Detecção de carcinoembrionário ARN antigénio mensageiro no sangue utilizando quantitativo em tempo real da reacção da cadeia de polimerase-transcriptase reversa para prever a recorrência de detecção adenocarcinoma

gástrica de RNA mensageiro antigénio carcinoembrionário no sangue utilizando quantitativo em tempo real inverter reacção em cadeia com transcriptase-polimerase para prever a recorrência de adenocarcinoma gástrico da arte abstracta
Fundo
A existência de células tumorais (CTCs) em circulação no sangue periférico como um indicador de recorrência do tumor não foi claramente estabelecido, particularmente para pacientes com câncer gástrico. Foi realizada uma análise retrospectiva da relação entre CTCs no sangue periférico em resultados de diagnóstico e clínico-patológicas iniciais em pacientes com carcinoma gástrico.
Métodos
As amostras de sangue foram obtidas de 123 pacientes com carcinoma gástrico no diagnóstico inicial. ARNm foi extraído e amplificado para o antigénio carcinoembrionário (CEA) utilizando ARNm de detecção em tempo real de RT-PCR. exames de acompanhamento periódicas de 3 meses incluiu medidas CEA sérico e de imagem.
Resultados
O limite mínimo para mRNA CEA corrigido marcar [(CEA mRNA /GAPDH mRNA) × 10 6] foi fixado em 100. quarenta e cinco dos 123 pacientes (36,6%) foram positivos para a expressão do mRNA CEA. expressão de mRNA CEA significativamente correlacionada com o estádio T e estado de recidiva pós-operatória (P
= 0,001). doença recorrente foi encontrado em 44 de 123 casos (35,8%), e 25 deles (56,8%) foram positivos para mRNA CEA. Desses pacientes, CEA mRNA foi mais sensível que CEA sérico em indicando recorrência. Três anos de sobrevida livre de doença de pacientes positivos para mRNA CEA foi significativamente mais pobres do que dos pacientes negativos para CEA mRNA (P Art < 0,001). Apenas grau histológico e CEA mRNA positividade foram fatores independentes para sobrevida livre de doença por meio de análise multivariada.
Conclusões
mRNA CEA número de cópias no sangue periférico no diagnóstico inicial foi significativamente associada com a recorrência da doença em pacientes com adenocarcinoma gástrico. Detecção em tempo real RT-PCR dos níveis de mRNA CEA no diagnóstico inicial parece ser um preditor promissor para a recorrência da doença em pacientes com adenocarcinoma gástrico.
Fundo
O câncer gástrico manteve-se a principal causa de mortalidade por cancro em todo o mundo durante o século 20. O único tratamento curativo comprovado é a ressecção cirúrgica de todas as lesões macroscópicas e microscópicas. No entanto, apesar de submetido à gastrectomia curativa, incluindo dissecção de linfonodos estendida e quimioterapia adjuvante, câncer reaparece tanto regional, bem como locais distantes na maioria dos pacientes [1]. Diagnóstico de recidiva com protocolos comuns follow-up normalmente é feito numa fase tardia, o que, até certo ponto, exclui a possibilidade de um tratamento eficaz [2]. Vigilância de células tumorais circulantes (CTCs) parece oferecer maior possibilidade de diagnóstico precoce da doença recorrente.
O conceito de investigar o processo metastático no sangue periférico se originou no século 19, quando T. R. Ashworth primeiro descreveu o fenômeno de CTCs e S. Paget hipótese de um padrão não-aleatória de metastização do cancro (a "semente e do solo" teoria) [3, 4]. Subsequentemente, a natureza maligna da CTC foi confirmada pela demonstração de que eles possuem aberrações cromossómicas específicas do tumor [5, 6] e que crescem ex vivo, como linhas de células com um fenótipo maligno [7]. Várias abordagens para detectar CTC foram descritos e podem ser classificados em métodos baseados em PCR e métodos de citometria de [8].
Com o advento da quantitativo em tempo real técnicas de PCR [9], a quantificação precisa de uma sequência alvo se tornou possível . PCR quantitativa fornece investigadores, não só com vantagens técnicas, mas também com vantagens do aplicativo, tais como a definição de valores de corte, indicando os níveis de expressão de mRNA de relevância clínica em pacientes com câncer em comparação com indivíduos saudáveis. PCR em tempo real, também proporciona a possibilidade de correlacionar a carga-sequência alvo com o resultado clínico [10] ou a resposta à terapia [11].
