Detection karsinoembryonista antigeenin lähetti-RNA veren kvantitatiivisen reaaliaikaisen käänteistranskriptaasi-polymeraasiketjureaktio ennustaa toistumisen mahalaukun adenokarsinoomaa

Havaitseminen syöpä -antigeeni lähetti-RNA veren käyttäen kvantitatiivisen tosiaikaisen käänteistranskriptaasi-polymeraasiketjureaktio ennustaa toistumisen mahalaukun adenokarsinooman
Abstract
tausta
olemassaolo verenkierrossa olevia kasvainsoluja (CTC) perifeerisessä veressä kuin indikaattori kasvaimen uusiutumisen ei ole selvästi vahvistettu, erityisesti mahasyövän potilaille. Teimme Retrospektiivinen analyysi suhdetta CTC ääreisverenkierrossa alkudiagnoosin ja ennusteeseen viittaavia havaintoja potilailla, joilla on mahalaukun syöpä. Tool Menetelmät
Verinäytteet saatiin 123 mahakarsinoo- potilaiden alkudiagnoosin. mRNA uutettiin ja monistettiin syöpä -antigeeni (CEA) mRNA havaitseminen käyttäen reaaliaikaista RT-PCR. Säännöllinen 3 kuukauden seurannassa tutkimukset sisältyvät seerumin CEA mittaukset ja kuvantaminen.
Tulokset
äänikynnyksen korjattu CEA mRNA maalin [(CEA mRNA /GAPDH mRNA) × 10 6] asetettiin 100. neljäkymmentäviisi 123 potilasta (36,6%) oli positiivisia CEA mRNA: n ilmentymisen. CEA-mRNA ilmaisu korreloi merkitsevästi T vaiheessa ja leikkauksen jälkeisen uusiutumisen tila (P
= 0,001). Uusiutuva sairaus löydettiin 44 123 tapausta (35,8%), ja 25 näistä (56,8%) oli positiivisia CEA-mRNA: n. Näistä potilaista, CEA-mRNA oli herkempi kuin seerumin CEA osoittaa toistumisen. Kolmen vuoden tautivapaan elinajan potilaiden positiivisia CEA-mRNA oli merkittävästi huonompi kuin potilaiden negatiivisia CEA-mRNA (P
< 0,001). Vain histologisia asteen ja CEA-mRNA positiivisuus olivat riippumattomia tekijöitä tautivapaan elinajan monimuuttujamenetelmin.
Johtopäätökset
CEA-mRNA kopioluvun ääreisverenkierrossa alkudiagnoosin oli merkitsevästi yhteydessä tauti uusiutuu mahalaukun adenokarsinoomaa potilailla. Reaaliaikainen RT-PCR havaitseminen CEA-mRNA-tasojen alkudiagnoosin näyttäisi olevan lupaava ennustaja taudin uusiutumisen mahalaukun adenokarsinooman potilailla.
Tausta
Mahasyöpää edelleen tärkein syy syövän kuolleisuus kaikkialla maailmassa koko 20-luvulla. Ainoa todistettu parantava hoito on kirurginen resektio kaikki brutto ja mikroskooppisia vaurioita. Vaikka meneillään parantava gastrectomy, mukaan lukien laajennetun imusolmukedissektiossa ja adjuvanttihoitoa, syöpä toistuu niin alueellisella kuin kaukainen sivustoja suurin osa potilaista [1]. Diagnoosi toistumisen yhteisten seurannan protokollien tavallisesti tehdään myöhäisessä vaiheessa, joka, siinä määrin, sulje pois mahdollisuutta tehokasta hoitoa [2]. Valvonta kiertävien tuumorisolujen (CTC) näyttäisi tarjoavan paremmat mahdollisuudet aiempien diagnosointiin uusiutuva sairaus.
Käsite tutkii metastaattisen prosessin ääreisverenkierron alkunsa 19th century, kun T.R. Ashworth ensin kuvattu ilmiö CTC, ja S. Paget hypoteesin ei-satunnainen kuvio syövän etäispesäkkeidenmuodostuksen (jäljempänä "siemenet ja maaperä" teoria) [3, 4]. Sen jälkeen, pahanlaatuinen luonne CTC vahvistettiin osoittamalla, että niillä on kasvaimen erityisiä kromosomipoikkeamakoe [5, 6], ja että ne kasvavat ex vivo solulinjoja pahanlaatuinen fenotyyppi [7]. Useita lähestymistapoja havaita CTC on kuvattu, ja ne voidaan luokitella PCR-menetelmiä ja sytometrinen menetelmät [8].
With kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR-tekniikoita [9], tarkkaa mittaamista kohdesekvenssin on tullut mahdolliseksi . Kvantitatiivinen PCR tarjoaa tutkijat paitsi teknisiä etuja, mutta myös applicative etuja, kuten määrittely raja-arvojen osoittavat mRNA ekspressiotasot kliinistä merkitystä syöpäpotilailla verrattuna terveisiin koehenkilöihin. Reaaliaikainen PCR myös tarjoaa mahdollisuuksia korreloivat kohde-sekvenssin kuorman kliinisten tutkimusten tulosten kanssa [10], tai terapian vasteena. [11]
CEA, alunperin kuvattu kasvaimeen liittyvän paksusuolen syövän antigeeni, kloonattiin vuonna 1987 ja on nyt tunnustettu jäsenenä immunoglobuliiniproteiiniin superperheen [12]. Useissa tutkimuksissa on todettu havaitseminen mahalaukun solujen veren [13], luuytimen [14], ja vatsakalvon pesu [15] mahalaukun syöpäpotilaiden käyttäen reaaliaikaista PCR CEA-mRNA.
Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tehon arvioimiseksi CEA mRNA reaaliaikainen PCR-tekniikka varhaista havaitsemista kasvaimen uusiutumisen. Tämän tavoitteen, suhde kliinisen toistuminen ja veren CEA-mRNA preoperatively tutkittiin mahalaukun adenokarsinooman potilailla. Tool Menetelmät
Potilaille
Kirjallinen suostumus saatiin jokaisen potilaan käytöstä verinäytteitä tutkimuksen mukaisesti institutionaalisten ohjeiden meidän sairaalassa. Helmikuusta 2002 joulukuuhun 2006 yhteensä 123 peräkkäisen mahalaukun adenokarsinoomaa sairastavien potilaiden Cancer Center of Sun Yat-sen University, otettiin tähän tutkimukseen. Kaikki potilaat saivat radikaali resektio ja D2 imusolmukkeiden. Vuokrasopimuksen 15 imusolmukkeet oli käytettävissä havaitsemiseen. Ei vatsakalvon levittäminen löytynyt. Selkeä kirjaa seerumin CEA muutoksen ja kuvantamisen arviointi ennen leikkausta ja kolmen kuukauden välein leikkauksen jälkeen tarvittiin. Potilailla, joilla oli positiivinen imusolmuke suositeltiin saamaan adjuvanttihoitoa mutta lopulta vain kahdeksankymmentäkolme potilaalle tehtiin adjuvanttihoitoa. Hoito-ohjelmien mukana CAPOX (Capecitabine + Oksaliplatiini, 16 tapausta, jossa mediaani sykli 4), folfox6 (56 tapausta, joiden mediaani sykli 6), taksoli + sisplatiini (4 tapausta, jossa mediaani sykli 4), taksoli + 5FU /CF (fluorourasiili /Leucovorin, 7 tapauksessa, jossa mediaani sykli 6). Uusiutuva sairaus, kuten paikallisia uusiutumisen ja etäispesäkkeitä, havaittiin tietokonetomografia tutkimus. Uusia vaurioita havaitaan kuvantamisvaihtoehtoa seurannassa nimitykset pidettiin toistumisen. Biopsia ei tehty rutiininomaisesti määrittää histologisia toistumisen. Kaikki kuvantaminen arvioitiin vähintään kaksi riippumatonta tarkkailijaa, mukaan lukien radiologit. Mediaani seuranta-aika oli 37,0 kuukautta (vaihteluväli 3,0-73,6 kuukausi).
Verinäytteet
Verinäytteet otettiin alkudiagnoosin yksi tai kaksi päivää ennen leikkausta. Ensimmäinen 3 ml verta heitettiin pois estämään epidermaalinen saastumisen, ja sitten 5 ml: n verinäyte saatiin ääreislaskimoon. Aäreisverinäytteiden saatu 30 ei-syöpäpotilaan vapaaehtoiset käytettiin negatiivisina kontrolleina.
Kaikki potilaat edellyttäen kirjallinen lupa; saimme erillinen suostumus käyttöön verinäytteen. Tutkimus hyväksyntä on saatu riippumattomien eettisten toimikuntien Cancer Center of Sun Yat-Senin yliopistossa. Tutkimus tehtiin mukaisesti eettisiä Maailman lääkäriliiton Helsingin julistuksen.
Pre-processing verinäytteiden
verinäytteet kerättiin EDTA-sisältäviä putkia. Näytteen käsittely suoritettiin 2 tunnin kuluttua verta peruuttamisen. Veri siirrettiin 30 ml: n Falcon-putkeen ja sentrifugoitiin 1800 rpm: llä huoneen lämpötilassa 20 minuuttia. Seerumi poistettiin, ja solut suspendoitiin uudelleen 5 ml: aan suolaliuosta ja 0,3 ml RNA myöhemmin liuos. Sekoituksen jälkeen hyvin, verisolujen seosta pidettiin yön yli 4 ° C: ssa ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes ne käytettiin.
