NF-kappaB-beroende MicroRNA-425 uppreglering främjar magsäckscancer celltillväxt genom att rikta PTEN på IL-1β induktion

NF-kappaB-beroende MicroRNA-425 uppreglering främjar magsäckscancer celltillväxt genom att rikta PTEN på IL-1β induktion Bild Sammanfattning
Uttryck av den proinflammatoriska cytokinen IL-1β förknippas med olika sjukdomar, bland annat cancer. Ändring av mikroRNA har observerats i cancerceller som utsätts för proinflammatoriska cytokiner, men deras funktion i inflammation stressen förblir gäckande. Här visar vi att IL-1β inducerar uppreglering av MIR-425, som reglerar fosfatas och tensin homolog uttryck negativt genom att rikta sin 3 'UTR. En ökning av MIR-425 är beroende av IL-1β-inducerad NF-kappaB aktivering, vilket förbättrar MIR-425 gentranskription på IL-1β induktion. Följaktligen förtryck av fosfatas och tensin homolog av MIR-425 främjar magcancer celltillväxt, som krävs för att skydda celler från cisplatin-inducerad apoptos. Sammantaget våra data stöder en avgörande roll för NF-kappaB-beroende uppreglering av MIR-425, som representerar en ny väg för förtrycket av fosfatas och tensin homolog aktivering och främjande av cellöverlevnad på IL-1β induktion.
nyckelord
IL-1β NF-kappaB miR-425 PTEN Magcancer bakgrund
Gastric adenocarcinom är den fjärde och femte vanligaste cancerformen bland män respektive kvinnor, över hela världen och är starkt kopplad till kronisk inflammation [1]. Det är nu väl accepterat att infektion med Helicobacter pylori
(H. pylori
) spelar en viktig roll för att utlösa kronisk inflammation som leder till malignitet [2]. Kronisk inflammation i magen initierar histopatologiska utvecklingen av kronisk gastrit för gastric atrofi, intestinal metaplasi och slutligen magcancer [3]. Medan H. pylori
infektion är extremt utbredd, endast en liten minoritet (ca 1%) av infekterade individer kommer att utveckla magcancer efter många år. Den rörliga svar på denna gemensamma patogen tycks styras av en genetisk predisposition för höga uttrycksnivåer av proinflammatoriska cytokiner [4].
Nukleär faktor kappa B (NF-kappaB) vägen har länge ansetts vara en viktig proinflammatorisk signalväg, till stor del bygger på aktivering av NF-kappaB av proinflammatoriska cytokiner och den roll av NF-kappaB i transkriptionsaktivering av känsliga gener inklusive cytokiner och kemokiner [5]. Den "canonical" reaktionsvägen för NF-kappaB aktivering utlöses av proinflammatoriska cytokiner såsom IL-1β och vanligtvis leder till aktivering av förhållan eller CreL-innehållande komplexen [6]. NF-kappaB existerar i cytoplasman i en inaktiv form i samband med regulatoriska proteiner benämnda inhibitorer av kB (IkB), av vilka den viktigaste kan vara iKBa, IκBβ och IκBε. IKBa förknippas med övergående NF-kappaB aktivering, medan IκBβ är involverat i ihållande aktivering [7]. Emellertid är kronisk inflammation en komplex fysiologisk process, och den roll av NF-kappaB i det inflammatoriska svaret har ännu inte utforskats till fullo.
Förutom att påverka protein-kodande genexpression, inflammation stressen ändrar också expressionsnivån av mikroRNA (miRNA) [8]. MicroRNAs är en klass av endogena, små, icke-kodande RNA som negativt reglerar genexpression vid den posttranskriptionella nivån huvudsakligen via bindning till den 3'-otranslaterade regionen av ett mål-mRNA, och de har viktiga reglerande funktioner i kontrollen av olika fysiologiska och patologiska processer [9, 10]. Dessa RNA har visat sig vara inblandade i regleringen av många cellulära processer, inklusive proliferation, differentiering och apoptos [11-13]. Men reglerar huruvida kronisk inflammation miRNA uttryck genom att modulera gentranskription eller förändra posttranskriptions mognad har inte fastställts.
I detta arbete har vi funnit att MIR-425 induktion vid IL-1β-inducerad inflammation var beroende av aktiveringen av NF-kappaB, som förbättrade mIR-425-gentranskription. Dessutom uppreglerad MIR-425 direkt riktade fosfatas och tensin homolog (PTEN) och negativt regleras dess uttryck, som främjade cellöverlevnad på IL-1β induktion.
