Обнаружение антигена карциноэмбриональному РНК в крови с использованием количественного в режиме реального времени с использованием обратной транскриптазы-полимеразной цепной реакции для прогнозирования рецидива аденокарциномы желудка

Обнаружение раково антигена РНК в крови с использованием количественной в реальном времени с использованием обратной транскриптазы-полимеразной цепной реакции для прогнозирования рецидива аденокарциномы желудка
Аннотация
фон
Существование циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) в периферической крови в качестве показатель рецидива опухоли не было четко установлено, в частности, для больных раком желудка. Мы провели ретроспективный анализ взаимосвязи между ЦОК в периферической крови в начальной диагностики и клинико-морфологических симптомов у пациентов с раком желудка.
Методами
Образцы крови были получены из 123 больных раком желудка при начальной диагностике. мРНК экстрагировали и амплифицировали для раково антигена (CEA) обнаружения мРНК с использованием в режиме реального времени RT-PCR. Периодические 3-месячные последующие обследования включали измерения сыворотки СЕА и визуализации.
Результаты
минимальный порог для скорректированного мРНК CEA оценка [(CEA мРНК /GAPDH мРНК) × 10 6] была установлена ​​на уровне 100. Сорок пять из 123 пациентов (36,6%) были положительными для экспрессии CEA мРНК. экспрессия СЕА мРНК достоверно коррелирует со стадией Т и послеоперационного состояния рецидива (P = 0,001
). Рецидив болезнь была обнаружена у 44 из 123 случаев (35,8%), и 25 из них (56,8%) были позитивными для мРНК CEA. Из этих пациентов, CEA мРНК была более чувствительна, чем в сыворотке CEA в указывает на рецидив. Трехлетняя безрецидивная выживаемость пациентов, положительных по мРНК СЕА была значительно беднее, чем у пациентов с отрицательным для мРНК CEA (P &
л; 0,001). Только гистологическое сортность и CEA мРНК положительность были независимыми факторами для выживаемости без признаков заболевания с использованием многомерного анализа.
Выводы
мРНК CEA число копий в периферической крови при начальной диагностике была в значительной степени связано с рецидивом заболевания у пациентов желудка аденокарциномы. В режиме реального времени RT-PCR определение уровней СЕА мРНК при начальной диагностике, как представляется, является перспективным прогностическим фактором рецидива заболевания в желудочных больных аденокарциномы.
Фон
рак желудка остается ведущей причиной смертности от рака во всем мире на протяжении всего 20-го века. Единственным доказанным лечебным лечение является хирургическое удаление всех грубых и микроскопических повреждений. Однако, несмотря на переживает целебное гастрэктомию, в том числе рассечение узла расширенной лимфы и адъювантной химиотерапии, рак рецидивирует в как региональных, так и отдаленные участки у большинства пациентов [1]. Диагностика рецидива с общим принятия последующих протоколов, как правило, производится на поздней стадии, что, в определенной степени, исключает возможность эффективного лечения [2]. Наблюдение циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК), кажется, предлагает больше возможностей для ранней диагностики рецидива заболевания.
Концепция исследования метастатического процесса в периферической крови возникла в 19 веке, когда T.R. Ашуорт впервые описал явление ЦОК, и С. Паже выдвинул гипотезу неслучайный шаблон метастазирования рака ( «семя и почвы" теории) [3, 4]. Впоследствии, злокачественный характер ЦОК было подтверждено, продемонстрировав, что они обладают опухольспецифические хромосомных аберраций [5, 6], и что они растут ех естественных условиях в клеточных линиях с злокачественного фенотипа [7]. Существует несколько подходов к обнаружению CTCs были описаны и могут быть подразделены на методы на основе ПЦР и цитометрическими методов [8].
С появлением количественного реального времени метод ПЦР [9], точное определение количества последовательности-мишени, становится возможным , Количественная ПЦР обеспечивает исследователей не только с техническими преимуществами, но и с аппликативными преимуществами, такими как определение значений среза, указывающими уровни экспрессии мРНК клиническое значение у больных раком по сравнению со здоровыми субъектами. ПЦР в реальном времени также дает возможности соотнесения нагрузки целевой последовательности с клиническим исходом [10] или ответа на терапию [11].
