Detekcia carcinoembryonic antigén messenger RNA v krvi za použitia kvantitatívnu real-time reverznej transkriptázy-PCR predvídať recidíve žalúdočné detekcie adenocarcinoma

karcinoembryonálneho antigénu messenger RNA v krvi za použitia kvantitatívnu real-time reverznej transkriptázy-PCR predvídať opakovanie adenokarcinóme žalúdka
abstraktné
pozadia
existencie cirkulujúcich nádorových buniek (CTC) v periférnej krvi ako indikátor recidívy nádoru nebolo jasne preukázané, najmä pre pacientov s rakovinou žalúdka. Vykonali sme retrospektívnu analýzu vzťahu medzi CTC v periférnej krvi pri počiatočnej diagnóze a patologickým nálezy u pacientov s karcinómom žalúdka.
Metódy
Krvné vzorky boli získané od 123 pacientov s karcinómom žalúdka pri počiatočnej diagnóze. mRNA bola extrahovaná a zosilnené pre karcinoembryonální antigén (CEA) mRNA detekciu pomocou real-time RT-PCR. Pravidelné 3-mesačné následné vyšetrenie uvedených v sére CEA a imaging.
Výsledky
minimálna hranica pre opravené CEA mRNA známka [(CEA mRNA /GAPDH mRNA) x 10 6] bola nastavená na 100 ° C. štyridsať päť zo 123 pacientov (36,6%) bolo pozitívnych na expresiu mRNA CEA. Výraz CEA mRNA významne koreluje s T fáze a pooperačný stav recidívy (P
= 0,001). Opakujúce sa ochorenie bolo zistené u 44 123 prípadov (35,8%), a 25 z nich (56,8%) bolo pozitívnych na CEA mRNA. Z týchto pacientov, CEA mRNA bol citlivejší ako v sére CEA v indikujúca opakovanie. Trojročné prežívanie bez ochorenia u pacientov pozitívnych na CEA mRNA bola výrazne horšia ako u pacientov negatívny pre CEA mRNA (P Hotel < 0,001). Iba histologický grade a CEA mRNA pozitivity boli nezávislé faktory pre prežitie bez choroby pomocou multivariačný analýzy.
Závery
CEA mRNA počet kópií v periférnej krvi pri počiatočnej diagnóze bola významne spojená s recidívou ochorenia u pacientov s adenokarcinómom žalúdka. Real-time RT-PCR detekcia hladín pri počiatočnej diagnóze CEA mRNA sa zdá byť sľubnou prediktorom progresie ochorenia u pacientov s adenokarcinómom žalúdka.
Pozadie
rakovinou žalúdka zostáva hlavnou príčinou úmrtnosti na rakovinu po celom svete v priebehu 20. storočia. Jediná osvedčený následná liečba je chirurgická resekcia všetkých hrubých a mikroskopických lézií. Avšak napriek prechádza ozdravnú gastrektómii, vrátane rozšíreného uzlín a adjuvantnej chemoterapie, rakovina vracia v oboch regionálnej i vzdialených miest u väčšiny pacientov [1]. Diagnóza recidívy s bežnými follow-up protokolov zvyčajne vyrobené v neskorom štádiu, čo do istej miery vylučuje možnosť účinnej liečby [2]. Dohľad nad cirkulujúcich nádorových buniek (CTC) Zdá sa, že ponúkajú väčšie možnosti pre skoršiu diagnostiku recidivujúce ochorenie.
Koncepciu vyšetrovania metastatického procesu v periférnej krvi vznikol v 19. storočí, kedy T. R. Ashworth prvýkrát opísal fenomén CTC, a S. Paget predpokladali, non-náhodný vzor rakoviny metastasization (ďalej len "osiva a pôdy 'teórie) [3, 4]. Následne, malígny povahy CTC bola potvrdená tým, že demonštruje, že majú nádorovo špecifické chromozomálne aberácie [5, 6], a že rast ex vivo, ako bunkových línií s malígnym fenotypom [7]. Niekoľko prístupov pre detekciu CTC boli popísané a môžu byť klasifikované do metód na báze PCR a cytometrie metódy [8].
S príchodom kvantitatívnej real-time PCR techniky [9], presné vyčíslenie cieľovej sekvencie že je možné , Kvantitatívne PCR poskytuje vyšetrovateľom nielen technických výhod, ale tiež s applicative výhod, ako je napríklad definícia hodnoty cutoff označujúcich mRNA úrovne expresie klinický význam u pacientov s nádorovým ochorením v porovnaní so zdravými jedincami. PCR v reálnom čase tiež poskytuje možnosti vzájomného vzťahu cieľovej sekvencie zaťaženie s klinickým výsledkom [10], alebo ako odpoveď na liečbu [11].