RNA: n uutto ja cDNA-synteesi
Kokonais-RNA perifeerisen veren näytteitä uutettiin käyttäen RNAprep Cell Kit (Tiangen , Peking, Kiina) seuraavat protokollaa valmistajan toimittamat. RNA eheys tarkistettiin elektroforeesilla ja kvantitoitiin absorptiolla 260 ja 280 nm: n ja UV-näkyvän spektrofotometrillä (Beckman Coulter Du ® 800, Fullerton, CA). Käänteistranskriptioon, 1 ug kokonais-RNA: ta, 1 ui Oligo (dT) 15 ja 1 ui dNTP-aineet laimennettiin 10 ui RNaasi-vapaata vettä, inkuboitiin 10 minuuttia 37 ° C: ssa ja 1 ui 25 mmol /l EDTA: ta lisättiin. 11 ui: n erä reaktioseosta inkuboitiin 10 minuutin ajan 65 ° C: ssa, ja nopeasti jäähdytettiin jäillä 2 minuutin ajan. cDNA säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes ne käytettiin. cDNA-synteesi suoritettiin käyttäen TIANScript M-MLV-menetelmällä (Tiangen Biotech, Peking, Kiina).
Solulinjat
valmistelemiseksi CEA-spesifisten RT-PCR, kahta solulinjaa, SW-480 (koolonisyöpäsolulinja ) ja SC-7901 (mahalaukun syöpä solulinja) käytettiin. Lymfosyytit kerättiin terveiltä vapaaehtoisilta ilman epiteelin maligniteetti. Jälkeen lymfosyytit eristettiin perifeerisestä verestä gradienttisentrifugoinnilla, mononukleaaristen solujen kerros otettiin talteen. Solulinjoja sarjalaimennetun (10-kertaisesti) 2 x 10 7 5 x 10 7 lymfosyyttien antaa karsinoomasolulinjoissa: lymfosyyttien suhteet vaihtelevat 1:10-01:10 7.
CEA mRNA Analyysi reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR
Kvantitatiivinen PCR suoritettiin käyttäen Sequence Detector System, ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System). PCR-alukkeita ja Taqman suunniteltiin käyttäen Primer Express 1.0 ohjelma. Tässä määrityksessä housekeeping-geeni glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) käytettiin sisäisenä kontrollina normalisoida vaihtelut eheyden ja RNA: n kokonaismäärä uutettiin. Reaaliaikainen PCR-määritykset GAPDH ja CEA tehtiin erillisissä putkissa. CEA-mRNA arvot oikaistaan ​​GAPDH mRNA arvoihin, ja suhteellinen CEA mRNA tulokset esitettiin (CEA mRNA /GAPDH mRNA) x 10 6 jokaisesta näytteestä.
5 ui näytettä cDNA käytettiin reaali PCR on 20 ui reaktioseosta, joka koostuu 10 pmol sopivien alukkeiden (Invitrogen yhteistyö, Japani) ja 5 pmol TaqMan koetin (Invitrogen yhteistyö, Japani). Reportteriväristä (6-karboksi-fluoreseiini: FAM) on liitetty kovalenttisesti 5'-päähän koettimen ja vaimenninväri (6-karboksi-tetrametyyli-rodamiini: TAMRA) on liitetty 3'-päähän koettimen. Lämpötilaprofiili käytettiin monistamiseen oli seuraava: denaturaatio 1 sykli 95 ° C: ssa 10 minuuttia, minkä jälkeen 40 sykliä 95 ° C: ssa 10 sekunnin ajan, 60 ° C: ssa 15 sekunnin ajan ja 72 ° C: ssa 5 sekunnin ajan. Kvantifiointi tehtiin ABI Prism 7500 Sequence ilmaisin järjestelmään. Kukin joukko näytteitä ja sarjatuotannossa laimennettu ulkoisen valvonnan monistettiin kahtena kappaleena. Keskimääräinen arvo kaksoiskappaleet käytettiin kvantitatiivinen arvo.
CEA-erityinen oligonukleotidiprimeri suunniteltiin pohjalta raportin Gerhard et al.
[16]. Sekvenssit olivat: 5'-TGTCGGCATCATGATTGG-3 '(sense) ja 5'-GCAAATGCTTTAAGGAAGAAGC-3' (antisense). Fluoresoiva ja LC-Red Koetinsekvenssit käytetään CEA tunnistamiseen olivat: 5'-CCTGAAATGAAGAAACTACACCAGGGC-fluoreseiini ja 5'-LC-Red 640-GCTATATCAGAGCAACCCCAACCAGC-fosfaatti.