CEA, первоначально описанный как антиген рака толстой кишки ассоциированных с опухолью, был клонирован в 1987 году и в настоящее время признается в качестве члена иммуноглобулина белка подсемейства [12]. Многие исследования сообщили обнаружение желудочных клеток в крови [13], костного мозга [14], и перитонеального стирки [15] у больных раком желудка с помощью ПЦР в реальном времени для мРНК CEA.
Целью данного исследования было оценить эффективность ПЦР в реальном времени методом CEA мРНК для раннего выявления рецидива опухоли. Для достижения этой цели, взаимосвязь между клиническим рецидивом и уровнем в крови мРНК CEA дооперационно исследовали в желудочных больных аденокарциномы.
Методы
пациентов
Письменное информированное согласие было получено от каждого пациента на использование образцов крови для исследования в соответствии с ведомственным руководящим принципам нашей больницы. В период с февраля 2002 года по декабрь 2006 года в общей сложности 123 последовательных пациентов с аденокарциномой желудка при Онкологическом центре Сунь Ят-сена университета были зачислены в исследование. Все пациенты получали радикальной резекции и D2 лимфаденэктомии. При аренде 15 лимфатических узлов были доступны для обнаружения. Ни один перитонеальный распространение не было найдено. были необходимы четкие записи изменений в сыворотке CEA и оценки изображения до операции и через каждые три месяца после операции. Пациенты, которые имели положительный лимфоузел было рекомендовано получать адъювантной химиотерапии, но в конце концов только восемьдесят три пациента прошли адъювантной химиотерапии. В схемы включены CAPOX (капецитабин + оксалиплатин, 16 случаев, со средним циклом 4), folfox6 (56 случаев, со средним циклом 6), таксол + цисплатин (4 случая, со средним циклом 4), таксол + 5ФУ /CF (фторурацил /лейковорин 7 случаев, средний цикл 6). Рецидив заболевания, в том числе местных рецидивов и отдаленных метастазов, была обнаружена с помощью компьютерной томографии экспертизы. Новые повреждения, обнаруженные при осмотре изображений в последующих встречах рассматривались как рецидив. Биопсия не было сделано обычно для определения гистологического рецидива. Все изображения оценивали по крайней мере, двух независимых наблюдателей, в том числе радиологов. Средний период наблюдения был 37,0 месяцев (диапазон, 3.0-73.6 месяцев).
Образцы крови
Образцы крови были собраны на первоначальный диагноз один или два дня до операции. Первые 3 мл крови отбрасывали, чтобы предотвратить загрязнение эпидермальный, а затем образец крови 5-мл получали из периферической вены. Периферийные образцы крови, полученные от 30 нераковых добровольцев пациентов использовались в качестве отрицательного контроля
Все пациенты дали письменное информированное согласие.; мы получили отдельное согласие на использование образца крови. утверждение Исследование было получено от независимых комитетов по этике при Онкологическом Центре Сунь Ят-Сена университета. Исследование было проведено в соответствии с этическими стандартами Всемирной медицинской ассоциации Хельсинкской декларации.
Предварительная обработка образцов крови
Образцы крови были собраны в ЭДТА пробирки, содержащие. Обработка проб проводили в течение 2 часов после забора крови. Кровь переносили в пробирку 30 сокола-мл и центрифугировали при 1800 оборотах в минуту при комнатной температуре в течение 20 минут. Сыворотку удаляли и клетки ресуспендировали в 5 мл физиологического раствора и 0,3 мл РНК более позднего раствора. После перемешивания хорошо, клетки крови, смесь выдерживали в течение ночи при 4 ° С и хранили при -80 ° C до использования. Экстракции
РНК и синтез кДНК
Суммарную РНК из образцов периферической крови, экстрагируют с помощью RNAprep Cell Kit (Tiangen , Пекин, Китай) в соответствии с протоколом, предоставляемая производителем. Целостность РНК оценивали с помощью электрофореза и количественно оценивали по поглощению при 260 и 280 нм с помощью УФ-спектрофотометр (Beckman Coulter Ду ® 800, Фуллертон, СА). Для обратной транскрипции 1 мкг общей РНК, 1 мкл олиго (дТ) 15, и 1 мкл дНТФ разводили в 10 мкл РНКазы воды, инкубировали в течение 10 минут при температуре 37 ° С и добавляли 1 мкл 25 ммоль /л ЭДТА. 11 мкл аликвоты реакционной смеси инкубировали в течение 10 минут при температуре 65 ° С и быстро охлаждают на льду в течение 2-х минут. кДНК хранили при -80 ° C до использования. синтез кДНК осуществляли с использованием метода TIANScript M-MLV (Tiangen Biotech, Пекин, Китай).
Клеточные линии
