NF-kappaB závislé microRNA-425 up-regulácia podporuje žalúdočné rast nádorových buniek, a to zameraním Ptení na IL-1 indukcie

NF-kappaB závislé microRNA-425 up-regulácia podporuje rast buniek karcinómu žalúdka zacielením Ptení na IL-1 indukcie
abstraktné
nadmerná expresia prozápalového cytokínu IL-1β je spojená s rôznymi chorobami, vrátane rakoviny. Zmena mikroRNA bola pozorovaná v rakovinových bunkách vystavených prozápalových cytokínov, ale ich funkcie v zápalovom namáhaní zostáva nejasná. Tu ukazujeme, že IL-1β indukuje upregulaci MIR-425, čo sa negatívne reguluje fosfatázy a tensinu homológnej expresiu zacielením jeho 3 'UTR. Zvýšenie MIR-425 je závislá na IL-1β-indukovanú aktiváciu NF-kappa B, čo zvyšuje MIR-425 génovú transkripciu na IL-1 indukcie. V dôsledku toho, represie fosfatázy a tensinu homológov o MIR-425 podporuje proliferáciu buniek karcinómu žalúdka, ktorá je nutná na ochranu bunky pred cisplatinou indukovanej apoptózy. Celkovo vzaté, naše dáta podporujú kritickú úlohu pre NF-kappaB závislé up-reguláciu MIR-425, čo predstavuje novú cestu pre represiu fosfatázy a tensinu homologického aktiváciu a podpore prežitia buniek po indukcii IL-1.
Kľúčové
IL-1β NF-kappaB MIR-425 Ptení karcinóm žalúdka pozadí
adenokarcinómom žalúdka je štvrtou a piatou najčastejšou rakovinou u mužov a žien, respektíve po celom svete a je silne spojená s chronickým zápalom [1]. V súčasnej dobe je dobre prijímaný, že infekcia Helicobacter pylori
(H. pylori
) hrá hlavnú úlohu v aktivácii chronický zápal vedúce k malignity [2]. Chronický zápal žalúdka iniciuje histopatologické progresiu chronickej gastritídy žalúdočné atrofia, črevné metaplázia a rakoviny nakoniec žalúdka [3]. Aj keď H. pylori
infekcie je extrémne prevládajúci, iba malá menšina (približne 1%) infikovaných jedincov sa po mnohých rokoch ochorie rakovinou žalúdka. Zdá sa, že sa riadi genetickou predispozíciou k vysokým úrovniam expresie prozápalových cytokínov [4].
Nukleárneho faktora kappa B (NF-kappaB) cesta bola dlho považovaná za hlavnú prozápalový signálna dráha je premenná reakcie na tento spoločný patogénu, do značnej miery založený na aktiváciu NF-kappa B protizápalovými cytokíny a role NF-kappa B v transkripčný aktiváciu responzívne génov, vrátane cytokínov a chemokiny [5]. Ďalej len "kanonické" cesta pre aktiváciu NF-kappa B je vyvolaná prozápalových cytokínov, ako sú IL-1 a obvykle vedie k aktivácii vzťahu alebo Crel s obsahom komplexov [6]. NF-kappaB existuje v cytoplazme v neaktívnej forme spojeného s regulačnými proteínmi, označované ako inhibítory kB (IkappaB), z ktorých môže byť najdôležitejšie IκBα, IκBβ a IκBε. IκBα je spojená s prechodným aktiváciu NF-kappa B, zatiaľ čo IκBβ sa podieľa na trvalú aktiváciu [7]. Avšak, chronický zápal je zložitý fyziologický proces, a úloha NF-kappa B v zápalovej odpovedi nebol doteraz úplne preskúmaný.
Okrem ovplyvňujú expresiu génu kódujúci proteín, zápal stres tiež mení úroveň expresie mikroRNA (miRNA) [8]. MikroRNA sú skupinou endogénnych, malý, nekódujúca RNA, ktoré negatívne regulujú expresiu génov na posttranskripční úrovni predovšetkým prostredníctvom väzby na netranslatované oblasti 3 'cieľovej mRNA, a majú dôležité regulačné funkcie riadenia rozličných fyziologických a patologických procesov [9, 10]. Tieto RNA bolo preukázané, že sa podieľajú na regulácii mnohých bunkových procesov, vrátane proliferácie, diferenciácie a apoptózy [11-13]. Avšak, či už chronické zápaly reguluje expresiu miRNA moduláciou transkripcie génu alebo úpravy post-transkripčný zrenie nebola stanovená.