Experimentella förfaranden
etik uttalande
Alla prover erhölls från patienter som genomgick kirurgi vid Fudan University i Shanghai Cancer Center. Protokollet godkändes av den kliniska forskningsetiska kommittén för Fudan University, och forskning genomfördes i enlighet med bestämmelserna i Helsingforsdeklarationen av 1975. Intilliggande normala vävnader skars bort från magcancer skada makroskopiskt och deras histologisk diagnos bekräftades mikroskopiskt. Skriftligt informerat samtycke erhölls från alla inblandade i studien deltagarna.
Cellodling och reagenser
humana embryonala njurcellinjen HEK293 (ATCC CRL-1573 ™), human bröstcancercellinje MDA-MB361 (ATCC ® HTB-27 ™), den humana gastrisk adenokarcinomcellinje AGS (ATCC CRL-1739 ™), SNU-1 (ATCC CRL-5971 ™), SNU-5 (ATCC CRL-5973 ™), SNU-16 (ATCC CRL- 5974 ™), Hs746T (ATCC HTB-135 ™), NCI-N87 (ATCC CRL-5822 ™), och KATO III (ATCC®HTB-103 ™) bibehölls i DMEM innehållande 10% fetalt bovint serum. Alla cellinjer bibehölls i media innehållande penicillin (100 lU /ml) och streptomycin (100 mg /ml) vid 37 ° C med 5% CO 2. Mirna härmar och anti-miRNA köptes från Ambion (Austin, TX, USA). IKK-hämmare TPCA-1 (kat. Nr S2824), p38 MAPK-inhibitor BIX02188 (kat. Nr S1574) och JNK inhibitor SP600125 (kat. Nr S1460) köptes från Selleckchem (Houston, TX, USA). Rekombinanta humana IL-1β köptes från Sigma-Aldrich (kat. Nr H6291, Shanghai, Kina).
RNA-extraktion och realtids-PCR
Totalt RNA extraherades från celler med hjälp av TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien ). För mikroRNA-analys, var poly (A) svansar läggas till den totala RNA med användning av poly (A) polymeras (Ambion, Carlsbad, CA) före omvänd transkription. Den MiRcute miRNA qPCR detektionskit (TIANGEN, Beijing, Kina) användes för att kvantifiera uttrycket nivåer av mogen miR-425 enligt den medföljande protokoll, och GAPDH användes som en intern kontroll. Realtids-PCR utfördes under följande betingelser: 95 ° C 10 m, 1 cykel; 95 ° C 10 s, 55 ° C 34 s, 40 cykler. Idéer för alla resultat som erhållits genom realtids-PCR metoder använde vi Delta Delta CT metod för att beräkna faldig förändring i genuttryck mellan olika grupper. Mängden mål (PTEN /MIR-425), normaliserad till den endogena housekeepinggen GAPDH och i förhållande till ett referensprov, ges av följande ekvation:. Mängd target = 2 - △△ CT
Immunoblotting
Proteiner separerades på en 10% SDS-PAGE-gel och överfördes därefter till ett PVDF-membran. Efter blockering med 5% fettfri mjölk, inkuberades membranet med en mus monoklonal anti-PTEN-antikropp (1: 500, Santa Cruz, sc-7974) och en NF-kappaB p65 Phospho (pS536) (RELA) antikropp (1: 10000 ., EPITOMICS, Cat #: 2220-1). IRdye-märkta sekundära antikroppar användes för kvantifiering av immunblotting-signalen, och signalerna analyserades med användning av en Odyssey scanner (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA).
Luciferasanalys
HEK293-celler och AGS-celler var transfekterade med MIR-425 och pGL3 luciferas reporter konstruktioner härbärge Mir-425 målsekvensen. Efter 24 timmar tillsattes verksamhet eldflugeluciferas och Renilla luciferas i cellysat mätt med Dual-Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI, USA). För luciferas transkriptionsreporteranalysen, MIR-425-gen-promotorsekvenser (WT eller webbplats text utgår) klonades in i promotorregionen av pGL3-Basic vektor, och luciferasaktiviteten mättes såsom beskrivits ovan.