CEA, originalmente descrito como um antigénio do cancro do cólon associada ao tumor, foi clonado em 1987 e é agora reconhecido como um membro da superfamília de proteínas de imunoglobulina [12]. Muitos estudos têm relatado a detecção de células gástricas no sangue [13], a medula óssea [14], e lavagem peritoneal [15] de pacientes com câncer gástrico, utilizando PCR em tempo real para o mRNA CEA.
O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia da técnica de PCR em tempo real de ARNm de CEA para a detecção precoce de recorrência do tumor. Para atingir esse objetivo, a relação entre a recorrência clínica e os níveis sanguíneos de mRNA CEA no pré-operatório foi examinado em doentes com adenocarcinoma gástrico.
Métodos
Pacientes
consentimento informado foi obtido de todos os pacientes sobre o uso de amostras de sangue para investigação em conformidade com as diretrizes institucionais de nosso hospital. Entre fevereiro de 2002 e dezembro de 2006, um total de 123 pacientes consecutivos com adenocarcinoma gástrico no Centro de Câncer de Sun Yat-sen University foram inscritos neste estudo. Todos os pacientes receberam ressecção radical e linfadenectomia D2. No contrato de arrendamento de 15 nódulos linfáticos estavam disponíveis para a detecção. Nenhuma divulgação peritoneal foi encontrado. foram necessários registros claros de mudança de soro CEA e avaliação por imagem antes da operação ea cada três meses após a operação. Pacientes que tinham linfonodo positivo foram recomendados para receber quimioterapia adjuvante mas finalmente apenas oitenta e três pacientes foram submetidos a quimioterapia adjuvante. Os regimes incluídos CAPOX (capecitabina + Oxaliplatina, 16 casos, com um ciclo de mediana de 4), FOLFOX6 (56 casos, com um ciclo de mediana de 6), o taxol + cisplatina (4 casos, com um ciclo de mediana de 4), o taxol + 5FU /CF (fluorouracilo /Leucovorina, 7 casos, com uma mediana de ciclo 6). doença recorrente, incluindo recaída e distantes metástases locais, foi detectada por exame de tomografia computadorizada. Novas lesões detectadas por exame de imagem em consultas de acompanhamento foram considerados como recorrência. A biópsia não foi feito rotineiramente para determinar a recorrência histológica. Todos imagem foi avaliada por, pelo menos, dois observadores independentes, incluindo radiologistas. O período médio de acompanhamento foi de 37,0 meses (variação, 3.0-73.6 meses).
Amostras de sangue
Amostras de sangue foram coletadas no momento do diagnóstico inicial de um ou dois dias antes da cirurgia. Os primeiros 3 ml de sangue foram eliminados para evitar a contaminação da epiderme, e, em seguida, uma amostra de sangue de 5 ml foi obtido a partir da veia periférica. Amostras de sangue periférico obtidos a partir de 30 não-cancerosas voluntários pacientes foram utilizados como controlos negativos
Todos os pacientes forneceram consentimento informado.; obteve-se consentimento separado para utilização da amostra de sangue. aprovação do estudo foi obtido a partir de comitês de ética independentes no Centro de Câncer de Sun Yat-Sen University. O estudo foi realizado de acordo com os padrões éticos da Declaração da Associação Médica Mundial de Helsinki.
Pré-processamento de amostras de sangue
As amostras de sangue foram coletadas em tubos contendo EDTA. O processamento da amostra foi realizada dentro de 2 horas após a retirada de sangue. O sangue foi transferido para um tubo Falcon de 30 mL e centrifugou-se a 1800 rpm à temperatura ambiente durante 20 minutos. O soro foi removido e as células foram ressuspensas em 5 mL de solução salina e 0,3 ml de solução de ARN mais tarde. Depois de misturar bem, a mistura de células do sangue foi mantida durante a noite a 4 ° C e armazenadas a -80 ° C até serem usadas.
Extracção de ARN e a síntese de ADNc
O ARN total de amostras de sangue periférico foi extraído utilizando o Estojo celular RNAprep (Tiangen , Pequim, China) seguindo o protocolo fornecido pelo fabricante. a integridade de ARN foi verificada por electroforese e quantificado por absorção a 260 e 280 nm utilizando um espectrofotómetro de UV-visível (Beckman Coulter Du ® 800, Fullerton, CA). Para a transcrição reversa, 1 ug de ARN total, 1 ul de Oligo (dT) 15 e 1 ul de dNTP foram diluídos em 10 uL de água sem RNase, incubadas 10 minutos a 37 ° C e 1 ul de 25 mmol /L de EDTA foi adicionado. Uma alíquota de 11 uL da mistura de reacção foi incubada durante 10 minutos a 65 ° C e rapidamente arrefecidas em gelo durante 2 minutos. O ADNc foi armazenado a -80 ° C até serem usadas. síntese de cDNA foi realizada usando o método TIANScript M-MLV (Tiangen Biotech, Beijing, China). As linhas celulares