Чтобы подготовиться к СЕА-специфической ОТ-ПЦР, две клеточные линии, SW-480 (линия клеток рака толстой кишки ) и были использованы SC-7901 (клетку рака желудка линия). Лимфоциты были собраны у здоровых добровольцев без эпителиальной злокачественной опухоли. После того, как лимфоциты были выделены из периферической крови путем центрифугирования в градиенте, мононуклеарных клеток слой собирали. Клеточные линии, последовательно разводили (10-кратное) в 2 × 10 7 до 5 × 10 7-лимфоциты, чтобы дать клеточной карциномы: соотношение лимфоцитов в диапазоне от 1:10 до 1:10 7.
CEA мРНК Анализ в режиме реального времени количественной ПЦР
Количественную ПЦР проводили с использованием последовательности Detector System, ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time System ПЦР). ПЦР-праймеры и зонды TaqMan были разработаны с использованием программы 1.0 программного обеспечения Primer Express. В этом анализе, домашнее хозяйство гена глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (GAPDH) использовали в качестве внутреннего контроля для нормализации вариации целостности и общего количества РНК, экстрагированных. В ПЦР в реальном времени анализы для GAPDH и СЕА были выполнены в виде отдельных трубок. Значения СЕА мРНК были скорректированы в отношении значений GAPDH мРНК, и были представлены относительные показатели СЕА мРНК в качестве (CEA мРНК /GAPDH мРНК) × 10 6 для каждого образца.
5 мкл кДНК образец использовали для вещественно время ПЦР в 20 мкл реакционной смеси, состоящей из 10 пмоль соответствующих праймеров (Invitrogen сотрудничества, Япония) и 5 ​​пмоль TaqMan зондом (Invitrogen сотрудничества, Япония). Репортер краситель (6-карбокси-флуоресцеина: FAM) был ковалентно присоединен к 5'-концу зонда, и гаситель краситель (6-карбокси-тетраметил-родамина: TAMRA) был присоединен к 3'-концу зонда. Температурный профиль Для амплификации использовали следующим образом: денатурация в течение 1 цикл при 95 ° С в течение 10 мин, затем 40 циклов при 95 ° С в течение 10 секунд, при 60 ° C в течение 15 секунд и при 72 ° С в течение 5 секунд. Количественное было сделано с помощью системы детектора последовательности ABI Prism 7500. Каждый набор образцов и серийно разведенной внешнего контроля были усилены в двух экземплярах. Среднее значение дублей использовали в качестве количественного значения.
СЕА-специфический олигонуклеотидный праймер был разработан на основе доклада Gerhard и др.
[16]. Последовательности: 5'-TGTCGGCATCATGATTGG-3 '(смысловой) и 5'-GCAAATGCTTTAAGGAAGAAGC-3' (антисмысловой). Флуоресцентные и LC-красный последовательности зонд, используемый для идентификации СЕА: 5'-CCTGAAATGAAGAAACTACACCAGGGC-флуоресцеина и 5'-LC-красный 640-GCTATATCAGAGCAACCCCAACCAGC-фосфат
ПЦР в реальном времени мониторинг достигалось путем измерения сигнала флуоресценции в конце. отжига фазы каждого цикла. Последовательности праймеров, используемых для амплификации GAPDH были: 5'-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3 '(смысловой) и 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' (антисмысловой). Зонд последовательности, используемые для идентификации GAPDH были: 5'-TCAACAGCGACACCCACTCCT-флуоресцеина и 5'-LC-640 Red-CACCTTTGACGCTGGGGCT-фосфат
Определение СЕА в образцах сыворотки
Дооперационные образцов сыворотки были также использованы для опробования. опухолевый маркер СЕА с использованием коммерчески доступного набора для иммуноферментного анализа (Cobas Core, EIA, Roche, Базель, Швейцария). . Был установлен Патологический уровень отсечки при 5 нг /мл для сыворотки CEA
Статистический анализ
Статистический метод Каплана-Мейера использовали для анализа клинических признаков и рецидивов; различия были оценены с помощью теста лог-ранга. Прогностические факторы были рассмотрены одномерных и многомерных анализов (лог-ранговый для однофакторного анализа и Кокса регрессионной модели, обратной ступенчато (условное LR) для многофакторного анализа). Хи-квадрат и Фишера точные тесты были использованы для статистического анализа. Все статистические анализы были сделаны с SPSS16.0. . Все значения P были 2 хвостами, и уровень значимости был установлен на уровне 0,05
Результаты
Клинические особенности
123 пациентов, включенных в исследование в возрасте от 28 до 84 лет (в среднем 57,11 лет; медиана, 59 лет), а соотношение мужчин и женщин было 82:41 (таблица 1). Постановка была выполнена в соответствии с опухолью-Node-Метастазы (TNM) классификации американского Объединенного комитета по вопросам рака (AJCC, пересмотренным в 1997 году). Через двадцать четыре опухоли были расположены в кардии, 3 в желудочном глазном дне, 44 в желудочном корпусе, 45 в антральном отделе желудка, 5 охватили весь желудок, и 2 принадлежали Остатка рака желудка (таблица 1) .table 1 Клинико-патологические особенности и CEA * экспрессия мРНК обнаруживается в реальном времени RT-PCR
Характеристика

