Kimutatása karcinoembrionális antigén hírvivő RNS vérben kvantitatív, valós idejű reverz transzkriptáz polimeráz-láncreakció megjósolni kiújulásának gyomor adenokarcinóma

Kimutatása karcinoembrionális antigén hírvivő RNS vérben kvantitatív, valós idejű reverz transzkriptáz polimeráz-láncreakció megjósolni kiújulásának gyomor adenokarcinóma
Abstract
alapon
megléte keringő tumorsejtek (CTC) a perifériás vérben, mint egy indikátor tumor kiújulásának nem egyértelműen megállapítani, különösen a gyomor rákos betegeknél. Végeztünk retrospektív elemzése közötti kapcsolat CTC a perifériás vérben a kezdeti diagnózis és klinikopatológiai eredményeket betegeknél gyomorrák. Katalógusa Módszerek katalógusa vérmintákat a 123 gyomorrákos betegek kezdeti diagnózis. mRNS-t extraháljuk, és amplifikáltuk karcinoembrionális antigén (CEA) mRNS kimutatására valós idejű RT-PCR-rel. Időszakos 3 hónapos utánvizsgálatokra benne szérum CEA mérések és képalkotás. Katalógusa Eredmények katalógusa minimumküszöbének korrigált CEA mRNS pontszám [(CEA mRNS /GAPDH mRNS) × 10 6] határozták meg 100. negyvenöt 123 beteg (36,6%) volt pozitív CEA mRNS expresszió. CEA mRNS expressziója szignifikánsan korrelált a T-stádium és posztoperatív kiújulás állapot (P katalógusa = 0,001). Kiújuló betegség találtak 44 123 esetben (35,8%), és 25 ilyen (56,8%) volt pozitív CEA mRNS-t. E betegek, CEA mRNS volt sokkal érzékenyebb, mint a szérum CEA jelezve kiújulás. Három éves betegségmentes túlélés betegek pozitív CEA mRNS szignifikánsan gyengébb, mint a negatív betegnél CEA mRNS (P katalógusa < 0,001). Csak szövettani grade és CEA mRNS-pozitivitás volt független tényezők betegségmentes túlélés többváltozós analízis.
Következtetések katalógusa CEA mRNS kópiaszám a perifériás vérben a kezdeti diagnózis szignifikáns összefüggést a betegség kiújulásának a gyomor adenokarcinóma betegek. Real-time RT-PCR kimutatása CEA mRNS szintek a kezdeti diagnózis tűnik ígéretes előrejelzője a betegség kiújulásának a gyomor adenokarcinóma betegek. Katalógusa Háttér katalógusa Gyomorrák maradt a vezető daganatos halálok világszerte a 20. század folyamán. Az egyetlen bizonyított kuratív kezelés műtéti eltávolítása makroszkopikus és mikroszkopikus sérülések. Azonban annak ellenére, hogy átesett gyógyító gastrectomián beleértve a kiterjesztett nyirokcsomó-eltávolítás és adjuváns kemoterápia, rák kiújul mind regionális, mind a távoli helyek a betegek többségében [1]. Diagnózis a kiújulás közös nyomon követési protokollok általában készül egy késői szakaszában, amely olyan mértékben, kizárja annak lehetőségét, hatékony kezelés [2]. Felügyeleti keringő tumorsejtek (CTC), úgy tűnik, hogy nagyobb lehetőséget a korai diagnózis a kiújuló betegség.
A koncepció vizsgálja a metasztatikus folyamatban a perifériás vérben eredetileg a 19. században, amikor T. R. Ashworth le először a jelenség a CTC, és S. Paget feltételeztük egy nem véletlenszerű mintázatát rák metastasization (a "vetőmag és a talaj" elmélet) [3, 4]. Ezt követően, a rosszindulatú jellegének CTC igazoltuk, bizonyítva azt, hogy rendelkezzenek a tumor-specifikus kromoszóma-rendellenességek [5, 6], és hogy a nőnek ex vivo, mint sejtvonalak egy rosszindulatú fenotípus [7]. Számos megközelítés kimutatására CTC írtak le, és sorolhatók PCR-alapú módszerek és citometriás módszerek [8].