Kromatin immunoprecipitation (chip)
i korthet behandlade celler var tvärbunden med 1% formaldehyd, skjuvas till en genomsnittlig storlek av 400 bp, och därefter immunutfälldes med antikroppar mot NF-kappaB (Santa Cruz, sc-166588). Chipet-PCR-primers utformades för att förstärka promotorregioner som innehåller förmodade NF-kappaB bindningsställen inom MIR-425 som bilden visar. En positiv kontrollantikropp (RNA-polymeras II) och en negativ kontroll icke-immun IgG användes för att demonstrera effektiviteten hos de reagenser (Epigentek Group Inc, P-2025-48). Immunfällda DNA rengörs sedan, släpptes, och eluerades. Eluerat DNA kan användas för tillämpningar efter Chip-PCR. Faldig anrikning (FE) beräknades genom användning av ett förhållande av amplifieringseffektivitet av ChIP provet över den för icke-immunt IgG. Amplifieringseffektivitet av polymeras-RNA II användes som en positiv kontroll. FE% = 2 (IgG CT - Prov CT). × 100%
cellproliferationsanalys Review, en cellproliferationsanalys utfördes med användning av Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) i enlighet med tillverkarens anvisningar. Före tillsatsen av CCK-8, tvättades cellerna med varmt odlingsmedier genom att snurra plattan vid 500 rpm under 3 m och sedan kasta supernatanten.
Cell apoptos assay
Cancercellerna skördades och återsuspenderades i 500 il av en bindningsbuffert. Cellsuspensionen (100 ^ il) inkuberades med 5 ^ il annexin-V och propidiumjodid vid rumstemperatur under 20 minuter. De färgade cellerna analyserades med fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) med användning av BD LSR II flödescytometri.
Cellcykelanalys
För flödescytometrianalys, trypsinerades cellerna och fixerades i 70% etanol över natten. Cellerna inkuberades sedan i 0,5 ml propidiumjodid-lösning innehållande 25 ug ml -1 RNas i 15 minuter vid 37 ° C och mättes.
Mus experiment sälja The NCI-N87-celler (3 x 10 6) injicerades in i de högra flankerna av atymiska nu /nu-möss. En vecka efter injektionerna möss med jämförbar storlek tumörer behandlades under 4 veckor med anti-MIR-425. Den anti-MIR-425 (2 nmol) injicerades direkt i tumörerna två gånger i veckan i 4 veckor.
Statistisk analys
Resultaten presenteras som medelvärden ± SEM, och data analyserades med Students t-test. Ett värde av p Hotel < 0,05 ansågs statistiskt signifikant.
Resultat
IL-1β behandling inducerar miR-425 uttryck
att karakterisera miRNAs ansvarar för IL-1β induktion, profilerade vi miRNA uttryck i PBS-behandlade AGS-celler och IL-1β inducerade AGS celler med Exiqon miRCURY ™ LNA Array System (v.14.0). Mirna nivåerna skilde kraftigt mellan PBS-behandlade gruppen och IL-1β-inducerad grupp, som visas i värmen kartan som visas i figur 1A. Bland de 1,891 infångningssonder, var 46 miRNAs differentiellt uttryckta i IL-1-inducerad AGS celler jämfört med parade PBS-behandlade AGS-celler; av dessa miRNA, 29 ökades och 17 minskade under de IL-1 p-inducerad AGS-celler (tabell 1), vilket indikerar att en specifik miRNA mönster är associerad med IL-1β induktion. Figur 1 dysreglering av miRNA i humana AGS-celler som behandlats med IL-1β. (A) Human AGS-celler behandlades med IL-1β (10 ng /ml) [14], och 24 timmar senare var miRNA uttrycksprofilen analyseras med microarray-teknik. Värme karta diagram genereras av oövervakade klustring analys med 46 avsevärt oreglerad miRNA. Rött indikerar uppreglering; grön indikerar nedreglering. (B) Ökade nivåer av MIR-425 i 36 tumörprover i förhållande till deras nivåer i matchade intilliggande normala vävnader mätt genom realtids-PCR. Normal: intilliggande normala vävnader. (C) Expression nivå av MIR-425 undersöktes genom realtids-PCR i flera gastric cancercellinjer och sex normala magslemhinnan celler.