Reaaliaikainen PCR valvonta saatiin aikaan mittaamalla fluoresenssi-signaalin lopussa lämpökäsittelytoiminnan vaiheen kunkin syklin. Aluke sekvenssejä käytettiin GAPDH vahvistus olivat: 5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3 '(sense) ja 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' (antisense). Koetinsekvenssit käytetään GAPDH tunnistamiseen olivat: 5'-TCAACAGCGACACCCACTCCT-fluoreseiini ja 5'-LC-Red 640-CACCTTTGACGCTGGGGCT-fosfaatti.
Määritys CEA seeruminäytteistä
Leikkausta edeltävä seerumi näytteitä käytettiin myös määrityksiin tuumorimarkkeri CEA käyttäen kaupallisesti saatavilla entsyymi-immuno- (Cobas Core EIA, Roche, Basel, Sveitsi). Patologinen sulku taso vahvistettiin 5 ng /ml seerumin CEA.
Tilastolliset analyysit
Kaplan-Meier tilastollista menetelmää käytettiin analysointiin kliinisiä piirteitä ja uusiutuminen; erot arvioitiin kanssa log-rank-testi. Ennustetekijöiden tutkittiin yhden ja usean analyysit (log-rank testi yhden muuttujan analyysiin ja Coxin suhteellisen vaarat regressiomallin, taaksepäin vaiheittain (ehdollinen LR) varten monimuuttujamenetelmin). Chi-neliön ja Fisherin tarkka testejä käytettiin tilastolliseen analyysiin. Kaikki tilastolliset analyysit tehtiin kanssa SPSS16.0. Kaikki P-arvot olivat 2-tailed, ja taso merkitys asetettiin 0,05.
Tulokset
Kliiniset piirteet
123 potilasta otettiin tutkimukseen vuotiaiden 28-84 vuotta (keskiarvo 57,11 vuotta mediaani, 59 vuotta), ja suhde naaraiden oli 82:41 (taulukko 1). Staging suoritettiin kasvain-Node-Metastasis (TNM) luokittelu amerikkalaisen sekakomitean Cancer (AJCC, uudistettu 1997). Kaksikymmentäneljä kasvaimia sijaitsivat cardia, 3 mahalaukun silmänpohjan, 44 mahalaukun corpus, 45 mahalaukkua, 5 mukana koko vatsan, ja 2 kuului jäännöksen mahakarsinoo- (taulukko 1) .table 1 ennusteeseen viittaavia ominaisuudet ja CEA * mRNA: n ilmentymisen havaittiin reaaliaikaisella RT-PCR
ominaisuudet
kokonaismäärä
(N = 123)

CEA-mRNA
P arvo
Positiivinen
(n = 45)
Negatiivinen
(n = 78) B
Ikä
≤40
13
3
10
41-50
20
9
11
51-60
39
9
30
61-70
42
18
24
> 70
9
6
3
0,063
Sex
Nainen
41
12
29
Mies
82
33
49
0,234
Kasvain
T1
10
6
4
T2
16
3
13
T3
73
26
47
T4
24
10
14
0,001
Imusolmuke
N0
31
11
20
N1
43
15
28
N2
29
8
21
N3
20
11
9
0,261
Patologinen TNM # vaiheessa
I
16
7
9
II
21
6
15
III
51
17
34
IV
35
15
20
0,623
Histologia alatyypin
No eriytetty adenokarsinooma
3
1
2
Kohtuullisen eriytetty adenokarsinooma
27
7
20
Huonosti eriytetty adenokarsinooma
93
37
56
0,418
Serum CEA kunnossa
Positiivinen
30
11
19
Negatiivinen
93
34
59
0,992
uusiutuminen
Kyllä
44
25
19
Ei
79
20
59
0,001
Vaadittavat toistumisen
Paikalliset toistumisen
8
4
4
vatsaonteloon
9
6
3
Maksa
8
5
3
lantion
6
3
3
Useita sivustoja
10
5
5
muut
3
2
1
0,959
* Karsinoembryonaalinen antigeeni
# TNM tarkoittaa kasvain-solmu-etäpesäke
Tunnistusherkkyys CEA mRNA reaaliaikaisella RT-PCR
CEA-mRNA havaittiin SW -480 ja SC-7901-solulinjat. Alempi havaitsemisraja oli pitoisuus 10 kasvainsolujen kohti 10 7 lymfosyyttejä. Tavanomainen sisäkkäisiä RT-PCR: ää käytettiin vahvistamaan herkkyyden RT-PCR-tuote.