Общее количество
(N = 123)

мРНК CEA

значение P

позитиве
(п = 45)

Негативный
(п = 78)
<бр> Возраст
≤40
13 страница 3 из 10
41-50
20
9
11
51-60
39
9
30
61-70
42
18
24
> 70
9
6 страница 3 0,063
Секс <бр> Женский
41
12
29
Мале
82
33
49
0,234
Опухоль
T1
10
6 4
T2
16 страница 3 из 13
T3
73
26
47
T4
24
10
14
0,001
лимфоузлов
n0
31
11
20
N1
43
15
28
N2 <бр> 29
8
21
N3
20
11
9
0,261
Патологические TNM # этап
I
16
7
9
II
21
6
15
III
51
17
34
IV
35
15
20
0,623
гистологии подтип
Хорошо дифференцированная аденокарцинома страница 3 1 страница 2 Умеренно дифференцированная аденокарцинома
27
7
20
Плохо дифференцированная аденокарцинома
93
37
56
0,418
Сыворотка CEA состояние
Положительный
30
11
19
Отрицательный
93 <бр> 34
59
0,992
Рецидив
Да
44
25
19
Нет
79
20
59
0,001
Режимы повторения
местного рецидива
8 4
4
брюшную полость
9
6 страница 3 из печени
8 <бр> 5 страница 3 тазовые
6
3 страница 3 Несколько сайтов
10
5 страница 5 других страница 3 2
1
0,959
* Карциноэмбриональный антиген
# TNM обозначает опухоль-узла-метастаз
чувствительности обнаружения мРНК СЕА в режиме реального времени RT-PCR мРНК
СЕА была обнаружена в SW -480 и SC-7901 клеточные линии. Нижний предел обнаружения была концентрация 10 опухолевых клеток на 10 7 лимфоцитов. Обычные вложенная RT-PCR использовали для подтверждения чувствительности продукта RT-PCR.
Экспрессию CEA мРНК в крови
экспрессия СЕА мРНК был обнаружен в 9 из 30 (30,0%) пациентов без рака, и среднее значение исправленный счет CEA мРНК 7,5 (диапазон, 0-92.5). Максимальное значение скорректированного балла СЕА мРНК у пациентов без злокачественности была 92,5, так что значение среза 100 использовалась в настоящем исследовании. При использовании этого значения отсечки, 45 пациентов (36,6%) были диагностированы как CEA мРНК-положительными. Средняя исправлен CEA мРНК Балл [(CEA мРНК /мРНК GAPDH) × 10 6] из 123 пациентов был 37,510.0 (диапазон, 0-3,695,652.1) копий На рисунке 1 показано распределение мРНК (CEA /мРНК GAPDH) × 10 6 в этой группе пациентов. Рисунок 1 Распределение уровня экспрессии CEA. Средство отношение (CEA мРНК /GAPDH мРНК) × 106. Учитывая отношение некоторых пациентов были равны нулю, мы добавили 0,5 в соотношении.
Отношения между CEA экспрессия мРНК и клиникопатологическими признаков
экспрессия СЕА мРНК не коррелируют с возраст, пол, N стадия, стадия TNM, гистологический подтип и состояние сыворотки CEA (таблица 1). Тем не менее, у пациентов с рецидивом после операции, имели значительно более высокий процент мРНК CEA положительный, чем без рецидива опухоли (P
= 0,001) (таблица 1). Кроме того, глубина опухоли также положительно коррелирует с экспрессией СЕА мРНК (P
= 0,001).
Взаимосвязь между рецидивом и экспрессии CEA мРНК, а также сыворотка CEA
Режим повторения включает в себя 8 местный рецидив, 9 брюшную распространение кроме печени, 8 метастазов в печени, 6 тазового метастазирования, 3 другие сайты метастазирования и 10 множественные сайты метастазирования. Там нет никакой существенной разницы между экспрессией СЕА мРНК и режим повторения (таблица 1).
Рецидив болезнь была обнаружена в 44 из 123 случаев (35,8%). Двадцать пять из этих пациентов (56,8%) были CEA мРНК-положительными. В противоположность этому, только 14 пациентов с рецидивом заболевания (31,8%) были положительными для предоперационной сыворотки CEA. Те особенности мРНК CEA и сыворотке CEA, чтобы указать, рецидивы были 74,7% и 79,9%, соответственно. (Таблица 2) .table 2 Сравнение между CEA * мРНК и сыворотке CEA в прогнозировании рецидива

CEA мРНК

сыворотка CEA

Positive

Negative

Positive

Negative

Recurrence
Yes
25
19
14
30
Нет
20
59
16
63
P

0.001
0,152
X страница 2 12,088
2,050 <бр> Чувствительность (%) 56,8

31,8
Специфичность (%) 74,7

79,7
* Карциноэмбриональный антиген
одномерных и многомерных анализов 3-летней выживаемости без признаков заболевания
5-летняя общая выживаемость составила 58,9%, а 3-летняя безрецидивная выживаемость составила 63,9%. Оба одномерные и многомерные анализы были использованы для оценки факторов, относящихся к выживаемости без признаков заболевания. Согласно однофакторного анализа, возраст, глубина опухоли, узловой метастаз, гистологический сорт, TNM стадия, CEA мРНК положительность и сыворотке CEA положительность были значимо связаны с безрецидивной выживаемости (P = 0,031
, < 0,001, 0,001, 0,022, ≪ 0,001, 0,001, 0,045 соответственно) (таблица 3). Многофакторный регрессионный анализ показал, что только гистологическая оценка и CEA мРНК положительность были независимыми факторами для выживаемости без признаков заболевания (P = 0,047
и 0,020, соответственно, таблица 4). Трехлетние безрецидивная выживаемость для СЕА мРНК-положительных пациентов были значительно ниже, чем у пациентов с отрицательным CEA мРНК (43,9% против 74,1%, соответственно, P = 0,001
, Рисунок 2) .table 3 Одномерный анализ признаков заболевания выживаемость в желудочной карциномы
Параметр