V tejto práci sme zistili, že mier-425 indukčný na IL-1β-indukovaného zápalu bola závislá na aktiváciu NF-kappaB, čo zvyšuje MIR-425 génovú transkripciu. Okrem toho je stimulovaná MIR-425 priamo cielené fosfatázu a tensinu homológov (Ptení) a negatívne reguluje jeho expresiu, ktorý podporoval prežitie buniek na IL-1 indukcie.
Experimentálne postupy
vyhlásenie pre etiku
Všetky vzorky boli získané od pacientov, ktorí podstúpili chirurgický zákrok na Fudan University v Šanghaji Cancer Center. Protokol bol schválený Clinical Research etickou komisiou Fudan University, a Výskum bol vykonaný v súlade s ustanoveniami Helsinskej deklarácie z roku 1975. okolitom normálnom tkanive boli vyrezané od žalúdka rakoviny lézie makroskopicky a ich histologické diagnóza bola potvrdená mikroskopicky. Písomný informovaný súhlas bol získaný od všetkých účastníkov zapojených do štúdie.
Bunková kultúra a činidlá
ľudské embryonálne obličkové bunkové línie HEK293 (ATCC ® CRL-1573 ™), ľudský karcinóm prsníka bunkové línie MDA-MB361 (ATCC ® HTB-27 ™), ľudského adenokarcinóme žalúdka bunková línia AGS (ATCC ® CRL-1739 ™), SNU-1 (ATCC ® CRL-5971 ™), SNU-5 (ATCC ® CRL-5973 ™), SNU-16 (ATCC ® CRL-5974 ™), Hs746T (ATCC ® HTB-135 ™), NCI-N87 (ATCC ® CRL-5822 ™), a KATO III (ATCC®HTB-103 ™) boli udržiavané v DMEM obsahujúcom 10% fetálne hovädzieho séra. Všetky bunkové línie boli udržiavané v médiu obsahujúcom penicilín (100 IU /ml) a streptomycínom (100 mg /ml) pri 37 ° C s 5% CO 2. Mierny napodobňuje a anti-miRNA boli zakúpené od firmy Ambion (Austin, TX, USA). Inhibítor IKK TPCA-1 (kat. Č S2824), inhibítor p38 MAPK BIX02188 (kat. Č S1574) a inhibítor JNK SP600125 (kat. Č S1460) boli zakúpené od Selleckchem (Houston, TX, USA). Rekombinantný ľudský IL-1β boli zakúpené od spoločnosti Sigma-Aldrich (kat. Č H6291, Shanghai, Čína).
Extrakcia RNA a PCR v reálnom čase
Celková RNA bola extrahovaná z buniek za použitia TRIzolu (Invitrogen, Carlsbad, CA ). Pre analýzu mikroRNA, poly (A) chvosty boli pridané k celkovej RNA s použitím poly (A) polymerázy (Ambion, Carlsbad, CA) pred reverznej transkripciou. Detekčná súprava MiRcute miRNA qPCR (TIANGEN, Beijing, Čína) bol použitý pre kvantifikáciu hladiny expresie zrelého Mir-425 v súlade s protokolom za predpokladu, a GAPDH bola použitá ako vnútorná kontrola. Real-time PCR bola vykonaná za nasledujúcich podmienok: 95 ° C 10 m, 1 cyklus; 95 ° C 10 s, 55 ° C 34 s, 40 cyklov.
Pre všetky výsledky získanými real-time PCR metódy sme použili delta delta CT metóda na výpočet násobnú zmenu génovej expresie medzi rôznymi skupinami. Množstvo cieľ (Ptení /MIR-425), normalizované k endogénnemu génu GAPDH upratovanie a relatívnym vzhľadom na referenčný vzorke sa vypočíta podľa nasledujúcej rovnice :. množstvo cieľovej = 2 - △△ CT
imuno-blottingom
Proteíny boli separované na 10% SDS-PAGE gélu a následne prenesené na PVDF membránu. Po blokovaní 5% netučného mlieka, bola membrána inkubovaná s myšou monoklonálnou anti-Ptení protilátkou (1: 500, Santa Cruz, sc-7974) a NF-kappaB P65 phosphat (pS536) (Relay) protilátkou (1: 10000 ., EPITOMICS, Cat #: 2220-1). IRdye značené sekundárne protilátky boli použité pre kvantifikáciu imunoblotu signálu a signály boli analyzované pomocou skenera Odyssey (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA).