CEA-mRNA: n ekspressio veressä
CEA-mRNA: n ekspressiota havaittiin 9 30 (30,0%) ei-syöpäpotilaita, ja keskimääräinen korjattu CEA mRNA tilanne oli 7,5 (vaihteluväli 0-92,5). Suurin arvo korjataan CEA mRNA pisteet potilailla, joilla ei maligniteetin oli 92,5, joten raja-arvo 100 käytettiin tässä tutkimuksessa. Käyttämällä tätä raja-arvon, 45 potilasta (36,6%) diagnosoitiin CEA-mRNA-positiivisia. Keskimääräinen korjattu CEA mRNA pisteet [(CEA mRNA /GAPDH mRNA) × 10 6] 123 potilasta oli 37,510.0 (alue, 0-3,695,652.1) kappaletta Kuva 1 osoitti jakautuminen (CEA mRNA /GAPDH mRNA) x 10 6 tässä potilasryhmässä. Kuva 1 jakauma CEA ekspressiotason. Suhde välineet (CEA mRNA /GAPDH mRNA) x 106. suhteuttamalla joillakin potilailla oli nolla, lisäsimme 0,5 suhdetta.
Väliset CEA mRNA ilmaisun ja viittaavia tekijöitä
CEA-mRNA ilmaisu ei korreloinut ikä, sukupuoli, N vaiheessa TNM, histologisia alatyyppi ja seerumin CEA ehto (taulukko 1). Kuitenkin potilailla, joilla on leikkauksen jälkeinen toistuminen oli huomattavasti suurempi prosenttimäärä CEA mRNA positiivisia kuin ilman kasvaimen uusiutumisen (P
= 0,001) (taulukko 1). Sitä paitsi, kasvain syvyys myös korreloi positiivisesti CEA mRNA: n ilmentymisen (P
= 0,001).
Suhde toistuminen ja CEA mRNA: n ilmentymisen sekä seerumin CEA
tila toistuminen sisältää 8 paikallisen uusiutumisen, 9 vatsan levittäminen paitsi maksa, 8 maksan etäpesäke, 6 lantion etäpesäke, 3 muita sivustoja etäpesäke ja 10 useita sivustoja etäpesäke. Ei ole mitään merkittävää eroa CEA-mRNA: n ilmentymisen ja tilan toistumisen (taulukko 1).
Toistuva tauti havaittiin 44 123 tapausta (35,8%). Kaksikymmentäviisi näistä potilaista (56,8%) oli CEA mRNA-positiivisia. Sitä vastoin vain 14 potilasta, joilla on uusiutuva sairaus (31,8%) oli positiivisia preoperative seerumin CEA. Erityispiirteet CEA-mRNA ja seerumin CEA osoittamaan uusiutumisen olivat 74,7% ja 79,9%, tässä järjestyksessä. (Taulukko 2) .table 2 vertailu CEA * mRNA ja seerumin CEA ennustamisessa uusiutumisen

CEA-mRNA
Seerumi CEA

Positive

Negative

Positive

Negative

Recurrence
Yes
25
19
14
30
Ei
20
59
16
63
P
0,001
0,152
X
2
12,088
2,050
Herkkyys (%) B 56,8
31,8
spesifisyys (%) B 74,7
79,7
* Karsinoembryonaalinen antigeenin
yhden ja usean analyysit 3 vuoden tautivapaan elinajan
5 vuoden kokonaiselossaoloaika oli 58,9% ja 3-vuoden taudista vapaa eloonjääminen oli 63,9%. Sekä yhden ja usean analyysejä käytettiin arvioimaan liittyviä tekijöitä tautivapaan elinajan. Mukaan univariate analyysissä iän, kasvaimen syvyys, solmukohtien etäpesäkkeitä, histologinen luokka, TNM, CEA-mRNA positiivisuus ja seerumin CEA positiivisuus merkittävästi liittyvät taudista vapaan eloonjäämisen (P
= 0,031, < 0,001, 0,001, 0,022, < 0,001, 0,001, 0,045 vastaavasti) (taulukko 3). Monimuuttuja regressio analyysi osoitti, että ainoastaan ​​histologisia laatu ja CEA-mRNA positiivisuus olivat riippumattomia tekijöitä tautivapaan elinajan (P
= 0,047 ja 0,020, vastaavasti, taulukko 4). Kolmen vuoden tautivapaan eloonjäämisasteesta CEA-mRNA-positiivisia potilaita olivat merkittävästi pienempiä kuin CEA-mRNA negatiivisella potilaalla (43,9% vs. 74,1%, vastaavasti, P
= 0,001, kuva 2) .table 3 Univariate analyysi taudista elinaika mahakarsinoo-