CEA, pôvodne popísaný ako antigén rakoviny hrubého čreva nádorom, bol klonovaný v roku 1987 a je v súčasnosti považuje za člena superrodiny imunoglobulínu proteín [12]. Mnohé štúdie uvádzajú, detekciu žalúdočných buniek v krvi [13], kostnej drene [14] a peritoneálnej pranie [15] u pacientov s karcinómom žalúdka pomocou real-time PCR pre CEA mRNA.
Cieľom tejto štúdie bolo vyhodnotiť účinnosť CEA mRNA real-time PCR techniky pre včasné odhalenie recidívy. Pre splnenie tohto cieľa, je vzťah medzi klinickým recidívy a krvné hladiny CEA mRNA pred operáciou bola skúmaná u pacientov s adenokarcinómom žalúdka.
Metódy
pacientov
písomný informovaný súhlas bol získaný od každého pacienta o používaní krvných vzoriek pre výskum v súlade s inštitucionálnymi smernicami našej nemocnice. V období od februára 2002 do decembra 2006 celkovo 123 po sebe idúcich pacientov s adenokarcinómom žalúdka pri Cancer Center Sun Yat-sen University bolo zaradených do tejto štúdie. Všetci pacienti dostávali radikálnu resekciu a D2 lymfadenektómia. V lízingu boli k dispozícii pre detekciu 15 lymfatických uzlín. Nebola nájdená žiadna peritoneálnej šírenia. boli požiadaní jasné záznamy o zmenách v sére CEA a vyhodnotení zobrazovacie pred operáciou a každé tri mesiace po operácii. Pacienti, ktorí mali pozitívny lymfatické uzliny boli odporúčané pre príjem adjuvantnej chemoterapii, ale nakoniec len osemdesiat tri pacienti podstúpili adjuvantnú chemoterapiu. Tieto režimy zahrnuté CAPOX (kapecitabín + oxaliplatina 16 prípadov, s mediánom cyklus 4) folfox6 (56 prípadov s mediánom cyklu 6) taxolu + cisplatina (4 prípady, s mediánom cyklu 4) taxolu + 5FU /CF (Fluorouracil /LEUCOVORIN, 7 prípadov s mediánom cyklu 6). Recidivujúce ochorenie, vrátane miestnych recidív a vzdialených metastáz, bola detekovaná vypočítaný vyšetrenia tomografia. Nové lézie by zobrazovacie vyšetrenie zistené v následných schôdzok boli považované za opakovanie. Biopsia nebola vykonaná rutinne určiť histologické opakovania. Všetky zobrazovacie bola hodnotená najmenej dvoma nezávislými pozorovateľmi, vrátane rádiológmi. Stredná doba sledovania bola 37.0 mesiacov (rozsah, 3.0-73.6 mesiacov).
Vzorky krvi
Krvné vzorky boli odoberané pri počiatočnej diagnóze jeden alebo dva dni pred chirurgickým zákrokom. Prvé 3 ml krvi bol odstránený, aby sa zabránilo kontaminácii epidermis, a potom 5 ml vzorka krvi sa získa z periférnej žily. Periférne krvné vzorky získanej z 30 dobrovoľníkov pacientov bez nádorového ochorenia boli použité ako negatívne kontroly
Všetci pacienti poskytované písomný informovaný súhlas .; sme získali samostatný súhlas pre použitie vzorky krvi. Schválenie štúdie bola získaná z nezávislých etických komisií v Cancer Center Sun Yat-Sen University. Štúdia bola vykonaná v súlade s etickými štandardami Svetovej lekárskej asociácie Helsinskej deklarácie o.