Безрецидивная выживание, P

значение а Возраст
&л; 59 против ≥59
0,031
Гендер
мужскую и женскую
0,433
CEA мРНК
(+) против (-)
0.001
Сыворотка СЕА
(+) по сравнению с (-)
0,045
Гистологическое класса
Ну /умеренно по сравнению с плохо
0,022
пТл
pTis /pT1 против pT2 /pT3 /pT4
&л; 0,001
пН
(+) по сравнению с (-)
0.001
Этап
1/2 vs. 3/4
&л; 0,001
адъювантной химиотерапии агенты
CAPOX против mFOLFOX6 vs. Таксол + DDP против Таксол + 5ФУ /CF
0,850
тестового входа ранга
Таблица 4 многовариантного анализа выживаемости без признаков заболевания в рак желудка
Факторы

Характеристики

соотношение риска

95% ДИ

P value

Unfavorable

Favorable

Age
≥59
<59
1.018
0.986-1.050
0.273
Histological grade
Poorly
Well/moderately
0.412
0.171-0.990
0.047
pT
2/3/4
Tis/1
1.673
0.100-8.690
0.947
pN
(+)
(-)
2.030
0.264-15.611
0.497
Stage
3/4
½
1.437
0.124-16.613
0.771
CEA мРНК
(+)
(-)
2,243
1.138-4.424
0,020
Сыворотка CEA
(+)
(-)
1,130 <бр> 0.582-2.194
0,717
CI, доверительный интервал; рТ, глубина инвазии опухоли
Рисунок 2. безрецидивная выживаемость больных в соответствии с выражением CEA мРНК. Трехлетняя безрецидивная выживаемость СЕА мРНК-положительных пациентов был значительно ниже, чем у СЕА мРНК-отрицательных пациентов (43,9% против 74,1% соответственно; P = 0,001
).
Обсуждение
полупроницаемую -quantitative характер традиционной технологии ПЦР сделало трудно дифференцировать базовые уровни экспрессии генов в нормальных тканях с повышенным уровнем экспрессии генов при раке, увеличивая тем самым заботу о ложноположительных результатов [17]. В нашем исследовании, ПЦР в реальном времени мРНК СЕА использовали для исследования возможности периферической крови в качестве источника для обнаружения CTC и прогнозирования рецидива рака у больных раком желудка. В режиме реального времени количественный анализ CEA мРНК у онкологических больных часто осуществляется на основе СЕА мРНК позитивности, которая определяется с использованием уровня отсечки [13]. СЕА мРНК может быть обнаружен у пациентов с доброкачественным заболеванием, а также здоровых добровольцев, так что уровни отсечки обычно определяется максимальным выражением в доброкачественных пациентов [18, 19]. Сэтояма T и др. Обнаружено, что максимальное значение мРНК СЕА у пациентов без злокачественной опухоли был 8,6, они, следовательно, установить пороговое значение, как 9,0 [20]. Шустер R и др. [21] также используется максимальное значение здорового добровольца фона в качестве порогового значения для обнаружения CEA мРНК в больных колоректальным раком. В нашем исследовании мы также использовали максимальное значение скорректированного балла CEA мРНК у больных без злокачественных новообразований в качестве значения среза. Устанавливая значение среза 100 для нормализованных уровней СЕА мРНК, можно выделить больных раком пациентов нераковых и, следовательно, более уверенно рассматривать экспрессию мРНК СЕА в качестве маркера циркулирующих опухолевых клеток.