Tabell 1 Betydande dysreglering av miRNA
överuttryckt i IL-1 inducerad AGS celler
miRNA
Vik förändring
p-värde
HSA-mIR-425
12,36
0,00
hsa-miR-584
11.03
0.01
hsa-miR-31
8.12
0.00
hsa-miR-155
6.22
0.00
hsa-let-7i
5.55
0.00
hsa-miR-21
5.11
0.00
hsa-miR-335
4.89
0.01
hsa-miR-191
4.73
0.03
hsa-miR-519d
4.37
0.02
hsa-miR-520d-5p
3,95
0.00
hsa-miR-331
3.67
0.01
hsa-miR-142
3.45
0.01
hsa-miR-518a-5p
3.28
0.01
hsa-miRPlus-F1231
3.11
0.01
hsa-miR-2113
2.94
0.02
hsa-miR-196a*
2.88
0.02
hsa-miR-1304
2.78
0.02
hsa-miR-185
2.65
0.01
hsa-let-7a
2.61
0.00
hsa-miR-130
2.52
0.02
hsa-miR-1280
2.50
0.01
hsa-miR-222
2.47
0.01
hsa-let-7c
2.43
0.00
hsa-miR-602
2.31
0.00
hsa-miR-548e
2.31
0.03
hsa-miR-32
2.27
0.04
hsa-miR-181a
2.24
0.02
hsa-miR-7
2.13
0.00
hsa-miR-21*
2.06
0.00
Underexpressed i IL-1 inducerad AGS celler
miRNA
Fold förändring
p-värde
hsa-miR-143
0.06
0.02
hsa-miR-200
0.08
0.01
hsa-miR-451
0.13
0.01
hsa-miR-144
0.17
0.00
hsa-miR-363
0.20
0.01
hsa-miR-637
0.25
0.03
hsa-miR-153
0.39
0.01
hsa-miR-139
0.39
0.00
hsa-miR-617
0.42
0.01
hsa-miR-1915
0.43
0.00
hsa-miRPlus-F1153
0.45
0.00
hsa-miR-381
0.46
0.00
hsa-miR-145
0.47
0.02
hsa-miR-659
0.47
0.03
hsa-miR-125b
0.48
0.00
hsa-miR-183*
0.49
0.00
hsa-miR-638
0.49
0.01
*: När två mogna miRNA kommer från motsatta armar av samma pre-miRNA, en asterisk efter namnet anger en miRNA uttrycks vid låga nivåer i förhållande till miRNA i motsatt arm av en hårnål
Bland dessa miRNA, MIR. 425 var den mest uppregleras på IL-1β induktion. Med hjälp av realtids-PCR-analys, analyserade vi miR-425 uttryck i 36 parade prover (tumör och angränsande normala vävnader från samma patient). Vi hittade en betydligt högre nivå av MIR-425 uttryck i tumörprover i förhållande till nivåerna i angränsande normala vävnader (s Hotel < 0,0001) (Figur 1B). Vi undersökte uttrycksnivån för MIR-425 i en uppsättning av magcancer cellinjer och sex normala magslemhinnan celler. Som visas i figur 1C, vi plockade upp AGS-celler med nedregleras miR-425 och NCI-N87-celler med uppreglerat miR-425 för vidare studier. Även om aktivering av MIR-425 har rapporterats ha en grundläggande inverkan på cancer initiering och progression av cancerceller genom att minska uttrycket av ett omfattande nätverk av gener [15], den roll som MIR-425 i human cancer har inte klarlagts . . Vi valde därför MIR-425 för vidare utredning
Expression av PTEN negativt regleras av MIR-425
att identifiera målen för MIR-425, använde vi en vanligt förekommande algoritm, miRecords (http: //mirecords . biolead. org /), som är en integrerad resurs för miRNA-mål interaktioner djur. För att öka noggrannheten hos denna förutsägelse, gener som förutsades av åtminstone fem av elva databaser (Diana, microinspector, Miranda, mirtarget2, mitarget, nbmirtar, pictar, pitabröd, rna22, rnahybrid och targetscan) valdes som förmodade mål. Bland dessa förmodade mål för MIR-425, visade gen ontologi analys att expressionsnivåer av 9 kandidatgener förändrades; sålunda skulle denna förändring bidrar till den maligna fenotypen. Använda 3 'UTR luciferas reporter analyser, fann vi att överuttryck av MIR-425 inhiberade