Predspracovanie vzorky krvi
Krvné vzorky boli odoberané do skúmaviek obsahujúcich EDTA. Spracovanie vzoriek bolo vykonané v priebehu 2 hodín po odobratí krvi. Krv sa prevedie do 30 ml skúmavky Falcon a centrifugovány pri 1800 otáčkach za minútu pri teplote miestnosti po dobu 20 minút. Sérum bolo odstránené a bunky boli resuspendované v 5 ml fyziologického roztoku a 0,3 ml RNA neskôr roztoku. Po miešaní dobre sa krviniek zmes sa udržuje cez noc pri teplote 4 ° C a skladované pri -80 ° C až do použitia. Extrakcia
RNA a cDNA syntézu
Celková RNA zo vzoriek periférnej krvi sa extrahuje RNAprep Cell Kit (Tiangen , Peking, Čína) podľa protokolu poskytnutého výrobcom. Integrita RNA bola kontrolovaná elektroforézou a kvantifikovať absorpciou pri 260 a 280 nm za použitia UV-viditeľné spektrofotometra (Beckman Coulter Du ® 800, Fullerton, CA). Pre reverznej transkripcii, 1 ug celkovej RNA, 1 ul Oligo (dT) 15, a 1 ul dNTP boli zriedené v 10 ul RNase-free vodou, inkubujú 10 minút pri 37 ° C a 1 ul 25 mmol /l EDTA bol pridaný. O 11 ul alikvotná časť reakčnej zmesi sa inkubujú 10 minút pri 65 ° C a rýchlo sa ochladí na ľade po dobu 2 minút. cDNA uskladnili pri -80 ° C až do použitia. Syntéza cDNA bola vykonaná s použitím metódy TIANScript M-MLV (Tiangen Biotech, Beijing, Čína).
Bunkové línie
Pri príprave na CEA-špecifické RT-PCR, dve bunkové línie, SW-480 (bunková línia karcinómu hrubého čreva ) a boli použité SC-7901 (rakovina žalúdka bunková línia). Lymfocyty boli získané od zdravých dobrovoľníkov bez epitelové malignity. Po lymfocyty boli izolované z periférnej krvi centrifugáciou v gradiente sa mononukleárny bunková vrstva bola oddelená. Bunkové línie boli sériovo riedi (10x) v 2 x 10 7-5 × 10 7-lymfocyty, ako dať karcinóm: pomery lymfocytov v rozmedzí od 1:10 do 1:10 7.
CEA mRNA Analýza real-time kvantitatívnej PCR
kvantitatívnej PCR bola vykonaná s použitím Sequence detekčného systému ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System). PCR priméry a TaqMan sondy boli navrhnuté pomocou softvérového programu Primer Express 1.0. V tomto teste sa upratovanie gén glyceraldehyd 3-fosfát dehydrogenázy (GAPDH) bol použitý ako vnútorná kontrola pre normalizáciu rozdiely v integrite a celkové množstvo RNA extrahované. Tieto PCR v reálnom čase pre GAPDH a CEA vykonávali v oddelených rúr. Hodnoty CEA mRNA boli upravené na hodnoty GAPDH mRNA, a relatívna CEA mRNA výsledky boli prezentované ako mRNA (CEA /GAPDH mRNA) x 10 6 pre každú vzorku.
5 ul vzorky cDNA bola použitá v reálnom time PCR v 20 ul reakčnej zmesi zahŕňajúci 10 pmol vhodných primerov (Invitrogen spolupráca, Japonsko) a 5 pmol TaqMan sondy (Invitrogen spoluprácu, Japonsko). Reportér farbivo (6-karboxy-fluorescein: FAM) bol kovalentne pripojené k 5 'koncu sondy, a zhášacie farbivo (6-karboxy-tetrametyl-rhodamin: TAMRA) bol pripojený k 3' koncu sondy. Teplotný profil použitý pre amplifikáciu boli nasledovné: denaturácia po dobu 1 cyklus pri teplote 95 ° C počas 10 minút, nasleduje 40 cyklov pri teplote 95 ° C počas 10 sekúnd, 60 ° C počas 15 sekúnd, a 72 ° C po dobu 5 sekúnd. Kvantifikácia bola vykonaná pomocou systému detektora sekvencie ABI Prism 7500. Každá sada vzoriek a sériovo nariedených externých kontrol boli zosilnené v dvoch vyhotoveniach. Priemerná hodnota duplikátov bol použitý ako kvantitatívne hodnotou.
CEA-špecifický oligonukleotidové primer bol navrhnutý na základe správy Gerhard et al.