Parameter
Tautivapaa elinaika, P arvoA
Age
< 59 vs. ≥59
0,031
Sukupuoli
Mies vs. nainen
0,433
CEA mRNA
(+) vs. (-) B 0,001
Serum CEA
(+) vs. (-)
0,045
histologinen arvosana
No /kohtalaisen vs. huonosti
0,022
pT
pTis /pT1 vs. pT2 /pT3 /pT4
< 0,001
pN
(+) vs. (-) B 0,001
Stage
1/2 vs. 3/4
< 0,001
adjuvanttihoitoa aineita
CAPOX vs. mFOLFOX6 vs. Taxol + DDP vs. Taxol + 5FU /CF
0,850
Log-rank test
Taulukko 4 monimuuttuja-analyysi taudista vapaan eloonjäämisen mahakarsinoo-
Factors
Ominaisuudet
Riskisuhde
95% CI
P value

Unfavorable

Favorable

Age
≥59
<59
1.018
0.986-1.050
0.273
Histological grade
Poorly
Well/moderately
0.412
0.171-0.990
0.047
pT
2/3/4
Tis/1
1.673
0.100-8.690
0.947
pN
(+)
(-)
2.030
0.264-15.611
0.497
Stage
3/4
½
1.437
0.124-16.613
0.771
CEA mRNA
(+) B (-) B 2,243
1,138-4,424
0,020
Serum CEA
(+) B (-) B 1.130
0,582-2,194
0,717
CI, luottamusväli; pT, syvyys kasvaimen invaasion
Kuva 2 Tautivapaa elinaika potilaiden mukaan CEA mRNA ilmaisun. Kolmen vuoden tautivapaan elinajan CEA-mRNA-positiivisia potilaita oli merkitsevästi alhaisempi kuin CEA-mRNA-negatiivisella potilaalla (43,9% vs. 74,1%, tässä järjestyksessä; P
= 0,001).
Keskustelu
semi -quantitative luonne perinteisiä PCR-teknologia on tehnyt vaikeaksi erottaa perustason geeniekspressiotasot normaaleissa kudoksissa lisääntyneestä geeniekspressiotasot syövän, mikä lisää huolta vääriä positiivisia tuloksia [17]. Tutkimuksessamme reaaliaikainen PCR CEA mRNA käytettiin tutkimaan mahdollisuutta ääreisverenkierron lähteenä CTC havaitsemista ja ennustamista syövän uusiutumisen mahakarsinoo- potilailla. Reaaliaikainen kvantitatiivinen CEA-mRNA analyysi syöpäpotilailla suoritetaan usein perustuu CEA mRNA positiivisuus, joka määritetään käyttäen cutoff taso [13]. CEA-mRNA voidaan havaita potilailla, joilla on hyvänlaatuinen sairaus sekä terveillä vapaaehtoisilla, joten sulku tasot määritetään yleensä enintään ilmentyminen hyvänlaatuisen potilaille [18, 19]. Setoyama T et ai. havaitsivat, että maksimiarvo CEA mRNA potilailla, joilla ei maligniteetin oli 8,6, ne siis asettaa raja-arvon kuin 9,0 [20]. Schuster R et al. [21] käytetään myös maksimiarvo terveen vapaaehtoisen tausta kuin raja-arvo CEA mRNA havaitseminen peräsuolen syöpäpotilailla. Tutkimuksessamme olemme myös käytetty enimmäisarvo korjatun CEA mRNA pisteet potilailla, joilla ei maligniteetti kuin kynnysarvon. Luomalla raja-arvo 100 normalisoidun CEA-mRNA-tasot, voidaan erottaa syöpäpotilailla ei-syöpäpotilaita ja siten varmemmin harkita ilmentymistä CEA-mRNA: n markkerina verenkierrossa olevia kasvainsoluja.
Olemme havainneet, että 10 potilaalla on T1 kasvain, 6 potilaalla oli positiivinen CEA-mRNA: n ekspression. Mutta ei ole mitään tietoa toistuminen havaittiin 10 potilaalla. Näyttää siltä, ​​että ei ole mitään suhdetta CEA mRNA ilmaisun ja uusiutumisen T1 kasvain. On vaikea selittää suuren positiivisten määrä CEA-mRNA T1 potilailla, mutta huomasimme, että CEA-mRNA alhainen 6 T1 potilaita, jotka vaihtelevat 4320 kappaletta 44 600 kappaletta. Ikeguchi M [22] ilmoitti, että 12,5%: n vaiheen I mahakarsinoo- potilaat ilmaisivat CK20 mRNA ja he katsoivat, että aiheutettiin pieni CK20 ilme reuna valkosoluja.