signifikant luciferasaktivitet i HEK293-celler och AGS-celler som uttrycker vildtypen PTEN 3' UTR reporter (Figur 2A). Vi bekräftade att PTEN är en förmodad direkt mål för MIR-425. För att illustrera specificiteten av MIR-425, visade vi att anti-MIR-425 avskaffas specifikt hämningen av luciferasaktiviteten framkallad av MIR-425 i HEK293-celler och NCI-N87-celler (Figur 2B). Mutationer i miRNA bindningsställen (Figur 2C) framförde konstruktionerna okänsliga för MIR-425 induktion (figur 2D), vilket ytterligare bekräftar att PTEN-genen är ett direkt mål för MIR-425. Figur 2 MIR-425 riktar sig direkt PTEN. (A) Reporter assay i HEK293-celler och AGS-celler transfekterade med MIR-425 och konstruktioner som bär luciferas-cDNA fuseras till 3'-UTR av förutsagda kandidatmål (medelvärde ± SEM). (B) Effekter av anti-MIR-425 på luciferasaktiviteten av luciferas konstruktioner fuserade med de 3 'UTR av PTEN i HEK293-celler och NCI-N87-celler (medelvärde ± SEM). (C, D) Reporter assay i HEK293-celler och AGS-celler transfekterade med luciferas-konstrukt som bär PTEN 3 'UTR med mutationer i de MIR-425-bindningsställen (medelvärde ± SEM). (E) HEK293 celler och AGS-celler transfekterades med en luciferas-konstrukt som bär vildtyps PTEN 3 'UTR (LUC-WT) eller en konstruktion som bär en muterad PTEN 3' UTR (LUC-Mut). Efter 24 h, behandlades cellerna med IL-1β, och luciferasaktiviteten kvantifierades 24 timmarna efter behandlingen. (F) Western blot och RT-PCR visar PTEN proteinnivåer och mRNA-nivåer i AGS celler efter 48 h miR-425 transfektion. (G) AGS-celler transfekterades med anti-MIR-425, och 24 timmar senare, cellerna lämnades antingen obehandlade eller behandlade med IL-1β och därefter skördades 24 h efter behandling. Hela cellysat immun med PTEN antikroppar. (H) NCI-N87-celler transfekterades med anti-MIR-425 och skördades 24 h efter behandling. Hela cellysat immun med PTEN antikroppar. (I) AGS-celler transfekterades med en plasmid som bär endast den öppna läsramen sekvens av PTEN (PTEN-CDS). Efter 24 h, behandlades cellerna med IL-1β eller miR-425. Hela cellysat underkastades immunoblotting efter 24 h behandling. (* P < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001)
Vidare mutation av MIR-425 målsekvensen också signifikant försvagade IL-1β-inducerad förtryck av PTEN 3 'UTR. luciferas reporteraktivitet i HEK293-celler och AGS-celler (Figur 2E). Överuttryck av MIR-425 var tillräckligt för att nedreglera PTEN uttryck på både protein och mRNA-nivåer i AGS-celler (Figur 2F). Följaktligen var IL-1β-inducerad PTEN repression räddas genom att uttrycka anti-MIR-425 i AGS-celler (figur 2G). Anti-MIR-425 kunde uppreglera PTEN uttryck i NCI-N87 celler utan IL-1β stimulering (Figur 2H).
Våra data visade också att den 3 'UTR krävs för MIR-425-medierad PTEN nedreglering eftersom uttryck av en PTEN-kodande regionen konstruktion (PTEN-CDS) var okänslig för mIR-425 uttryck och IL-1β induktion i AGS-celler (Figur 2i). Sammantaget indikerar dessa resultat att MIR-425 spelar en avgörande roll i att undertrycka PTEN uttryck genom att rikta sin 3 'UTR på IL-1β induktion.