[16]. Sekvencie boli nasledovné: 5'-TGTCGGCATCATGATTGG-3 '(sense) a 5'-GCAAATGCTTTAAGGAAGAAGC-3' (antisencie). Žiarivky a LC-Red sekvencie sondy používané pre identifikáciu CEA boli: 5'-CCTGAAATGAAGAAACTACACCAGGGC-fluoresceín a 5'-LC-Red 640-GCTATATCAGAGCAACCCCAACCAGC-fosfát
v reálnom čase sledovanie PCR bolo dosiahnuté meraním fluorescenčné signál na konci. žíhacie fázy každého cyklu. Tieto sekvencie primérov použité pre amplifikáciu GAPDH boli: 5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3 '(sense) a 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' (antisencie). Sekvencia sond použitá pre identifikáciu GAPDH boli nasledujúce: 5'-TCAACAGCGACACCCACTCCT-fluoresceín a 5'-LC-Red 640-CACCTTTGACGCTGGGGCT-fosfát
Stanovenie CEA v sére vzoriek
predoperačné vzorky séra boli taktiež použité pre testovanie. nádorový marker CEA s použitím komerčne dostupného enzymoimunoanalýzy súpravy (Cobas Jadro EIA, Roche, Bazilej, Švajčiarsko). . Patologické limitná hodnota bola stanovená na 5 ng /ml pre sérum CEA
štatistické analýzy
štatistickou metódou Kaplan-Meier bola použitá na analýzu klinické rysy a opakovanie; Rozdiely boli odhadnuté pomocou log-rank testu. Prognostické faktory boli skúmané jednorozmerné a viacrozmerné analýzy (log-rank test pre jednorozmerné analýzy a Cox pomerného rizika regresného modelu, spätné postupným (podmienené LR) pre viacrozmerné analýzy). Chi-kvadrát a Fisherov presný testy boli použité pre štatistickú analýzu. Všetky štatistické analýzy boli vykonané s SPSS16.0. . Všetky hodnoty P boli 2-sledoval a úroveň významnosti bola nastavená na 0,05
Výsledky
Klinické príznaky
123 zapísaných pacientov vo veku 28 až 84 rokov (priemer, 57.11 rokov; medián, 59 rokov), a pomer mužov ženám bol 82:41 (tabuľka 1). Inscenácia bola vykonaná v súlade s Tumor-Node-metastázy (TNM) klasifikáciu spoločného výboru amerického rakoviny (AJCC, revidovaný 1997). Dvadsaťštyri nádory boli umiestnené v kardio, 3 v žalúdku fundu, 44 v žalúdočnej korpusu, 45 v žalúdočnej dutine, 5 zahŕňal celý žalúdok, a 2 patril k zvyškovej karcinómu žalúdka (tabuľka 1) .Table 1 patologickým rysy a CEA * mRNA expresie detekovaná real-time RT-PCR
Charakteristika
celkový počet
(N = 123)
CEA mRNA
hodnotou P
pozitívny
(n = 45)
Negatívne
(n = 78)

Vek
≤40
13 Sims 3
10
41-50
20
9
11
51-60
39
9
30
61-70
42
18
24 Hotel > 70
9
6 Sims 3
0,063
Sex
Žena
41
12
29
Male
82
33
49
0,234
Tumor
T1
10
6
4
T2
16 Sims 3
13
T3
73
26
47
T4
24
10
14
0,001
lymfatických uzlín
N0
31
11
20
N1
43
15
28
N2
29
8
21
N3
20
11
9
0,261
patologické TNM # etapa
Aj
16
7
9
II
21
6
15
III
51
17
34
IV
35
15
20
0,623
histológia subtyp
Dobre diferencovaný adenokarcinóm Sims 3 foto 1
2
Stredne diferencovaný adenokarcinóm
27
7
20
Zle diferencovaného adenokarcinómu
93
37
56
0,418
Serum CEA stav
Pozitívne
30
11
19
Negatívne
93
34
59
0,992
recidíva
Áno
44
25
19
Nie
79
20
59
0,001
režimy opakovania
lokálnej recidívy
8
4
4
brušnej dutiny
9
6 Sims 3
pečene
8
5 Sims 3
panvovej
6 Sims 3 Sims 3
viac lokalít
10
5
5
ostatné Sims 3
2 foto 1
0,959
* Karcinoembryonální antigén
# TNM znamená nádorovú-node-metastáz
citlivosť detekcie CEA mRNA real-time RT-PCR
CEA mRNA bola detekovaná v SW -480 a SC-7901 bunkové línie. Spodná hranica detekcie bola koncentrácia 10 nádorových buniek na 10 7 lymfocytov. Konvenčné nested RT-PCR bola použitá pre potvrdenie citlivosti produktu RT-PCR.