Harva raportit ovat arvioineet kunnon CTC maha- kohdunkaulan potilaille ennen hoitoa. Ikeguchi ja Kaibara raportoitu [23], että he eivät löytäneet mitään syöpäsolut ääreisveren käsittelemättömästä mahakarsinoo- potilaille. Kirjoittajat spekuloivat, että syöpäsolut eivät näy helposti kulkeutua perifeerisen veren primaarikasvaimista potilailla, joilla on hoitamaton mahalaukun karsinooma. Sen sijaan Miyazono ym.
[24] osoitti, että positiivinen korko CEA mRNA mahakarsinooman potilaista oli 8,8% ennen käyttöä. Läsnäolo CTC ennen hoitoa ja sen suhde kliiniseen tulokseen siten edelleen kiistanalainen. Tässä tutkimuksessa arvioimme kliinistä merkitystä CTC veressä ennen käytöltä reaaliaikaisen RT-PCR havaitsemiseksi ilmentymisen CEA-mRNA. Positiivinen nopeus CEA mRNA ennen käsittelyä on 36,6%. Muita tiedosto 1 esittää positiivisten määrä mRNA markkereita kirjallisuudesta havaitsemiseksi kasvainsolujen reaaliaikaisella RT-PCR.
O'Sullivan et ai.
[25] ehdotetaan, että ennen leikkausta havaitseminen mikrometastaasin saattaa heijastaa joko ohimenevä irtoaminen soluista, metastaattisen potentiaalin, tai jäljellä tautia. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että CTC havaittiin veressä ennen hoitoa suhteessa toistumisen. Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että ennen leikkausta havaitseminen verenkierrossa syöpäsolujen oli selvä merkki huonosta elossaololuku, koska monissa tapauksissa, jossa kiertää syöpäsolujen ennen leikkausta osoittivat joko laajennettu imusolmuke etäpesäke tai kaukaisia ​​etäpesäkkeitä, jolloin ennusteen näille potilaille oli huono [26-28 ]. Nykyisissä tutkimuksessa, huomasimme, että ilmaus CEA-mRNA oli merkittävästi liittyvän taudin uusiutumisen. Lisäksi potilailla, joilla on positiivinen CEA-mRNA oli lyhyempi 3 vuoden tautivapaan elinajan lopputulokseen. Ilmaantuvuus toistuminen oli merkitsevästi suurempi potilailla positiivinen CEA mRNA kuin niissä negatiivinen.
Herkkyys CEA mRNA ilmaisun ennustaa uusiutuminen on vain 56,8%. Yhdeksäntoista seitsemänkymmentäkahdeksan potilasta (24,4%) ja negatiivinen CEA mRNA ilmaisu oli kasvaimen uusiutumisen. Setoyama ym.
[20] osoitti, että 8 69 (11,6%) ruokatorven syöpä potilailla, joilla on negatiivinen CEA mRNA ilmaisu oli kasvain uusiutuminen, ja 6 potilaalla oli imusolmuke toistumisen. Yksi usein käytetty selitys havaitsemisen vika on, että kiertävä solut eivät homogeenisesti jakautunut ja ei-jatkuvasti irtoa kiertoon [29, 30]. Lisäksi ihanteellinen merkki (ei avioton ilmentymistä veren, korkea ilmentyminen kasvainsoluissa) ei ole vielä löydetty. Beyond CEA-mRNA, muut transkriptit, mukaan lukien sytokeratiini (CA) 18 [31], matriksimetalloproteinaasi (MMP) -7 [32], CK 20 [33], urokinaasi-tyyppisen plasminogeeniaktivaattorin reseptorin (uPAR), CK 19 ja CK 7 [ ,,,0],34], on kokeiltu mahdollisina markkereita CTC. Kuitenkin tuumorisolujen irtoa pitäisi olla suhteellisen harvinainen tapahtuma. Siten onko ääreisveren on sopiva lokero varhaista havaitsemista mikrometastaaseihin on yhä kiistanalainen. Muita osastoja kuten luuytimestä tai vatsaonteloon ovat tiedossa tarjota korkeampia havaitseminen hinnat, johtunee useampia kasvainsolujen läsnä [35-37].
Toinen tärkeä kysymys on väärä positiivinen ilmaus CEA-mRNA. Kaksikymmentä potilasta (44,4%), joilla oli positiivinen CEA-mRNA ilmaisu ei kirjannut uusiutumisen seurannassa. Yksi syy voi olla suhteellisen lyhyt seuranta-ajan.
Vaihtoehtoisesti tämä voi olla varsin kohtuullinen, koska harvat karsinoomasoluja irtoa verenkiertoon onnistuu saamaan etäpesäkkeitä [25]. Nämä verenkierrossa syöpäsolut eivät ehkä kiinnitä kaukaisiin elinten ja ehkä kasva. Äskettäin Méhes et al.