Luciferase Assay
HEK293 buniek a bunky boli AGS transfekované Mir-425 a pGL3 luciferázového reportérového konštrukty nesúci cieľovú sekvenciu MIR-425. Po 24 hodinách aktivity luciferázy svetlušky a Renilla luciferázy v bunkových lyzátov bola meraná s Dual-Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI, USA). Pre transkripciu reporterového testu luciferázy, MIR-425 génu promotorové sekvencie (WT alebo vypúšťa site) boli klonované do promotorové oblasti pGL3-Basic vektora, a aktivita luciferázy bola meraná ako je popísané vyššie.
Chromatin Imunoprecipitácia (čipu)
Stručne, ošetrené bunky boli zosietené 1% formaldehydu, nastrihané na priemernú veľkosť 400 bp, a potom imunoprecipitovány protilátkami proti NF-kappa B (Santa Cruz, sc-166588). Čip-PCR priméry boli navrhnuté pre amplifikáciu promotorové oblasti, ktoré obsahujú predpokladané NF-kappa B väzobné miesta v rámci MIR-425, ako je znázornené. Pozitívne kontrolné protilátka (RNA polymerázy II) a negatívne kontrolné non-imúnna IgG boli použité na preukázanie účinnosti týchto reagencií (Epigentek Group Inc., P-2025-48). Imunoprecipitovány DNA sa potom čistí, uvoľní, a vymýva. Eluovanej DNA môžete využiť na nadväzných aplikácií chip-PCR. Násobné obohatenie (FE) bola vypočítaná za použitia pomeru účinnosti amplifikácie vzorky čipu, že viac ako non-imunitného IgG. účinnosť amplifikácie polymerázovej RNA II, bol použitý ako pozitívna kontrola. FE% = 2 (IgG CT - vzorka CT). X 100%
Cell Test proliferácie
testu proliferácie buniek sa vykonáva za použitia Cell počítanie Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japonsko) podľa pokynov výrobcu. Pred pridaním CCK-8, boli bunky premyté teplým médiu kultúry otáčaním doska pri 500 otáčkach za minútu po 3 m, a potom odstránenie supernatantu.
Apoptózu testu
Rakovinové bunky boli zozbierané a resuspendované v 500 ul väzbového pufra. Bunková suspenzia (100 ul) bol inkubuje sa s ním s 5 ul annexinu-V a propidium jodidu pri izbovej teplote po dobu 20 minút. Zafarbený Bunky boli analyzované fluorescenčnou triedenia aktivovaných buniek (FACS) za použitia prietoku BD LSR II cytometrie.
Bunkového cyklu analýza
Pre analýzu prietokovou cytometriou, boli bunky trypsinizovány a fixované v 70% etanolu sa cez noc. Bunky potom boli inkubované v 0,5 ml propidium jodidu roztoku obsahujúceho 25 ug ml -1 RNázy po dobu 15 minút pri teplote 37 ° C a meria.
Experimenty myš
NCI-N87 buniek (3 x 10 6) boli injikované do pravých bokov athymických nu /nu myší. Jeden týždeň po injekciách, myši s porovnateľne veľkých nádorov boli liečení počas 4 týždňov s anti-MIR-425. Anti-MIR-425 (2 nmol) bol injekčne priamo do nádoru dvakrát týždenne počas 4 týždňov.
Štatistická analýza
výsledky sú uvedené ako priemer ± SEM, a dáta boli analyzované pomocou Studentov testu. Hodnota p Hotel < 0,05 bola považovaná za štatisticky významnú.