Expres CEA mRNA v krvi
expresie CEA mRNA bola detekovaná u 9 z 30 (30,0%) pacientov s non-rakovinové a stredné opravená CEA mRNA polčas 7,5 (rozmedzie 0 až 92,5). Maximálna hodnota korigovaný výsledok CEA mRNA bez malignity u pacientov bol 92,5, takže limitná hodnota 100 bol použitý v tejto štúdii. Použitie tejto limitnej hodnoty, 45 pacientov (36,6%) bolo diagnostikovaných ako CEA mRNA pozitívne. Priemerná korigovaná CEA mRNA známka [(CEA mRNA /GAPDH mRNA) x 10 6] z 123 pacientov bol 37,510.0 (v rozmedzí od 0-3,695,652.1) kópie Obrázok 1 ukázala distribúciu (CEA mRNA /GAPDH mRNA) × 10 6 v tejto skupine pacientov. Obrázok 1 Distribúcia CEA úrovne expresie. Ratio prostriedky (CEA mRNA /GAPDH mRNA) × 106. Vzhľadom na pomer u niektorých pacientov boli nulové, sme pridali 0,5 pomeru.
Vzťah medzi CEA expresie mRNA a patologickým funkcií
expresie CEA mRNA nekoreluje s vek, pohlavie, N štádium, TNM štádium, histologický podtyp a sérum CEA stavu (tabuľka 1). Avšak, pacienti s pooperačnou recidívy mali signifikantne vyšší podiel CEA mRNA pozitívne, než tie, ktoré bez recidívy (P
= 0,001) (tabuľka 1). Okrem toho, hĺbka nádor tiež pozitívne koreluje s expresiou CEA mRNA (P
= 0,001).
Vzťah medzi recidívy a expresie CEA mRNA, rovnako ako sérum CEA
režim opakovania zahŕňa 8 lokálne recidívy, 9 brušné šírenie s výnimkou pečene, 8 pečeňových metastáz, 6 panvové metastáz, 3 iných miestach metastáz a 10 viacerých miestach metastáz. Neexistuje žiadny významný rozdiel medzi expresiou CEA mRNA a režim opakovania (Tabuľka 1).
Rekurentné ochorenia bola nájdená v 44 z 123 prípadov (35,8%). Dvadsať päť z týchto pacientov (56,8%) bolo CEA mRNA pozitívne. Naproti tomu iba 14 pacientov s recidivujúce ochorenie (31,8%) bolo pozitívnych na predoperačné séra CEA. Špecifiká CEA mRNA a sérového CEA sa označujú opakovania bolo 74,7% a 79,9%, resp. (Tabuľka 2) .Table 2 Porovnanie medzi CEA * mRNA a sérového CEA v predikciu recidívy

CEA mRNA
sérum CEA

Positive

Negative

Positive

Negative

Recurrence
Yes
25
19
14
30
Nie
20
59
16
63
P
0,001 0,152
X
2
12,088
2,050
Citlivosť (%)
56,8
31,8
Špecifickosť (%)
74,7
79,7
* Karcinoembryonální antigén
Jednorozmerná a viacrozmerné analýza 3-ročné prežitie bez známok ochorenia
5-ročnej celkové prežitie bol 58,9% a 3 roky bez prejavu choroby prežitie bolo 63,9%. Obaja jednorozmerné a mnohorozmerné analýzy boli použité na vyhodnotenie faktory, ktoré ovplyvňujú prežívanie bez známok ochorenia. Podľa jednorozmerné analýze, veku, hĺbka nádorov, metastáz v lymfatických uzlinách, histologického stupňa, TNM štádium, CEA mRNA pozitivity a v sére CEA pozitivita významne súvisí s prežitie bez choroby (P
= 0,031, a 0,001, 0,001, 0,022, < 0,001, 0,001, 0,045, respektíve) (tabuľka 3). Viacrozmerná regresná analýza ukázala, že iba histologický grade a CEA mRNA pozitivity boli nezávislé faktory pre prežitie bez choroby (P
= 0,047 a 0,020, respektíve tabuľka 4). prežitia bez príznakov ochorenia trojročnej CEA mRNA-pozitívnych pacientov boli výrazne nižšie ako u negatívnych pacientov CEA mRNA (43,9% oproti 74,1% v uvedenom poradí, P
= 0,001, obrázok 2) .Table 3 Jednorozmerná analýza k chorobe prežitia bez karcinómu žalúdka
Parameter