Мы обнаружили, что 10 больных с опухолью Т1, 6 пациентов имели положительную экспрессию CEA-мРНК. Но ни одна запись рецидива не было найдено в 10 пациентов. Кажется, что нет никакой связи между экспрессией мРНК CEA и рецидива опухоли в T1. Трудно объяснить высокую положительную скорость CEA-мРНК у больных T1, но мы обнаружили, что экспрессия СЕА мРНК была низкой у пациентов 6 Т1, начиная от 4320 экземпляров до 44 600 экземпляров. Ikeguchi M [22] сообщили, что 12,5% от стадии I желудка больных раком выражена мРНК CK20 и они считали, что это было вызвано небольшим выражением CK20 в периферических белых кровяных клеток.
Мало сообщений оценивали состояние ЦОК в желудочном больных раком до начала лечения. Ikeguchi и Кайбара сообщили [23], что они не смогли найти раковые клетки в периферической крови у нелеченных больных раком желудка. Авторы предположили, что раковые клетки-видимому, не легко мигрировать в периферической крови от первичных опухолей у пациентов с необработанной рака желудка. В противоположность этому, Miyazono и др.
[24] показал, что положительная норма для CEA мРНК больных раком желудка составила 8,8% перед операцией. Наличие ЦОК до лечения и его связь с клиническим исходом, таким образом, остается спорным. В данном исследовании мы оценивали клиническую значимость ЦОК в крови перед операцией с использованием в режиме реального времени RT-PCR для детекции экспрессии мРНК CEA. Положительная скорость мРНК CEA перед любой обработкой на 36,6%. Дополнительный файл 1 показывает положительную скорость маркеров мРНК из литературы для обнаружения опухолевых клеток в реальном времени RT-PCR.
О'Салливан и др.
[25] предположил, что предоперационное обнаружение микрометастазов может отражать либо переходные пролития клеток, метастатического потенциала, или остаточной болезни. В настоящем исследовании мы обнаружили, что ЦОК были обнаружены в крови до лечения в связи с рецидивом. Несколько отчетов показали, что предоперационное обнаружение циркулирующих раковых клеток было явным маркером плохой выживаемости пациентов, так как во многих случаях с циркулирующих раковых клеток дооперационно показали либо расширенный метастазы в лимфоузлы или отдаленные метастазы, таким образом, прогноз таких пациентов был беден [26-28 ]. В настоящем исследовании мы обнаружили, что экспрессия мРНК СЕА была в значительной степени связано с рецидива заболевания. Кроме того, у пациентов с положительной мРНК СЕА была короче 3-летний исход выживаемости без признаков заболевания. Частота рецидивов была значительно выше у пациентов, положительных по мРНК CEA, чем в тех, отрицательной.
Чувствительность экспрессии CEA мРНК предсказать рецидив только 56,8%. Девятнадцать из семидесяти восьми пациентов (24,4%) с отрицательным выражением CEA мРНК имели рецидив опухоли. Сэтояма и др.
[20] показал, что 8 из 69 (11,6%) карциномы пищевода у пациентов с отрицательным экспрессии CEA мРНК имели рецидив опухоли, и 6 пациентов имели рецидив лимфоузлов. Одним из наиболее часто используется объяснение отказа обнаружения является то, что циркулирующие клетки не равномерно распределены и не непрерывно пролил в обращение [29, 30]. Кроме того, идеальный маркер (не нелегитимным выражение в крови, высокий уровень экспрессии в опухолевых клетках) до сих пор не найдено. Помимо мРНК CEA, другие стенограммы, включая цитокератином (CA) 18 [31], матрица металлопротеиназы (ММР) -7 [32], CK 20 [33], урокиназы типа активатора плазминогена рецептора (уАПР), CK 19 и CK 7 [ ,,,0],34], были опробованы в качестве потенциальных маркеров ЦОК. Тем не менее, опухолевая клетка будка должна быть относительно редким событием. Таким образом, является ли периферической крови подходящий отсек для раннего выявления микрометастазов остается спорным. Другие отделения, такие как костный мозг или брюшной полости, как известно, обеспечивают более высокий уровень обнаружения, вероятно, из-за большего числа опухолевых клеток, присутствующих [35-37].