IL-1β-inducerad NF-kappaB aktivering krävs för MIR-425 induktion
för att bestämma inblandade i mIR-425 trans på IL-1β induktionsmekanism, undersökte vi effekterna av olika kinashämmare på mir-425 induktion av IL-1β-behandlade AGS-celler. IL-1β-inducerad miR-425 uppreglering hämmades signifikant av IKK hämmare TPCA-1 men inte av p38 MAPK-inhibitor BIX02188 eller JNK inhibitor SP600125 (figur 3A). Tidigare studier har visat att IKK är en väsentlig kinas som krävs för NF-kappaB-signalering; Därför detta resultat indikerade den avgörande betydelsen av NF-kappaB signalering i regleringen av MIR-425 transkription på IL-1β induktion. Figur 3 IKK aktivering krävs för induktionen av MIR-425 som svar på IL-1β induktion. (A) AGS-celler behandlades med IL-1β i närvaro av IKK-hämmare TPCA-1, inhibitor BIX02188 p38 MAPK och JNK inhibitor SP600125 den. Mogna miR-425 uttryck vid 12 timmar efter behandling kvantifierades genom realtids-PCR. Vecket förändring av relativ miR-425 uttryck (MIR-425 /U6) normaliserades till den som observerades i PBS-behandlade celler. (B) Uttrycket av primära miR-425 (pri-MIR-425) analyserades genom realtids-PCR som i A. (C) Uttrycksnivåerna av NF-kappaB protein och pri-MIR-425 analyserades med real- tids-PCR i AGS celler behandlade med siRNA för NF-kappaB. (D) AGS-celler behandlades med kemi-hämmare eller siRNA för NF-kappaB. Cellysat erhölls 24 h efter IL-1β behandling och immunoblottades med PTEN antikroppar. (E) Western blot-analys av fosforylerad NF-kappaB p65 (serin 536). (F) Uttrycksnivåerna av NF-kappaB protein och pri-MIR-425 analyserades genom realtids-PCR i NCI-N87-celler som behandlats med siRNA för NF-kappaB. (* P < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001).
Konsekvent, induktion av pri-miR-425 upon IL-1β behandling var anmärkningsvärt inhiberas i närvaro av den IKK-hämmare eller siRNA för NF-kappaB (figur 3B och C). Vi observerade också att IL-1β-inducerad PTEN repression försvagades i närvaro av IKK-hämmare eller siRNA för NF-kappaB (Figur 3D). För att bestämma huruvida NF-kappaB aktivitet var närvarande i AGS-celler som behandlats med IL-1β, använde vi en western blöt för att bestämma nivån av fosforylerat NF-kappaB p65 (serin 536). Nivån av fosforylerad NF-kappaB p65 (serin 536) var hög i AGS-celler som behandlats med IL-1p (10 ng /ml; 24 timmar) (Figur 3E). Dessutom, tysta NF-kappaB hämmade miR-425 uttryck i NCI-N87 celler utan IL-1β behandling (Figur 3F). Dessa resultat tyder på att IKK-beroende NF-kappaB aktivering på IL-1β behandling krävs för PTEN nedreglering, troligen via sin förbättring av MIR-425 transkription.
Att bestämma huruvida NF-kappaB reglerar direkt miR-425 transkription, vi analyserade uppströms sekvenser av mIR-425 med hjälp av WeightMatrix biblioteket (matrixTFP60.lib) och identifierade tre potentiella NF-kappaB bindningsställen i promotorregionen av mIR-425 (cut-off: matrix likhet = 0,9 och kärn likhet = 0,95) ( Figur 4A). Vi utförde kromatin immunoprecipitation (chip) analyser med AGS cancerceller med användning av monoklonala anti-NF-kappaB antikroppar. Som visas i figur 4B, endast primer-B Mir-425 producerade starka PCR-produkter, som föreslog att NF-kappaB protein bildat komplex med bindningsstället B i Mir-425 promotor. Resultaten av luciferas reporter analyser antydde att potentialen bindningsstället B i MIR-425-promotorn krävs för transaktivering av den nedströms belägna genen upon IL-1β-induktion (Figur 4A och C). Figur 4 NF-kappaB bindningsställen i Mir-425 promotor. (A) Egenskaper hos MIR-425 5 'flankerande DNA. Humana promotorregioner av MIR-425 innehåller tre förmodade bindningsställen för NF-kappaB. (B) marker analyser med anti-NF-kappaB antikroppar visade bindning av NF-kappaB till promotorn Mir-425 i AGS celler. De relativa occupancies av NF-kappaB anges som lodräta staplar. De stapeldiagram visar genomsnitten av tre oberoende CHIP experiment. (C) Promotorn Mir-425 aktiverades av NF-kappaB. AGS-celler behandlades med NF-kappaB och transfekterades med de angivna LUC vektorer.