prežitie bez príznakov ochorenia, P valuea
Age Hotel < 59 vs. ≥59
0,031
rodovej rovnosti
Muž vs. samica
0,433
CEA mRNA
(+) versus (-)
0,001
Serum CEA
(+) vs. (-)
0,045
histologického stupňa
No /mierne vs. zle
0,022
pT
pTis /PT1 vs. pt2 /PT3 /PT4 Hotel < 0,001
pn
(+) vs. (-)
0,001
Stage
1/2 3/4 vs. Hotel < 0.001
adjuvantnej chemoterapie agenti
CAPOX vs. mFOLFOX6 vs. Taxol + DDP vs. Taxol + 5FU /CF
0,850
Log-rank test
Tabuľka 4 viacrozmerné analýzy prežitia bez ochorenia v karcinómu žalúdka
Faktory
Charakteristika
pomer rizika
95% CI
P value

Unfavorable

Favorable

Age
≥59
<59
1.018
0.986-1.050
0.273
Histological grade
Poorly
Well/moderately
0.412
0.171-0.990
0.047
pT
2/3/4
Tis/1
1.673
0.100-8.690
0.947
pN
(+)
(-)
2.030
0.264-15.611
0.497
Stage
3/4
½
1.437
0.124-16.613
0.771
CEA mRNA
(+)
(-)
2,243
1,138-4,424
0,020
Serum CEA
(+)
(-)
1,130
0,582 až 2,194 0,717
CI, interval spoľahlivosti; PT, hĺbka invázie nádoru
Obrázok 2 Prežívanie bez príznakov ochorenia pacientov podľa výrazu CEA mRNA. Trojročné prežívanie bez známok ochorenia CEA mRNA-pozitívnych pacientov bol významne nižší ako u CEA mRNA-negatívnych pacientov (43,9% oproti 74,1%, v uvedenom poradí; P
= 0,001).
Diskusia
semi množstevné povahy tradičné PCR technológie robil to ťažké odlíšiť základné línie hladiny génovej expresie v normálnych tkanivách zo zvýšených hladín génovej expresie v karcinómu, čím sa zvyšuje záujem o falošne pozitívnych výsledkov [17]. V našej štúdii, real-time PCR CEA mRNA bol použitý k preskúmať možnosť periférnej krvi ako zdroja pre detekciu CTC a predikciu recidívy rakoviny u pacientov s karcinómom žalúdka. Real-time kvantitatívna analýza CEA mRNA u pacientov s rakovinou sa často vykonáva na základe CEA mRNA pozitivity, ktorá je stanovená za použitia limitný [13]. CEA mRNA môže byť detekovaná u pacientov s benígne ochorenie, rovnako ako u zdravých dobrovoľníkov, tak limitné hodnoty sú zvyčajne stanovená maximálna expresie v nemalígna pacientov [18, 19]. Setoyama T et al. zistené, že maximálna hodnota CEA mRNA bez malígneho ochorenia u pacientov, 8,6, sa preto nastaviť hraničnú hodnotu ako 9,0 [20]. Schuster R et al. [21] tiež použiť maximálnu hodnotu zdravých dobrovoľníkov pozadí ako hodnota cut-off pre detekciu CEA mRNA u pacientov s kolorektálnym karcinómom. V našej štúdii sme tiež použiť maximálnu hodnotu korigované skóre CEA mRNA u pacientov bez malignity ako hodnota cut-off. Vytvorením limitnú hodnotu 100 pre normalizovanej hladiny CEA mRNA, môžeme rozlíšiť pacientov s rakovinou od pacientov bez nádorového ochorenia, a preto väčšou istotou uvažovať expresiu mRNA CEA ako marker cirkulujúcich nádorových buniek.
Zistili sme, že 10 u pacientov s nádorom T1, 6 pacientov malo pozitívny expresie CEA-mRNA. Ale žiadny záznam recidívy bola zistená u 10 pacientov. Zdá sa, že neexistuje žiadny vzťah medzi expresiou CEA mRNA a recidívy u T1 nádoru. Je ťažké vysvetliť vysoký kladný výnos vo forme CEA-mRNA u pacientov s T1, ale zistili sme, že expresia CEA mRNA bola nízka u pacientov T1 6, od 4320 kópií na 44 600 výtlačkov. Ikeguchi M [22] hlásil, že 12,5% z etapy Aj pacienti karcinóm žalúdka vyjadril CK20 mRNA a oni za to, že bola vyvolaná malým CK20 výrazom v periférnych bielych krviniek.
