metastatica [25]. Queste cellule tumorali circolanti potrebbero non connettersi a organi distanti e potrebbero non crescere. Recentemente, Méhes et al.
[38] hanno studiato la morfologia delle cellule tumorali circolanti e ha scoperto che la maggior parte delle cellule del cancro al seno in circolazione era in uno stato di apoptosi. Nel sangue periferico di pazienti affetti da cancro, è stata osservata la presenza del complesso cellule linfociti tumorali [39]. Questi risultati indicano che i macrofagi o linfociti potrebbero svolgere un ruolo importante nella induzione di apoptosi circolanti cellule tumorali e la antitumorale risposta immunitaria dell'ospite. Questi macrofagi immunizzati possono sensibilizzare i linfociti T citotossici dell'ospite, ei linfociti T sensibilizzati possono attaccare le residue lesioni tumorali micrometastatica dei pazienti [23]. Per chiarire questa ipotesi, sono necessarie ulteriori indagini per quanto riguarda la correlazione tra l'esistenza di cellule tumorali circolanti e la risposta dell'ospite immunitaria.
L'attuale studio è stato analisi retrospettiva, ed i pazienti che dovrebbero ricevere la chemioterapia adiuvante non sono stati fissati prima del tempo. In generale, i pazienti che avevano linfonodi positivi sono stati raccomandati per ricevere la chemioterapia adiuvante. Fino ad ora, non ci sono criteri standard per la chemioterapia adiuvante del cancro gastrico in Cina. Il nostro studio ha mostrato che il numero di copie CEA mRNA nel sangue periferico alla diagnosi iniziale era significativamente associata a recidiva di malattia in pazienti con adenocarcinoma gastrico. Nel punto di vista della ricorrenza, abbiamo quindi suggeriscono che i pazienti che hanno positivo espressione dell'mRNA CEA preoperatorio ricevono chemioterapia adiuvante dopo resezione radicale
. Conclusioni
In questo studio, la sensibilità del CEA mRNA era superiore a quello del CEA nel siero. Inoltre, secondo l'analisi di regressione multivariata, CEA mRNA positività era un fattore indipendente di recidiva. L'attuale studio ha confermato che un tale metodo è stato promettente per la diagnosi precoce del CTC in pazienti con carcinoma gastrico prima del trattamento; i pazienti con positivi CEA mRNA possono avere un rischio più elevato di recidiva anche dopo resezione curativa. Tuttavia, un ampio studio prospettico randomizzato è garantito per definire il ruolo di CEA mRNA rilevamento nel sangue
Abbreviazioni
RT-PCR:.
Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction

CTC:
circolanti cellule tumorali
CEA:
carcinoembrionario
CA19-9:
Carboidrati Antigen 19-9
TNM:
Tumore-Node-metastasi
AJCC:
Joint Committee on Cancer
GAPDH:
gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi
MMP-7:
Matrix Metalloproteinase-7


dell'uPAR:.
urokinase-tipo plasminogeno Receptor
Dichiarazioni
Ringraziamenti
Questi lavoro è stato finanziato dalla National Natural Science Foundation della Cina borsa di 30.672.408, Guangzhou Ufficio della Scienza e della Tecnologia concedere 2006Z3-E0041 e Sun Yat-sen University 985 Programma Fondo Initiation (Cina). Abbiamo gratitudine Ringraziamo i membri del personale del Dipartimento di Oncologia Medica e GI Chirurgia Oncologica del Sun Yat-sen University Cancer Center per il loro suggerimento e di assistenza
materiale supplementare elettronica
12967_2009_529_MOESM1_ESM.DOC sui file. 1: I dati di letteratura per rilevamento delle cellule tumorali mediante real-time RT-PCR di marcatori di mRNA. Esso mostra il tasso positivo di marcatori mRNA di letteratura per il rilevamento delle cellule tumorali mediante real-time RT-PCR. (DOC 58 KB) degli autori fascicoli presentati originali per
di seguito sono riportati i link ai file degli autori originali inviati per le immagini.

• espressione del DNA della proteina polymeraseη predice la risposta al trattamento e la sopravvivenza dei pazienti con adenocarcinoma gastrico metastatico trattati con l'espressione chemotherapy
• L'efficacia dell'ecografia nel verificare il posizionamento di un tubo nasogastrico in pazienti con bassa coscienza in un'emergenza center