Para se preparar para específicos de CEA RT-PCR, duas linhas celulares, SW-480 (linha celular do cancro do cólon ) e foram utilizados SC-7901 (linha de células de câncer gástrico). Os linfócitos foram coletadas de voluntários saudáveis, sem doença maligna epitelial. Depois os linfócitos foram isolados a partir de sangue periférico por centrifugação de gradiente, a camada de células mononucleares foi recolhida. As linhas de células foram diluídas em série (10 vezes) em 2 × 10 7-5 × 10 7 para dar linfócitos de células de carcinoma: razões de linfócitos que variam 01:10 - 01:10 7.
CEA Análise mRNA por real-Time PCR quantitativa
Quantitative PCR foi realizada utilizando o Sistema Detector Sequence, ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems 7500 rápido real-Time PCR System). iniciadores de PCR e as sondas TaqMan foram projetados usando o programa 1.0 software Primer Express. Neste ensaio, a arrumação do gene da gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) foi usada como um controlo interno para normalizar variações em integridade e a quantidade total de ARN extraído. Os ensaios de PCR em tempo real para GAPDH e CEA foram feitas em tubos separados. os valores de ARNm de CEA foram ajustados contra os valores de ARNm de GAPDH, e as pontuações relativas de ARNm de CEA foram apresentados como (CEA mRNA /GAPDH mRNA) × 10 6 para cada amostra.
5 uL do ADNc da amostra foi usada para real tempo de PCR numa mistura reaccional de 20 ul com 10 pmol de iniciadores apropriados (cooperação Invitrogen, Japão) e 5 pmol de sonda TaqMan (Cooperação Invitrogen, Japão). O corante repórter (6-carboxi-fluoresceína: FAM) foi covalentemente ligado à extremidade 5 'da sonda, e o corante inibidor (6-carboxi-tetrametil-rodamina: TAMRA) foi ligado à extremidade 3' da sonda. O perfil de temperatura utilizado para a amplificação foi como se segue: desnaturação durante 1 ciclo a 95 ° C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos a 95 ° C durante 10 segundos, 60 ° C durante 15 segundos, e 72 ° C durante 5 segundos. A quantificação foi feita pelo sistema detector de sequências ABI Prism 7500. Cada conjunto de amostras e controles externos serialmente diluídas foram amplificados em duplicado. O valor médio dos duplicados foi utilizada como o valor quantitativo.
Um iniciador oligonucleótido específico para o CEA foi concebido com base no relatório de Gerhard et ai.
[16]. As sequências foram: 5'-TGTCGGCATCATGATTGG-3 '(sentido) e 5'-GCAAATGCTTTAAGGAAGAAGC-3' (anti-sentido). sequências de sonda fluorescente e LC-Red utilizados para a identificação de CEA foram: 5'-CCTGAAATGAAGAAACTACACCAGGGC-fluoresceína e 5'-LC-Red 640-GCTATATCAGAGCAACCCCAACCAGC-fosfato
em tempo real a monitorização de PCR foi alcançada através da medição do sinal de fluorescência no final. de recozimento de fase de cada ciclo. As sequências dos iniciadores utilizados para a amplificação de GAPDH foram: 5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3 '(sentido) e 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' (anti-sentido). As sequências de sonda utilizada para a identificação de GAPDH foram: 5'-TCAACAGCGACACCCACTCCT-fluoresceína e 5'-LC-Red 640-CACCTTTGACGCTGGGGCT-fosfato
Determinação de CEA em amostras de soro
amostras de soro pré-operatórias também foram usadas para o ensaio. marcador tumoral CEA utilizando um kit de imunoensaio enzima disponível comercialmente (Cobas núcleo EIA, Roche, Basileia, Suíça). nível de corte patológico foi de 5 ng /mL para o CEA sérico analisa
Estatística
O método estatístico de Kaplan-Meier foi utilizado para a análise de características clínicas e recorrência.; diferenças foram estimados com o teste log-rank. fatores prognósticos foram examinadas por análises uni e multivariada (teste-rank de log para análise uni e Cox modelo de regressão de riscos proporcionais, backward (condicional LR) para análise multivariada). Os testes exatos qui-quadrado e Fisher foram usados ​​para análise estatística. Todas as análises estatísticas foram realizadas com SPSS16.0. . Todos os valores P foram 2 caudas, eo nível de significância foi estabelecido em 0,05