Induktion av MIR-425 befrämjar cellöverlevnad på IL-1β induktion
Det visade sig att PTEN är bland de mest frekvent inaktiverade tumörsuppressorgener. Överuttryck av PTEN i olika däggdjursvävnadsodlingsceller påverkar olika processer, inklusive celltillväxt, celldöd och cellmigration [16]. Vi fann också att inhibera PTEN minskade aktiveringen av kaspas-3 i celler som behandlats med IL-1β (figur 5A). Det är troligt att miR-425-induktion kan hämma apoptos via nedreglering av PTEN i IL-1-behandlade celler. Faktum är att överuttryck av MIR-425 hämmade kaspas-3-aktivering i cisplatinbehandlade AGS-celler (Figur 5B). Dessutom i cisplatin-behandlade AGS-celler, samtransfektion av en konstruktion som innehåller endast PTEN-kodande regionen (PTEN-CDS), som är okänslig för MIR-425, förbi den antiapoptotiska effekten av MIR-425 överuttryck (figur 5C). Följaktligen transfektion av anti-MIR-425 i AGS-celler ökade signifikant kaspas-3-aktivering och apoptos som svar på IL-1β-behandling (figur 5D). Dessutom transfektion av anti-MIR-425 i NCI-N87 celler förbättras avsevärt kaspas-3-aktivering och apoptos utan IL-1β stimulering (Figur 5E). Figur 5 miR-425 hämmar cell apoptos genom att undertrycka PTEN. (EN). AGS-celler behandlades med kontroll (PBS) eller IL-1β. Efter 48 timmar tillsattes hela cellysat immunblott. (B). AGS-celler transfekterades transient med negativ kontroll (MIR-NC) eller miR-425 enbart. Efter 24 h, behandlades cellerna med cisplatin och skördades 24 h efter behandling. Hela cellysat immun. (C). AGS-celler transfekterades med MIR-NC, MIR-425, och PTEN-CDS som anges. Efter 24 h, behandlades cellerna med cisplatin och skördades 24 h efter behandling. Cellen apoptos Hastigheten bestämdes med användning av flödescytometri-metoden. (D). AGS-celler transfekterades med MIR-NC eller anti-MIR-425. Efter 48 h, behandlades cellerna med IL-1β och skördades 24 h efter behandling. Totala cellysat immunblottades med de angivna antikropparna, och cellapoptos hastigheten bestämdes med användning av flödescytometri-metoden. (E) NCI-N87-celler transfekterades med miR-NC eller anti-MIR-425. Totala cellysat immunblottades med de angivna antikropparna, och cellapoptos hastigheten bestämdes med användning av flödescytometri-metoden.
I överensstämmelse med dess roll vid inhibering av kaspasaktivering, uppreglering av MIR-425 förbättras avsevärt AGS-cellproliferation, medan den pro- överlevnadseffekt blockerades fullständigt genom samtransfektion med exogent PTEN (PTEN-CDS) (figur 6A). Anti-MIR-425 minskade andelen prolifererande celler för NCI-N87-celler (Figur 6B). Vi fann också att hämma PTEN hade en skyddande effekt liknande den som observerades i celler som överuttrycker miR-425 (figur 6C), vilket tyder på att PTEN repression kan spela en viktig roll i MIR-425-beroende skydd i celler som behandlats med IL-1β. Figur 6 miR-425 befrämjar celltillväxt genom att undertrycka PTEN. (A) AGS-celler behandlades med PBS, IL-1β, miR-NC, miR-425, och PTEN-CDS såsom anges. Efter 72 h tillsattes cellproliferation bestämdes med användning av edu märkningskit. (B) NCI-N87-celler transfekterades med miR-NC eller anti-MIR-425. Efter 72 timmar avlägsnades på cellproliferationsgrad bestämdes med användning av edu märkningskit. (C) AGS-celler behandlades med siRNA-PTEN eller miR-425. Efter 72 h tillsattes cellproliferation bestämdes med användning av edu märkningskit. (D) Fotografier av PTEN proteinuttryck i tumörvävnad (övre paneler) och tumörer (lägre paneler). (E) Grafen visar vikten av de 3 tumörer efter 4 veckor (n = 3). (F) En betydande omvänd korrelation observeras mellan MIR-425 och PTEN expressionsnivåer i magcancer vävnader (n = 52). (G) De uttrycksnivåer av PTEN bestäms i sex normala magslemhinnan celler och magcancer-cellinjer med hjälp av realtids-PCR. (H) En modell som visar de förmodade rollerna av IL-1β och MIR-425 i styrningen av PTEN vägen i humana gastriska cancerceller.