Az Advent a kvantitatív valós idejű PCR-technikákkal [9], a pontos mennyiségi meghatározására a cél-szekvencia lehetővé vált . Kvantitatív PCR nyújt nyomozók nem csak a műszaki előnyök, hanem alkalmazó előnyei, mint például a meghatározása cutoff érték azt jelzi mRNS expressziós szintje klinikai jelentősége daganatos betegeknél, egészséges egyénekkel összehasonlítva. Real-time PCR is nyújt a lehetőségeit korreláló cél-szekvencia terhelés a klinikai kimenetellel [10] vagy a kezelésre adott válasz [11].
CEA, eredetileg le, mint egy tumorasszociált vastagbélrák antigén, klónoztuk 1987-ben és az Mára felismerték tagjaként az immunglobulin protein szupercsalád [12]. Számos tanulmány számolt kimutatása gyomor-sejtek a vérben [13], a csontvelő [14], és a peritoneális mosással [15] A gyomorrákos betegek segítségével valós idejű PCR CEA mRNS.
A tanulmány célja az volt, hogy hatékonyságának értékelése a CEA mRNS real-time PCR technika korai felismerése daganat kiújulásának. E cél elérése érdekében, a kapcsolat a klinikai kiújulás és vérszintjét CEA mRNS műtét előtt megvizsgálták a gyomor adenokarcinóma betegek. Katalógusa Módszerek katalógusa betegeket katalógusa írásos beleegyezését adta a minden beteg a használata vérmintákat kutatások szerint az intézményi előírásoknak Kórházunk. Között 2002. február 2006. december összesen 123 egymást követő beteg gyomor adenokarcinóma Cancer Center Szun Jat-szen Egyetemen vontunk be a vizsgálatba. Minden beteg kapott reszekcióra és D2 nyirokcsomó. A bérleti 15 nyirokcsomók álltak rendelkezésre a nyomozás. Nem peritoneális terjesztés találtak. A tárolt szérum CEA változás és képalkotó vizsgálat a műtét előtt és minden három hónappal a műtét után volt szükség. Betegek, akik pozitív nyirokcsomót ajánlott az adjuváns kemoterápiát, de végül csak nyolcvanhárom betegnél adjuváns kemoterápiát. A rendek tartalmazza CAPOX (kapecitabin + oxaliplatin, 16 esetben, a medián ciklus 4), folfox6 (56 eset, a medián ciklus 6), taxol + ciszplatin (4 eset, a medián ciklus 4), taxol + 5-FU /CF (fluorouracil /leucovorin 7 esetben, a medián ciklus 6). Visszatérő betegség, beleértve a helyi kiújulás és távoli áttétek mutattuk komputertomográfiás vizsgálat. Új elváltozások kimutathatók képalkotó vizsgálat követési kinevezéseket tekinthető megismétlődését. Biopszia rutinszerűen nem végzik el, hogy meghatározza szövettani kiújulás. Minden képalkotó értékeltük legalább két független megfigyelők, köztük a radiológusok. A medián követési idő volt 37,0 hónap (3,0-73,6 hónap). Katalógusa vérmintákat katalógusa vérmintákat a kezdeti diagnózis egy vagy két nappal a műtét előtt. Az első 3 ml vért eldobtuk, hogy megakadályozzák epidermális szennyeződés, majd egy 5 ml-es vérmintát nyert perifériás vénába. A perifériás vérminták 30 nem rákos beteg önkéntesek alkalmaztunk negatív kontrollként.