Resultados As características clínicas
Os 123 pacientes incluídos no estudo com idade de 28 a 84 anos (média de 57,11 anos, mediana, 59 anos), e a proporção de homens para mulheres foi 82:41 (Tabela 1). O estadiamento foi realizado de acordo com a classificação tumor-nódulo-metástase (TNM) do American Joint Committee on Cancer (AJCC, revista em 1997). Vinte e quatro tumores foram localizados no cárdia, 3 no fundo gástrico, 44 ​​no corpo gástrico, 45 no antro gástrico, 5 envolveu o estômago inteiro, e 2 pertencia ao carcinoma gástrico remanescente (Tabela 1) .table 1 Correlação características e CEA * expressão do mRNA detectado pelo tempo real RT-PCR
características
número total
(N = 123)
mRNA CEA
valor
P

positiva (n = 45)
negativo
(n = 78)

Age
≤40
13 Sims 3
10
41-50
20
9
11
51-60
39
9
30
61-70
42
18
24 Restaurant > 70
9
6 Sims 3
0,063 Sexo seguro
Female
41
12
29
Masculino
82
33
49
0,234
Tumor
T1
10
6 4
T2
16 Sims 3
13
T3
73
26
47
T4
24
10
14
0,001
linfonodos
N0
31
11
20
N1
43
15
28
N2
29
8
21
N3
20
11
9
0,261
Patológica TNM # palco
I
16
7
9
II
21
6
15
III
51
17
34
IV
35
15
20
0,623
Histologia subtipo
Bem diferenciado adenocarcinoma Sims 3
1 | 2
moderadamente diferenciado adenocarcinoma
27
7
20
mal adenocarcinoma diferenciado
93
37
56
0,418
Serum CEA condição
positiva
30
11
19
negativo
93
34
59
0,992
recorrência
Sim
44
25
19
Sem
79
20
59
0,001
Modos de recorrência
recorrência local
8
4 4
cavidade abdominal
9
6 Sims 3
fígado
8
5 Sims 3
pélvicos
6 Sims 3 Sims 3
vários sites
10
5
5
outros Sims 3
2
1 | 0,959
* antígeno carcinoembrionário
# TNM denota tumor-nódulo-metástase
sensibilidade Detecção de mRNA CEA pelo tempo real RT-PCR
mRNA CEA foi detectada em SW -480 e SC-7901 linhas celulares. O limite inferior de detecção foi de uma concentração de 10 células de tumor por 10 7 linfócitos. Convencional nested RT-PCR foi utilizada para confirmar a sensibilidade do produto de RT-PCR.
Expressão de ARNm de CEA em sangue
expressão de ARNm de CEA foi detectada em 9 dos 30 (30,0%) pacientes não-cancerosas, e a média corrigida pontuação mRNA CEA foi de 7,5 (variação, 0-92,5). O valor máximo de pontuação corrigido ARNm de CEA em pacientes sem doença maligna foi de 92,5, de modo que um valor de corte de 100 foi utilizado no presente estudo. Usando esse valor de corte, 45 pacientes (36,6%) foram diagnosticados como CEA mRNA-positivo. O valor médio corrigido CEA mRNA Avaliação [(CEA mRNA /GAPDH mRNA) × 10 6] dos 123 pacientes foi de 37,510.0 (Range, 0-3,695,652.1) cópias Figura 1 apresentou a distribuição de (CEA mRNA mRNA /GAPDH) × 10 6 neste grupo de pacientes. Figura 1 A distribuição do nível de expressão de CEA. Os meios Ratio (CEA mRNA /GAPDH mRNA) × 106. Tendo em vista a relação de alguns pacientes foram zero, foram adicionados 0,5 à razão.
Relação entre a expressão de ARNm e características clinicopatológicas CEA