Niekoľko správ boli posúdené stav CTC v žalúdočnej karcinóm pacientov pred liečbou. Ikeguchi a Kaibara hlásených [23], že nemohli nájsť žiadne rakovinové bunky v periférnej krvi od pacientov neliečených karcinómu žalúdka. Autori špekulujú, že rakovinové bunky nepreukázalo, že by ľahko preniesť do periférnej krvi z primárnych nádorov u pacientov s neliečeným karcinómu žalúdka. Naproti tomu Miyazono et al.
, [24] ukázal, že pozitivita pre CEA mRNA u pacientov s karcinómom žalúdka bolo 8,8% pred začatím prevádzky. Prítomnosť CTC pred ošetrením a jeho vzťah ku klinickým výsledkom tak zostáva kontroverzné. V tejto štúdii sme hodnotili klinický význam CTC v krvi pred operáciou pomocou real-time RT-PCR pre detekciu expresie CEA mRNA. Pozitívne Miera CEA mRNA pred vykonaním akýchkoľvek úprav je 36,6%. Ďalší súbor 1 ukazuje pozitívny počet markerov mRNA z literatúry pre detekciu nádorových buniek v reálnom čase RT-PCR.
O'Sullivan et al.
[25] navrhol, že predoperačné detekcia micrometastasis môže odrážať buď prechodné ubúdanie buniek, metastatické potenciálu alebo reziduálne choroby. V tejto štúdii sme zistili, že CTC boli zistené v krvi pred začatím liečby, pokiaľ ide o opakovanie. Niektoré štúdie preukázali, že predoperačné detekciu cirkulujúcich nádorových buniek bol jasný marker zlého prežitie pacienta, pretože v mnohých prípadoch sa cirkulujúcich nádorových buniek pred operáciou ukázali buď predĺženou lymfatických uzlín alebo vzdialené metastázy, tak prognóza týchto pacientov bola chudobná [26-28 ]. V súčasnej štúdii sme zistili, že expresia mRNA CEA bola významne súvisí s recidívy ochorenia. Okrem toho, pacienti s pozitívnym CEA mRNA mal kratšiu 3-ročnú výsledok prežitie bez príznakov ochorenia. Výskyt recidívy bola významne vyššia u pacientov pozitívnych na CEA mRNA než u negatívne.
Citlivosť expresie mRNA CEA predpovedať opakovanie je len 56,8%. Devätnásť sedemdesiatich ôsmich pacientov (24,4%) s negatívnym výrazom CEA mRNA mal k recidíve nádoru. Setoyama et al.
[20] ukázal, že 8 z 69 (11,6%) pacientov ezofageálnou karcinóm s negatívnou expresie CEA mRNA mala relapsu ochorenia a 6 pacientov k recidíve lymfatických uzlín. Jedným z často používa vysvetlení zlyhania detekcie je, že cirkulujúca bunky nie sú rovnomerne distribuované a nespojito uvoľnená do obehu [29, 30]. Ďalej, ideálne značka (nelegitímne expresie v krvi, vysoká expresia v nádorových bunkách), nebol doteraz nájdený. Mimo CEA mRNA, ďalšie transkripty, vrátane cytokeratin (CA) 18 [31], matrix metaloproteinázy (MMP) -7 [32], CK 20 [33], Urokináza typu aktivátor plazminogénu receptor (Upar), CK 19 a CK 7 [ ,,,0],34], boli vyskúšané ako potenciálny markery CTC. Avšak, nádorové bunka prošlupu by mal byť pomerne vzácna udalosť. To znamená, či periférnej krvi je vhodný priestor pre včasnú detekciu mikrometastáz je ešte sporný. Ostatné priehradky, ako je kostnej drene alebo brušnej dutiny je známe, že vyššie rýchlosti detekcie, pravdepodobne v dôsledku väčšieho počtu nádorových buniek prítomných [35-37].
Ďalšou dôležitou otázkou je falošne pozitívne expresie CEA mRNA. Dvadsať pacientov (44,4%), ktorí mali pozitívny CEA expresiu mRNA nezaznamenala opakovaní v následných krokoch. Jedným z dôvodov môže byť relatívne krátka follow-up obdobia.
Alternatívne môže to byť celkom rozumné, pretože len málo bunky karcinómu vrhnúť do krvného obehu podarí nadviazať metastatické ochorenie [25]. Tieto cirkulujúce rakovinové bunky nemusí pripojiť k vzdialených orgánov a nemusí rásť. V poslednej dobe Méhes et al.