Minden beteg írásos beleegyezését adta; kaptunk külön hozzájárulás felhasználása vérminta. Tanulmányi jóváhagyást nyert független etikai bizottságok Cancer Center Szun Jat-szen Egyetemen. A tanulmány szerint vállalt etikai normák a World Medical Association a Helsinki Nyilatkozat.
Előfeldolgozás vérminták katalógusa vérmintákat EDTA-t tartalmazó csövekbe. A minták feldolgozása végeztük követő 2 órán belül a vérvételt. Blood átvittük egy 30 ml-es Falcon-csőbe, és centrifugáljuk 1800 percenkénti fordulatszámmal, szobahőmérsékleten 20 percig. A szérumot eltávolítottuk, és a sejteket újra szuszpendáljuk 5 ml sóoldatban és 0,3 ml RNS későbbi megoldást. Összekeverés után is, a vér sejt elegyet tartjuk egy éjszakán át 4 ° C-on és -80 ° C-on tároljuk a felhasználásig.
RNS extrakció és cDNS-szintézis
teljes RNS perifériás vérmintákból kivontuk RNAprep Cell Kit (Tiangen Peking, Kína) protokollt követve a gyártó által biztosított. RNS integritás ellenőriztük elektroforézissel és mennyiségileg abszorpciós 260 és 280 nm-en, UV-látható spektrofotométerrel (Beckman Coulter Du ® 800, Fullerton, CA). A reverz transzkripcióhoz, 1 ng teljes RNS-t, 1 ul oligo (dT) 15 és 1 ul dNTP hígítottunk 10 ul RNáz-mentes víz, inkubáltuk 10 percig 37 ° C-on és 1 ul 25 mmol /l EDTA-t adunk hozzá. Egy 11 ul-es reakció elegyet 10 percig inkubáljuk 65 ° C hőmérsékleten, és gyorsan lehűtjük jégen 2 percig. cDNS-t tárolunk -80 ° C hőmérsékleten tároljuk a felhasználásig. cDNS-szintézis segítségével végeztük TIANScript M-MLV módszerrel (Tiangen Biotech, Peking, Kína).
Sejtvonalak
Ahhoz, hogy felkészüljön a CEA-specifikus RT-PCR-rel, a két sejtvonal, SW-480 (vastagbél rák sejtvonal ) és az SC-7901 (gyomorrák sejtvonal) használtunk. A limfocitákat gyűjtöttünk egészséges önkénteseken nélkül epiteliális rosszindulatú. Miután limfocitákat izoláltunk perifériás vérből gradiens centrifugálással, a mononukleáris sejtréteget összegyűjtöttük. Sejtvonalakat sorozathígítást készítettünk (10-szeres) 2 × 10 7-5 × 10 7-limfocitákat, hogy karcinóma cella: limfocita végezve 1:10-01:10 7.
CEA mRNS elemzés valós idejű kvantitatív PCR-
kvantitatív PCR-t végeztünk a Sequence Detector System, ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System). PCR-primereket és TaqMan próbákat terveztünk a Primer Express 1.0 szoftver. Ebben a vizsgálatban a housekeeping gén glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH) használtunk, mint belső kontroll, hogy az eltérések normalizáljuk integritás és a teljes mennyiségű RNS-t kivontuk. A real-time PCR assay GAPDH és CEA végeztünk külön csövekben. CEA mRNS-értékeket állítjuk ellen GAPDH mRNS értékeket, valamint a relatív CEA mRNS pontszámokat mutattak be (CEA mRNS /GAPDH mRNS) × 10 6 minden mintára.
5 pl, a minta cDNS-t használt valós time PCR egy 20

• DNS polymeraseη fehérje expresszió jósolja terápiás válasz és a túlélés metasztatikus gyomor adenokarcinóma kezelt betegek oxaliplatinalapú chemotherapy
• A hatékonysága ultrahangvizsgálat ellenőrzése elhelyezése a csövön a betegek alacsony tudat vészhelyzet center