Другим важным вопросом является ложноположительными экспрессия мРНК CEA. Двадцать пациентов (44,4%), которые имели положительную экспрессию мРНК CEA не зафиксировал рецидив в последующей деятельности. Одной из причин может быть относительно коротким период наблюдения.
С другой стороны, это может быть вполне разумным, потому что немногие клетки карциномы пролитые в кровоток удалось установить метастазирования [25]. Эти циркулирующие раковые клетки могут не придаю в отдаленные органы и не может расти. В последнее время, Méhes и др.
[38] исследовали морфологию циркулирующих раковых клеток и обнаружили, что большинство циркулирующих клеток рака молочной железы был в состоянии апоптоза. В периферической крови больных раком, было обнаружено существование опухоли клеток-лимфоцита комплекса [39]. Эти данные показывают, что макрофаги или лимфоциты могут играть важную роль в индукции циркулирующих опухолевых клеток апоптоз и иммунный противоопухолевый ответ хозяина. Эти иммунизированных макрофаги могут сенсибилизировать цитотоксических Т-лимфоцитов хозяина, и сенсибилизированные Т-лимфоциты могут атаковать остаточные микрометастатической поражения раке больных [23]. Для того, чтобы прояснить эту гипотезу, дальнейшие исследования, касающиеся корреляции между наличием циркулирующих раковых клеток и иммунного ответа хозяина необходимы.
Настоящее исследование было ретроспективный анализ, и пациенты, которые должны получать адъювантной химиотерапии не были установлены раньше времени. В целом, было рекомендовано пациентов, которые имели положительный результат лимфоузел получить адъювантной химиотерапии. До сих пор не существует стандартных критериев для адъювантной химиотерапии рака желудка в Китае. Наше исследование показало, что CEA мРНК число копий в периферической крови при начальной диагностике была в значительной степени связано с рецидивом заболевания у пациентов желудка аденокарциномы. В точки зрения рецидива, поэтому мы предположить, что пациенты, которые имеют положительную экспрессию CEA мРНК дооперационно получают адъювантной химиотерапии после радикальной резекции.
Выводы
В данном исследовании чувствительность мРНК СЕА была выше, чем в сыворотке CEA. Кроме того, в соответствии с многофакторного регрессионного анализа, CEA мРНК положительность был независимым фактором рецидива. Настоящее исследование подтвердило, что подобный метод перспективен для раннего выявления ЦОК у больных с желудочной карциномой до лечения; пациентов с положительной мРНК СЕА могут иметь более высокий риск рецидива даже после лечебной резекции. Тем не менее, крупное рандомизированное проспективное исследование является оправданным, чтобы определить роль CEA обнаружения мРНК в крови
Сокращения
RT-PCR:.
Ревертазам-полимеразной цепной реакции