expressão de ARNm de CEA não se correlacionou com idade, sexo, estágio N, estágio TNM, tipo histológico e estado CEA sérico (Tabela 1). No entanto, os doentes com recidiva pós-operatória teve significativamente maior percentagem de mRNA CEA positivos do que aqueles sem recidiva do tumor (P
= 0,001) (Tabela 1). Além disso, a profundidade do tumor também se correlacionou positivamente com a expressão do mRNA CEA (P
= 0,001).
Relação entre recorrência e expressão de mRNA CEA, bem como CEA sérico
O modo de recorrência inclui 8 recorrência local, 9 divulgação abdominal excepto fígado, 8 metástases do fígado, metástases 6 pélvica, 3 outros locais de metástases e 10 múltiplos locais de metástases. Não há nenhuma diferença significativa entre a expressão de ARNm de CEA e o modo de recorrência (Tabela 1).
Doença recorrente foi encontrado em 44 dos 123 casos (35,8%). Vinte e cinco destes pacientes (56,8%) eram de ARNm de CEA-positivas. Em contraste, apenas 14 pacientes com doença recorrente (31,8%) foram positivos para CEA sérico pré-operatório. As especificidades de ARNm de CEA CEA e soro que indicam recorrência foram 74,7% e 79,9%, respectivamente. (Tabela 2) .table 2 Comparação entre CEA * mRNA e CEA no soro na previsão de recorrência

CEA mRNA
Sérum CEA

Positive

Negative

Positive

Negative

Recurrence
Yes
25
19
14
30
Sem
20
59
16
63
P
0,001
0,152
X Página 2
12,088
2.050
Sensibilidade (%)
56,8
31,8
Especificidade (%)
74,7
79,7
* antígeno carcinoembrionário
univariada e multivariada de sobrevida livre de doença de 3 anos
A sobrevida global em 5 anos foi de 58,9% e sobrevida livre de doença em 3 anos foi de 63,9%. Ambas as análises uni e multivariada foram utilizadas para avaliar fatores relacionados à sobrevida livre de doença. De acordo com a análise univariada, a idade, a profundidade do tumor, metástase nodal, grau histológico, estágio TNM, mRNA CEA positividade e CEA soropositividade foram significativamente relacionados à sobrevida livre de doença (P = 0,031
, < 0,001, 0,001, 0,022, < 0,001, 0,001, 0,045, respectivamente) (Tabela 3). análise de regressão multivariada mostrou que apenas o grau histológico e CEA mRNA positividade foram fatores independentes para sobrevida livre de doença (P = 0,047
e 0,020, respectivamente, Tabela 4). as taxas de sobrevida livre de doença de três anos para CEA pacientes mRNA-positivas foram significativamente mais baixos do que para pacientes negativos mRNA CEA (43,9% versus 74,1%, respectivamente, P = 0,001
, Figura 2) .table 3 A análise univariada da doença- sobrevida livre no carcinoma gástrico
Parâmetro
sobrevivência livre de doença, P valorA
Age Art < 59 vs. ≥59
0,031
Sexo
Macho contra a fêmea
0,433
CEA mRNA
(+) vs. (-)
0,001
Serum CEA
(+) vs. (-)
0,045
grau histológico
Bem /moderadamente vs. mal
0,022
pT
PTIS /pT1 vs. pT2 /pT3 /pT4 Art < 0,001
pN
(+) vs. (-)
0,001
Stage
1/2 vs. 3/4 Art < 0.001 agentes quimioterápicos
adjuvantes
CAPOX vs. mFOLFOX6 vs. taxol + DDP vs. taxol + 5-FU /CF
0,850
uma análise do teste Log-rank
Tabela 4 multivariada de sobrevida livre de doença no carcinoma gástrico
Fatores