Vi undersökte effekten av MIR-425 på tumörbildning in vivo. Tumörerna behandlades med anti-MIR-425 visade ökade nivåer av PTEN-proteinet (figur 6D). Även anti-MIR-425 reducerade tumörvikten av mössen jämfört med miR-NC-behandlade gruppen (figur 6E). Användning av icke-parametriska tester, fann vi en signifikant omvänd korrelation mellan PTEN-mRNA och MIR-425 uttryck i magcancer prover (Figur 6F). De uttrycksnivåer av PTEN bestämdes också i sex normala magslemhinnan celler och magcancer-cellinjer med hjälp av realtids-PCR. Såsom visas, cellerna med "nedreglerade" miR-425 har högre mängder av PTEN jämfört med cellinjer med "uppreglerad" miR-425 nivåer (Figur 6G). Sammanfattningsvis har våra resultat visat att MIR-425 spelar en avgörande roll genom att rikta PTEN i gastric cancer.
Diskussion
interleukin-1 (IL-1) är en stor pro-inflammatoriska cytokiner som produceras av maligna eller microenvironmental celler [17]. IL-1 fungerar också som en pleiotropisk cytokin inblandad i tumörgenes och tumörinvasion; Därför är det en möjlig kandidat för en modulerande cytokin som kan rubba balansen mellan inflammation och immunitet mot framkallande av antitumörsvar [18]. IL-1α och IL-1β är de stora agonister av IL-1. I deras utsöndrade former, IL-1 a och IL-1β binder till samma receptorer och inducerar samma biologiska funktioner [19]. Emellertid IL-1α och IL-1β skiljer sig i sin uppdelning inom cellen eller mikromiljön [20]. IL-1β är endast aktiv i sin utsöndrade formen och förmedlar inflammation, som främjar cancer, tumörinvasion och immunosuppression [21]. Några nya anti-IL-1 medel har använts i kliniska prövningar på patienter som uppvisar olika sjukdomar med inflammatoriska manifestationer [22]. En bättre förståelse av den integrerande roll IL-1β signalvägar i den maligna processen gör det möjligt att tillämpa nya IL-1β module närmar hos cancerpatienter.
PTEN upptäcktes som en viktig tumörsuppressor som ofta är muterad eller förloras i olika typer av cancer [23]. Flera bevislinjer har markerat PTEN som en lipid fosfatas som hydrolyserar 3 'fosfat i fosfoinositider [24]. PTEN kan också reglera aktiviteten hos serin /treonin kinas AKT /PKB och kan därmed påverka cellöverlevnad signalering [25]. UV-exponering kan utlösa PTEN interaktion med vildtyp melanokortin-1-receptorvarianter, som skyddar PTEN från WWP2-medierad nedbrytning, vilket leder till AKT inaktivering i melanom [26]. Det finns flera mekanismer för reglering av PTEN, inklusive transkription, mRNA-stabilitet, mikroRNA inriktning, översättning och proteinstabilitet. PTEN är transkription tystas av promotor metylering i magcancer [27]. PTEN kan också vara post-translationellt reglerade av acetylering, ubiquitylation, oxidation, fosforylering, och subcellulära lokalisering [28]. Trots omfattande karakterisering av PTEN mutationer i humana cancrar och en relativt god förståelse för de molekylära roller PTEN i kontrollen av cellulära processer, är lite känt om sätt PTEN reglering.
PTEN kan hämmas i cancerceller vid induktion av proinflammatorisk cytokin IL-1β [29]. Stimulering med IL-1β aktiverar NF-kappaB genom fosforylering och nedbrytning av IkB. Denna aktivering kan NF-kappaB att translokeras in i kärnan och transkription aktivera målgener [30]. NF-kappaB är ett heterodimert transkriptionsaktivator bestående av den DNA-bindande underenheten p50 och transaktiveringsunderenheten p65 [31]. Höga nivåer av endogen NF-kappaB minskade uttrycket av PTEN, och PTEN uttryck kunde räddas genom specifik hämning av NF-kappaB vägen [32]. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet.
Författarnas ursprungliga inlämnade handlingarna Images of Nedan finns länkar till författarnas ursprungliga inlämnade handlingarna bilder . Alla författare läst och godkänt den slutliga manuskriptet.

• Inverkan av IL17A polymorfismer på avvikande metylering av DAPK och CDH1 i godartade magslemhinnan
• Ovanliga trichobezoar i magen och tarmen: ett fall report