Výsledky
IL-1 Ošetrenie indukuje MIR-425 expresie
charakterizovať miRNA zodpovedné za indukciu IL-1, sme profilované miRNA expresie v PBS-liečených AGS buniek a IL-1 indukovaná AGS bunky pomocou Array System Exiqon miRCURY ™ LNA (v.14.0). Hladiny miRNA významne líšila medzi PBS-liečenej skupiny a IL-1β vyvolané skupinou, ako je znázornené na teplotné mapa ukázaná na obrázku 1A. Na zachytenie sondy 1.891, 46 miRNA boli odlišne exprimované v IL-1 indukovanej AGS buniek v porovnaní s párovými PBS-liečených AGS buniek; z týchto miRNA, 29 boli zvýšené a 17 boli v IL-1 indukovanej AGS buniek (tabuľka 1) sa znížil, čo ukazuje, že konkrétne miRNA vzor je spojená s IL-1 indukcie. Obrázok 1 Porucha regulácie miRNA v ľudských AGS buniek ošetrených IL-1. (A) Ľudské AGS bunky boli ošetrené s IL-1 (10 ng /ml) [14], a o 24 hodín neskôr sa miRNA profil expresie bola analyzovaná pomocou microarray technológií. Teplo Mapový diagram vytvárané bez dozoru analýzou clustering s 46 výrazne porušenou reguláciou miRNA. Červená označuje upregulaci; Zelená farba indikuje down-reguláciu. (B) Zvýšené hladiny MIR-425 v 36 nádorových vzoriek vzhľadom na ich množstvo v párových susediacich normálnych tkanivách, merané podľa real-time PCR. Normálny: priľahlé normálneho tkaniva. (C) hladiny expresie MIR-425 bola skúmaná pomocou real-time PCR v rôznych bunkových línií karcinómu žalúdka a šiestich normálnych buniek sliznice žalúdka.
Tabuľka 1 Podstatné dysregulácia miRNA
nadmerne exprimovaný u IL-1 indukovanej-AGS buniek
miRNA
násobnú zmenu
hodnotu p
HSA-MIR-425
12,36
0,00
hsa-miR-584
11.03
0.01
hsa-miR-31
8.12
0.00
hsa-miR-155
6.22
0.00
hsa-let-7i
5.55
0.00
hsa-miR-21
5.11
0.00
hsa-miR-335
4.89
0.01
hsa-miR-191
4.73
0.03
hsa-miR-519d
4.37
0.02
hsa-miR-520d-5p
3,95
0.00
hsa-miR-331
3.67
0.01
hsa-miR-142
3.45
0.01
hsa-miR-518a-5p
3.28
0.01
hsa-miRPlus-F1231
3.11
0.01
hsa-miR-2113
2.94
0.02
hsa-miR-196a*
2.88
0.02
hsa-miR-1304
2.78
0.02
hsa-miR-185
2.65
0.01
hsa-let-7a
2.61
0.00
hsa-miR-130
2.52
0.02
hsa-miR-1280
2.50
0.01
hsa-miR-222
2.47
0.01
hsa-let-7c
2.43
0.00
hsa-miR-602
2.31
0.00
hsa-miR-548e
2.31
0.03
hsa-miR-32
2.27
0.04
hsa-miR-181a
2.24
0.02
hsa-miR-7
2.13
0.00
hsa-miR-21*
2.06
0.00
Underexpressed v IL-1 indukovanej-AGS buniek
Mirna
fold hodnotou p zmena

hsa-miR-143
0.06
0.02
hsa-miR-200
0.08
0.01
hsa-miR-451
0.13
0.01
hsa-miR-144
0.17
0.00
hsa-miR-363
0.20
0.01
hsa-miR-637
0.25
0.03
hsa-miR-153
0.39
0.01
hsa-miR-139
0.39
0.00
hsa-miR-617
0.42
0.01
hsa-miR-1915
0.43
0.00
hsa-miRPlus-F1153
0.45
0.00
hsa-miR-381
0.46
0.00
hsa-miR-145
0.47
0.02
hsa-miR-659
0.47
0.03
hsa-miR-125b
0.48
0.00
hsa-miR-183*
0.49
0.00
hsa-miR-638
0.49
0.01
*: Keď dve zrelé miRNA pochádzajú z protiľahlých ramien rovnakého pre-miRNA, hviezdičkou za názvom označuje, že miRNA vyjadrená v nízkych koncentráciách vzhľadom k miRNA v opačnom ramene vlásenky