Características
relação Hazard
IC 95%
P value

Unfavorable

Favorable

Age
≥59
<59
1.018
0.986-1.050
0.273
Histological grade
Poorly
Well/moderately
0.412
0.171-0.990
0.047
pT
2/3/4
Tis/1
1.673
0.100-8.690
0.947
pN
(+)
(-)
2.030
0.264-15.611
0.497
Stage
3/4
½
1.437
0.124-16.613
0.771
CEA mRNA
(+)
(-)
2.243
1,138-4,424
0,020
Serum CEA
(+)
(-)
1.130
0,582-2,194
0,717
CI, intervalo de confiança; pT, profundidade de invasão tumoral
Figura sobrevivência 2 livre de doença dos pacientes de acordo com a expressão de mRNA CEA. Três anos de sobrevida livre de doença de pacientes CEA mRNA-positivos foi significativamente menor do que a do CEA pacientes mRNA-negativos (43,9% versus 74,1%, respectivamente; P
= 0,001).
Discussão
A semi natureza Quantitativas da tecnologia de PCR tradicional tornou difícil para diferenciar os níveis de expressão do gene de referência em tecidos normais de aumento dos níveis de expressão do gene no câncer, aumentando assim a preocupação com resultados falso-positivos [17]. No nosso estudo, a PCR em tempo real de ARNm de CEA foi utilizado para investigar a possibilidade de sangue periférico como uma fonte para a detecção e previsão da CTC recorrência de cancro em pacientes com carcinoma gástrico. Quantitativa em tempo real análise de mRNA CEA em pacientes com câncer muitas vezes é realizado com base em CEA mRNA positividade, que é determinado usando um nível de corte [13]. CEA ARNm pode ser detectado em pacientes com doença benigna, bem como voluntários saudáveis, de modo que os níveis de corte são geralmente determinada pela expressão máxima em pacientes não-malignas [18, 19]. Setoyama T et al. descobriram que o valor máximo de ARNm de CEA em pacientes sem doença maligna foi de 8,6, que, por conseguinte, definir o valor de corte de 9,0 [20]. Schuster R et al. [21] também usou o valor máximo do fundo voluntário saudável como o valor de corte para a detecção de mRNA CEA em pacientes com câncer colorretal. Em nosso estudo, nós também utilizado o valor máximo da corrigido pontuação mRNA CEA em pacientes sem doenças malignas como o valor de corte. Ao estabelecer um valor de corte de 100 para os níveis de mRNA CEA normalizados, podemos distinguir pacientes com câncer de pacientes não-cancerosas e, por isso, considere mais confiança a expressão de mRNA CEA como um marcador de células tumorais circulantes.
Descobrimos que 10 pacientes com tumor T1, 6 pacientes tiveram expressão CEA-mRNA positivo. Mas não há registro de recorrência foi encontrada em 10 pacientes. Parece que não há nenhuma relação entre a expressão de mRNA CEA e recorrência na tumor T1. É difícil explicar a alta taxa positiva de CEA-mRNA em pacientes T1, mas achamos que a expressão de mRNA CEA foi baixa nos 6 pacientes T1, variando de 4320 cópias a 44 600 cópias. Ikeguchi M [22] relatou que 12,5% da fase I pacientes com carcinoma gástrico expressaram mRNA CK20 e considerou que foi induzida por uma pequena expressão de CK20 em células brancas do sangue periférico.
Poucos relatos têm avaliado a condição de CTCs no gástrica pacientes de carcinoma antes do tratamento. Ikeguchi e Kaibara relatados [23] que não conseguimos encontrar células cancerosas no sangue periférico de pacientes com carcinoma gástrico não tratados. Os autores especularam que as células cancerígenas não pareceu migrar facilmente para o sangue periférico a partir de tumores primários em pacientes com carcinoma gástrico não tratada. Em contraste, Miyazono et ai.
[24] mostraram que a taxa de positivos para o ARNm de CEA de doentes com carcinoma gástrico foi de 8,8% antes da operação. A presença de CTCs antes do tratamento e sua relação com a evolução clínica permanece, portanto, controverso. Neste estudo, avaliou-se a significância clínica da CTC no sangue antes da operação, utilizando em tempo real de RT-PCR para detectar a expressão de ARNm de CEA. A taxa positiva de ARNm de CEA antes de qualquer tratamento é de 36,6%. arquivo adicional 1 mostra a taxa positiva de marcadores de ARNm a partir da literatura para a detecção de células tumorais por em tempo real de RT-PCR.
O'Sullivan et al.