, [38] skúmali morfológiu cirkulujúcich nádorových buniek a zistilo sa, že väčšina cirkulujúcich buniek karcinómu prsníka bol v stave apoptózy. V periférnej krvi pacientov s rakovinou, sa pozorovala existencia nádorové bunky lymfocytov komplexu [39]. Tieto zistenia naznačujú, že makrofágy alebo lymfocyty by mohol zohrávať dôležitú úlohu v indukcii cirkulujúcich nádorových buniek apoptózu a protinádorové imunitnej odpovede hostiteľa. Tieto očkované makrofágy môžu vnímavosť cytotoxické T lymfocyty hostiteľa, aj citlivé T lymfocyty môže zaútočiť na zvyškové mikrometastatické rakovinové lézie pacientov [23]. Na objasnenie tejto hypotézy, ďalšie vyšetrovanie ohľadom koreláciu medzi existenciou cirkulujúcich nádorových buniek a imunitný reakcie hostiteľa sú nevyhnutné.
Súčasná štúdia bola retrospektívna analýzu, a pacienti, ktorí by mali byť liečení adjuvantnej chemoterapii neboli stanovené vopred. Všeobecne platí, že bolo odporučené u pacientov, ktorí mali pozitívnu lymfatické uzliny dostávať adjuvantnej chemoterapii. Doteraz neexistujú žiadne štandardné kritériá pre adjuvantnej chemoterapii rakoviny žalúdka v Číne. Naša štúdia ukázala, že počet CEA mRNA kópií v periférnej krvi pri počiatočnej diagnóze bola významne spojená s recidívou ochorenia u pacientov s adenokarcinómom žalúdka. V pohľade opakovanie, preto ukazujú, že pacienti, ktorí majú pozitívny expresie CEA mRNA pred operáciou adjuvantnej chemoterapii po radikálnej resekcii.
Závery
v tejto štúdii, je citlivosť CEA mRNA bola vyššia ako v sére CEA. Okrem toho, v závislosti na základe viacnásobnej regresnej analýzy, CEA mRNA pozitivity bol nezávislý faktor recidívy. Súčasná štúdia potvrdila, že takýto spôsob bol sľubný pre včasnú detekciu CTC u pacientov s karcinómom žalúdka pred liečbou; Pacienti s pozitívnym CEA mRNA môžu mať vyššie riziko recidívy aj po kuratívnu resekcii. Avšak, veľké randomizovanej prospektívnej štúdie je zaručené, že definovať úlohu CEA mRNA detekciu v krvi
Skratky
RT-PCR :.
Reverzný transkriptázy-polymerázová reťazová reakcia

CTC:
Cirkulujúce nádorové bunky
CEA:
Karcinoembryonální Antigen
CA19-9:
Sacharidy Antigen 19-9
TNM:
Tumor-Node-metastázy
AJCC:
amerického spoločného výboru pre rakovine
GAPDH:
glyceraldehyd 3-fosfát dehydrogenázy
MMP-7:
Matrix metaloproteinázy-7


Upar :.
urokináza typu aktivátor receptoru
deklarácia
Poďakovanie
tieto práce boli financované z národnej prírodnej Science Foundation of China grantu 30672408, Guangzhou Bureau of Science and Technology udeliť 2006Z3-E0041 a Sun Yat-sen University 985 Program Začatie fond (Čína). S vďačnosťou poďakovať zamestnancov v oddelení klinickej onkológie a GI chirurgie onkológie na Sun Yat-sen University Cancer Center pre ich návrh a pomoc
elektronický doplnkový materiál
12967_2009_529_MOESM1_ESM.DOC Ďalší súbor 1 :. Údaje z literatúry detekcia nádorových buniek v reálnom čase RT-PCR z mRNA markerov. To ukazuje pozitívny počet markerov mRNA z literatúry pre detekciu nádorových buniek v reálnom čase RT-PCR. (DOC 58 KB) autorov pôvodné predloženej súbory obrazov
Nižšie sú uvedené odkazy na autorov pôvodnej predložených súborov pre obrázky. Žiadne výhody, v akejkoľvek forme boli prijaté alebo budú prijaté z obchodného stranou spojenú priamo alebo nepriamo k predmetu nášho článku.

• Korupciou polymeraseη expresie proteínov predpovedá liečebnú odpoveď a prežitie pacientov s metastatickým adenokarcinómom žalúdka liečení chemoterapiou na báze oxaliplatiny
• Účinnosť ultrazvuku pri overovaní umiestnenie nazogastrickou sondou u pacientov s nízkym vedomie pri núdzovom centre