Medzi týmito miRNA, spätných. 425 sa o najviac up-regulovaná na IL-1 indukcie. Pomocou real-time PCR analýzy, sme analyzovali MIR-425 expresie v 36 párovaných vzoriek (tumoru a priľahlé normálneho tkaniva od rovnakého pacienta). Zistili sme významne vyššiu hladinu MIR-425 expresie v nádorových vzoriek v porovnaní s úrovňou v priľahlých normálnych tkanivách (p Hotel &0,0001) (obrázok 1B). Skúmali sme hladiny expresie Mir-425 v sade žalúdočných nádorových bunkových línií a šiestich normálnych buniek sliznice žalúdka. Ako je znázornené na obrázku 1C, sme sa zdvihol AGS bunky s down-regulované MIR-425 a NCI-N87 buniek s up-regulované MIR-425 pre ďalšie štúdium. Hoci aktivácia MIR-425 bolo hlásené, že majú zásadný vplyv na iniciáciu a progresiu nádorových buniek rakoviny znížením expresie rozsiahlej siete génov [15], role Mir-425 v ľudských nádorov nebol objasnený , . Preto sme sa rozhodli MIR-425 na ďalšie vyšetrovanie
Vyjadrenie Ptení je negatívne regulovaná MIR-425
Na identifikáciu cieľov Mir-425 sme použili bežne používanú algoritmus, miRecords (http: //mirecords . biolead. org /), čo je integrovaný prostriedok pre živočíšnu miRNA-cieľových interakcií. Pre zvýšenie presnosti tejto predpovede, gény, ktoré boli predpovedané najmenej piatich jedenástich databáz (Diana, microinspector, Miranda, mirtarget2, mitarget, nbmirtar, pictar, pita, rna22, rnahybrid a targetscan) boli vybrané ako domnelé cieľov. Medzi týmito domnelých cieľov MIR-425, analýza génovej ontology ukázala, že boli zmenené expresné hladiny 9 kandidátnych génov; Tak, táto zmena by mohla prispieť k malígnemu fenotypu. Za použitia 3 'UTR testy luciferázy reportér, sme zistili, že nadmerná expresia MIR-425 významne inhibujú aktivitu luciferázy v bunkách HEK293 a AGS buniek exprimujúcich divokého typu Ptení 3' UTR reportér (obrázok 2A). Potvrdili sme, že Ptení je domnelý priamym cieľom MIR-425. Pre ilustráciu špecifickosti MIR-425, sme ukázali, že anti-MIR-425 špecificky ruší inhibíciu luciferázové aktivity, vyvolanej Mir-425 v bunkách HEK293 a NCI-N87 buniek (obrázok 2B). Mutácie v väzobných miest miRNA (obrázok 2C), vzťahuje konštrukty reagovať na Mir-425 indukciu (obr 2D), ďalej potvrdzuje, že gén Ptení je priamym cieľom MIR-425. Obrázok 2 MIR-425 sa priamo zameriava na Ptení. (A) Reportér test na bunkách HEK293 a AGS buniek transfektovaných s Mir-425 a konštruktov nesúcich luciferázy cDNA fúzovania k 3 'UTR z predpokladaných kandidátskych cieľov (priemer ± SEM). (B) Vplyv anti-MIR-425 na aktivitu luciferázy luciferázy konštruktov splynutých s 3 'UTR Ptení v bunkách HEK293 a NCI-N87 buniek (priemer ± SEM). (C, D), reportér test na bunkách HEK293 a AGS buniek transfektovaných luciferázové konštrukty nesúci Ptení 3 'UTR s mutáciami v Mir-425 väzbové miesta (priemer ± SEM). (E) Bunky HEK293 a AGS bunky boli transfekovány konštruktom luciferázy nesúci divokého typu Ptení 3 'UTR (LUC-WT) alebo konštrukt nesúci mutovaný Ptení 3' UTR (LUC-Mut). Po 24 hodinách boli bunky ošetrené s IL-1 a aktivita luciferázy bola kvantifikovaná 24 hodín po ošetrení. (F), Western blot a RT-PCR ukazuje hladiny Ptení proteínu a hladiny mRNA v AGS buniek po 48 hodinách MIR-425 transfekcia. (G) AGS bunky boli transfekovány s anti-MIR-425, a o 24 hodín