ЦОК:
циркулирующие опухолевые клетки


CEA:
Карциноэмбриональный Антиген


CA19-9: <бр> антигена 19-9


TNM:
Опухоль-Node-метастазы


AJCC:
американского Объединенного комитета по вопросам рака


GAPDH:
глицеральдегид 3-фосфатдегидрогеназы


ММР-7:
матричных металлопротеиназ-7
<бр>
уАПР:.
урокиназы типа активатора плазминогена рецептор


декларациях
Благодарности
Эти рабочие финансировалось Национальным научным фондом природного гранта Китай 30672408, Гуанчжоу Бюро науки и техники предоставляют 2006Z3-E0041 и Сунь Ят-сеном университет +985 Программа Инициирование фонда (Китай). Мы с благодарностью поблагодарить сотрудников в Департаменте медицинской онкологии и хирургии Г.И. онкологии в Сунь Ят-сеном университет онкологического центра по их предложению и помощи
Электронный дополнительный материал
12967_2009_529_MOESM1_ESM.DOC Дополнительный файл 1:. Данные из литературы обнаружение опухолевых клеток в реальном времени RT-PCR маркеров мРНК. Он показывает положительную скорость маркеров мРНК из литературы для обнаружения опухолевых клеток в реальном времени RT-PCR. (DOC 58 KB) Авторский оригинал представленные файлы для изображений изображения Ниже приведены ссылки на авторов оригинала, представленных файлов для изображений.

• экспрессия ДНК polymeraseη белка предсказывает реакцию на лечение и выживаемость пациентов с метастатическим аде…
• Эффективность ультразвукового исследования при проверке размещения назогастральный трубки у пациентов с ни…