[25] sugeriram que a detecção pré-operatória de micrometástases pode reflectir tanto transiente derramamento de células, potencial metastático, ou doença residual. No presente estudo, descobrimos que CTCs foram detectados no sangue antes do tratamento em relação à recorrência. Vários estudos têm demonstrado que a detecção pré-operatória de células cancerosas circulantes foi um marcador clara de sobrevivência pobre paciente, pois muitos casos com as células cancerosas que circulam no pré-operatório mostrou quer metástases em linfonodos estendida ou metástases à distância, assim, o prognóstico desses pacientes era pobre [26-28 ]. No presente estudo, verificou-se que a expressão de mRNA CEA foi significativamente relacionada com a recorrência da doença. Além disso, os pacientes com mRNA CEA positivo apresentaram um menor resultado sobrevida livre de doença de 3 anos. A incidência de recorrência foi significativamente maior nos pacientes positivos para mRNA CEA do que naqueles negativo.
A sensibilidade da expressão de mRNA CEA para prever a recorrência é de apenas 56,8%. Dezenove dos setenta e oito pacientes (24,4%) com expressão de mRNA CEA negativo teve recorrência do tumor. Setoyama et al.
[20] mostrou que 8 de 69 (11,6%) pacientes com carcinoma de esôfago com expressão de mRNA CEA negativo teve recidiva tumoral e 6 pacientes tinham linfonodo recorrência. Uma explicação usado com freqüência de falha de detecção é que as células circulantes não estão distribuídas homogeneamente e não continuamente derramado em circulação [29, 30]. Além disso, o marcador ideal (nenhuma expressão ilegítima no sangue, de expressão elevada em células de tumor) ainda não foi encontrado. Além ARNm de CEA, outros transcritos, incluindo citoqueratina (CA) 18 [31], da metaloproteinase de matriz (MMP) -7 [32], CK 20 [33], uroquinase-receptor de tipo do activador de plasminogénio (uPAR), CK 19 e CK 7 [ ,,,0],34], têm sido experimentados como potenciais marcadores de CTCs. No entanto, o barracão de células de tumor deve ser um evento relativamente raro. Assim, se o sangue periférico é um compartimento adequado para a detecção precoce de micrometástases é ainda controversa. Outros compartimentos, tais como a medula óssea ou na cavidade abdominal, são conhecidos para fornecer taxas de detecção mais elevadas, provavelmente devido a um maior número de células tumorais presentes [35-37].
Um outro problema importante é a expressão de falsos positivos de ARNm de CEA. Vinte pacientes (44,4%) que tiveram expressão positiva mRNA CEA não registrou reincidência no follow-up. Uma razão pode ser o período de seguimento relativamente curto.
Alternativamente, isso pode ser bastante razoável, porque poucas células de carcinoma derramado na corrente sanguínea conseguiu estabelecer doença metastática [25]. Estas células cancerosas que circulam pode não ligar para órgãos distantes e pode não crescer. Recentemente, Méhes et ai.
[38] investigou a morfologia das células cancerosas que circulam e descobriu que a maioria das células cancerosas da mama que circula estava num estado de apoptose. No sangue periférico de pacientes com cancro, foi observada a existência do complexo celular de linfócitos de tumor [39]. Estas descobertas indicam que os macrófagos ou linfócitos poderia desempenhar um papel importante na indução de apoptose de células circulantes de tumor e o antitumoral resposta imune do hospedeiro. Estes macrófagos imunizados podem sensibilizar os linfócitos T citotóxicos do hospedeiro, e os linfócitos T sensibilizadas podem atacar as lesões cancerosas micrometastáticas residuais dos pacientes [23]. Para esclarecer esta hipótese, novas investigações sobre a correlação entre a existência de células cancerígenas circulantes e da resposta imune do hospedeiro são necessárias.
O estudo foi análise retrospectiva, e os pacientes que devem receber quimioterapia adjuvante não foram definidos antes do tempo. Geralmente, os pacientes que tinham linfonodo positivo foram recomendados para receber quimioterapia adjuvante. Até agora, não existem critérios padronizados para quimioterapia adjuvante do câncer gástrico na China. Nosso estudo mostrou que o número de cópias de mRNA CEA no sangue periférico no diagnóstico inicial foi significativamente associada com a recorrência da doença em pacientes com adenocarcinoma gástrico. No ponto de vista de recidiva, que, por conseguinte, sugerem que os pacientes que têm expressão de ARNm de CEA positivo no pré-operatório receber quimioterapia adjuvante após ressecção radical.