neskôr, bunky boli buď ponechané neošetrené alebo ošetrené s IL-1 a následne sa zožne 24 hodín po ošetrení. Lyzáty celých buniek boli imunoblotovány s protilátkami Ptení. (H), NCI-N87 bunky boli transfekovány s anti-Mir-425 a zozbieraného 24 hodín po ošetrení. Lyzáty celých buniek boli imunoblotovány s protilátkami Ptení. (I) AGS bunky boli transfekovány plazmidom nesúcim iba otvoreného čítacieho rámca sekvencie Ptení (Ptení-CD). Po 24 hodinách boli bunky ošetrené s IL-1 alebo MIR-425. Lyzáty celých buniek boli podrobené imuno-blottingu po 24 hodinách liečby. (* P 0,05; ** p 0,01; *** p 0,001)
Navyše mutácia MIR-425 cieľovej sekvencie tiež významne zoslabený IL-1β-indukovanú represie Ptení 3 'UTR. reportér aktivita luciferázy v bunkách HEK293 a AGS buniek (Obrázok 2e). Nadmerná expresia MIR-425 bolo dostatočné pre znižuje expresiu Ptení expresie na úrovni proteínu a mRNA v bunkách (AGS Obrázok 2f). V súlade s tým, IL-1β vyvolaná Ptení represie bol zachránený exprimujúce anti-MIR-425 v AGS bunkách (Obrázok 2 g). Anti-MIR-425 bol schopný up-reguláciu expresie Ptení v NCI-N87 buniek bez IL-1 stimulácia (obr 2H).
Naše dáta tiež ukázala, že 3 'UTR je vyžadované pre mier-425, sprostredkovanú Ptení downregulaci preto, že expresia Ptení oblasti kódujúce konštrukt (Ptení-CD) bolo necitlivé na Mir-425 a nadmernou expresiou IL-1 indukcie v AGS bunkách (obr 2I). Dohromady tieto výsledky naznačujú, že mier-425 hrá rozhodujúcu úlohu pri potláčaní expresie Ptení zacielením jeho 3 'UTR na IL-1 indukcie. Je nutné
IL-1β-indukovanú aktiváciu NF-kappaB pre mier-425 indukciu
na určenie mechanizmu zapojený do MIR-425 pri transaktivaci IL-1 indukcie, sme skúmali vplyv rôznych inhibítorov kinázy na Mir-425 v indukcii IL-1β ošetrených AGS buniek. IL-1β-indukovanú MIR-425 up-regulácia bola významne inhibovaná inhibítory IKK TPCA-1, ale nie s inhibítorom BIX02188 p38 MAPK alebo inhibítora JNK SP600125 (obrázok 3A). Predchádzajúce štúdie preukázali, že IKK je základný kináza nutné pre NF-kappa B signalizácia; Preto, tento výsledok je uvedené kritickou úlohu NF-kappa B signalizácia v regulácii Mir-425 pri transkripciu IL-1 indukcie. Obrázok 3 aktiváciu IKK je pre indukciu Mir-425 v reakcii na IL-1 indukcie potreby. (A) AGS bunky boli ošetrené s IL-1 v prítomnosti inhibítora IKK TPCA-1, BIX02188 inhibítora p38 MAPK a JNK SP600125 inhibítora. Zrelé MIR-425 expresie na 12 hodín po ošetrení sa kvantifikuje real-time PCR. Záhyb zmena relatívnej MIR-425 expresie (MIR-425 /U6) je normalizované ako u PBS-liečených buniek. (B) Expresia primárne MIR-425 (pri-MIR-425), bola analyzovaná pomocou PCR v reálnom čase ako v A. (c) úrovne expresie NF-kappa B proteínu a pri-MIR-425 bola analyzovaná v reálnom time PCR v AGS buniek ošetrených siRNA pre NF-kappa B. (D) AGS bunky boli ošetrené s inhibítormi chémie alebo siRNA pre NF-kappa B. Fragmenty buniek boli získané 24 hodín po liečení IL-1 a imunoblotovány s protilátkami Ptení. (E) Analýza Western blot fosforylovaného NF-kappa B P65 (serín 536). (F) Hladiny expresie NF-kappa B proteínu a pri-MIR-425 boli analyzované metódou real-time PCR v NCI-N87 buniek ošetrených siRNA pre NF-kappa B. (* P 0,05; ** p 0,01; *** p 0,001). V súlade