[38] tutki morfologia verenkierrossa syöpäsoluja ja totesi, että suurin osa verenkierrossa rintasyövän soluissa oli tilassa apoptoosin. Perifeerisessä veressä syöpäpotilaiden olemassaolo kasvainsolun-lymfosyyttien kompleksin havaittiin [39]. Nämä havainnot osoittavat, että makrofagit tai lymfosyytit voisi olla tärkeä rooli induktioon kiertävien tuumorisolujen apoptoosin ja kasvainvastaisen immuunivasteen isännän. Nämä immunisoitujen makrofagit voivat herkistää T-lymfosyyttejä isännän, ja herkistyneet T-lymfosyytit voivat hyökätä jäljellä mikrometastaattisessa syöpä vaurioita potilaista [23]. Selventää Tämän hypoteesin lisätutkimuksia osalta korrelaatio on olemassa verenkierrossa syöpäsolujen ja isännän immuunivastetta ovat tarpeen.
Nykyinen tutkimus oli retrospektiivinen analyysi, ja potilaille, jotka tulee saada adjuvanttihoitoa joita ei ole asetettu etukäteen. Yleensä potilaat, joilla oli positiivinen imusolmuke suositeltiin saamaan adjuvanttihoitoa. Tähän asti ei ole olemassa standardia kriteerit adjuvanttihoitoa mahasyövän Kiinassa. Tutkimuksemme osoitti, että CEA-mRNA kopiomäärä ääreisverenkierrossa alkudiagnoosin oli merkitsevästi yhteydessä tauti uusiutuu mahalaukun adenokarsinoomaa potilailla. Vuonna näkökulmasta toistumisen, siksi ehdottaa, että potilailla, joilla on positiivinen CEA-mRNA ilmaisu preoperatively vastaanottaa adjuvanttihoitoa jälkeen radikaali resektio.
Johtopäätökset
Tässä tutkimuksessa herkkyys CEA-mRNA oli korkeampi kuin seerumin CEA. Lisäksi mukaan monimuuttuja regressioanalyysi, CEA mRNA positiivisuus oli itsenäinen tekijä toistumisen. Nykyinen tutkimus vahvisti, että tällainen menetelmä on lupaava varhaiseksi havaitsemiseksi CTC potilailla mahalaukun syöpä ennen hoitoa; potilaille, joilla on positiivinen CEA mRNA voi olla suurempi riski toistumisen jälkeenkin parantava resektio. Kuitenkin suuri satunnaistettu ennakoiva tutkimus on perusteltua määritellä rooliin CEA-mRNA tunnistus veressä.
Lyhenteet
RT-PCR:
käänteistransskriptaasi-polymeraasiketjureaktio

CTC:
verenkierrossa olevia kasvainsoluja
CEA:
Karsinoembryonaalinen Antigen
CA19-9:
hiilihydraattiantigeeniä 19-9
TNM:
Kasvain-Node-etäpesäke
AJCC:
American sekakomitean Cancer
GAPDH:
Glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasin
MMP-7:
matriksimetalloproteinaasi-7


uPAR:
urokinaasi plasminogeeniaktivaattorin Receptor.
julistukset
Kiitokset
Nämä rahoittivat National Natural Science Foundation of China avustuksen 30672408, Guangzhou Bureau of Science and Technology myöntää 2006Z3-E0041 ja Sun Yat-sen University 985 Program aloittaminen Fund (Kiina). Olemme kiitollisina kiittää henkilökuntaa laitoksella Medical Syöpätautien ja GI kirurgian Oncology Sun Yat-sen University Cancer Center heidän ehdotus ja apua.
Elektroninen oheismateriaali
12967_2009_529_MOESM1_ESM.DOC Additional tiedosto 1: Tiedot kirjallisuudessa havaitseminen kasvainsolujen reaaliaikaisella RT-PCR mRNA: n merkkejä. Se osoittaa positiivisten määrä mRNA markkereita kirjallisuudesta havaitsemiseksi tuumorisolujen reaaliaikaisella RT-PCR: llä. (DOC 58 KB) Tekijät "alkuperäiset toimitti asiakirjat kuville
Alla linkkejä kirjoittajien alkuperäiset toimitti asiakirjat kuville.

• DNA polymeraseη proteiinin ilmentyminen ennustaa hoitovasteen ja eloonjäämisen mahalaukun metastasoivaa adenokarsinoomaa hoidetuilla potilailla oksaliplatiinipohjaisen kemoterapiaa
• Tehokkuus ultrasonography tarkastettaessa sijoittamista nenämahalaukkuputken potilailla, joilla on alhainen tajunnan pidetyssä ylimääräisessä center