Conclusões Neste estudo, a sensibilidade de ARNm de CEA foi maior do que a de CEA no soro. Além disso, de acordo com a análise de regressão multivariada, CEA mRNA positividade foi um fator independente para recorrência. O presente estudo confirmou que tal método foi promissor para a detecção precoce de CTCs em pacientes com carcinoma gástrico antes do tratamento; pacientes com mRNA CEA positivo pode ter um maior risco de recorrência, mesmo após ressecção curativa. No entanto, um grande estudo prospectivo, randomizado, justifica-se para definir o papel do CEA mRNA detecção no sangue
abreviações
RT-PCR:.
-Transcriptase reversa Polymerase Chain Reaction

CTCs:
circulação células tumorais
CEA:
Antígeno carcinoembrionário
CA19-9:
Carboidratos Antigen 19-9
TNM:
tumor-nódulo-metástase
AJCC: Comité Misto americana do Cancro

GAPDH:
gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase
MMP-7:
metaloproteinase de matriz-7


uPAR:.
-tipo uroquinase de Ativador de Plasminogênio Receptor
Declarações
Agradecimentos
Estes trabalho foi financiado pelo National Natural Science Foundation da China concessão 30672408, Guangzhou Secretaria de Ciência e Tecnologia conceder 2006Z3-E0041 e Sun Yat-sen University 985 Programa Fundo de Iniciação (China). Estamos gratos agradecer aos funcionários do Departamento de Oncologia Médica e Cirurgia GI Oncologia Sun Yat-sen University Cancer Center para a sua sugestão e assistência
material suplementar Electrónicas | 12967_2009_529_MOESM1_ESM.DOC de arquivo adicionais. 1: Dados de literatura para detecção de células tumorais por em tempo real de RT-PCR de mRNA de marcadores. Ela mostra a taxa positiva de marcadores de ARNm a partir da literatura para a detecção de células tumorais por em tempo real de RT-PCR. (DOC 58 KB) Autores 'arquivos enviados originais para imagens
Abaixo estão os links para os autores' arquivos originais apresentados para imagens.

• a expressão da proteína DNA polymeraseη prediz resposta ao tratamento e sobrevivência de doentes com adenocarcinoma gástrico metastático tratados com quimioterapia baseada em oxaliplatina
• A eficácia da ultra-sonografia na verificação da colocação de uma sonda nasogástrica em pacientes com baixa consciência em um centro de emergência