, indukcia pri-MIR-425 pri liečení IL-1 bola výrazne inhibovaná v prítomnosti inhibítora IKK alebo siRNA pre NF-kappa B (obrázok 3B a C). Pozorovali sme tiež, že IL-1β vyvolaná Ptení represie bol zoslabený v prítomnosti inhibítora IKK alebo siRNA pre NF-kappa B (obrázok 3D). Na určenie, či bol prítomný v AGS buniek ošetrených IL-1 NF-kappaB činnosť, sme použili western blot pre stanovenie hladiny fosforylovanej NF-kappa B P65 (serín 536). Hladina fosforylovaného NF-kappa B P65 (serín 536) bola vysoká v AGS buniek ošetrených IL-1 (10 ng /ml, 24 hodín) (Obrázok 3E). Okrem toho, umlčanie NF-kappa B inhibovaná MIR-425 expresie v NCI-N87 buniek bez IL-1 ošetrenie (obrázok 3F). Tieto výsledky naznačujú, že IKK-dependentný aktivácia NF-kappa B po pôsobení IL-1 je nutné pre down-reguláciu Ptení, pravdepodobne prostredníctvom svojho zosilnenie MIR-425 transkripcie.
Pre stanovenie, či NF-kappaB priamo reguluje MIR-425 transkripcie, sme analyzoval upstream sekvencie MIR-425 s využitím knižnice WeightMatrix (matrixTFP60.lib) a identifikované tri potenciálne väzbové miesta NF-kappa B v promotorové oblasti MIR-425 (cut-off: podobnosť matíc = 0,9 a jadro podobnosti = 0,95) ( obrázok 4A). Vykonali sme chromatínu imunoprecipitáciou (čipu) testy s AGS rakovinových buniek pomocou monoklonálnych anti-NF-kappa B protilátky. Ako je znázornené na obrázku 4B, len primer-B z MIR-425 vyrába silné PCR produktov, ktoré navrhol, že NF-kappaB proteín vytvorený komplexy s väzbového miesta B v promótorom Mir-425. Výsledky luciferázové reportéri testy naznačujú, že je potrebné potenciálny B väzobné miesto v promótorom Mir-425 pre transaktivaci nadväzujúceho génu po IL-1 indukcie (obrázok 4A a C). Obrázok 4 NF-kappa B väzobné miesta v promótor Mir-425. (A) Vlastnosti MIR-425 5 'hraničnej DNA. Ľudské promotorové oblasti MIR-425 obsahuje tri domnelé väzobné miesta pre NF-kappa B. (B) CHIP testy s anti-NF-kappa B protilátok ukázala väzba NF-kappa B na promótor Mir-425 v bunkách AGS. Relatívna occupancies NF-kappa B sú uvedené ako zvislé pruhy. Grafy ukazujú bar priemery z troch nezávislých pokusov čipu. (C) Promótor MIR-425 sa aktivuje NF-kappa B. AGS bunky boli ošetrené s NF-kappa B a prenesené uvedenými luc vektorov.
Indukcia MIR-425 podporuje prežívanie buniek upon IL-1 indukcie
Bolo ukázané, že Ptení je jedným z najčastejšie inaktivovaných tumor supresorových génov. Nadmerná expresia Ptení v rôznych bunkách tkanivovej kultúry cicavčích vplyv rôznych procesov, vrátane bunkovej proliferácie, bunkovej smrti a migráciu buniek [16]. Tiež sme zistili, že inhibícia Ptení znížila aktivácie kaspázy-3 v bunkách ošetrených IL-1 (Obrázok 5A). Je pravdepodobné, že mier-425 indukčný môže inhibovať apoptózu prostredníctvom downregulace Ptení v bunkách IL-1 liečených. V skutočnosti, zvýšená expresia MIR-425 inhibuje aktiváciu kaspasy-3 na cisplatinu ošetrených AGS buniek (obrázok 5B). Okrem toho, v cisplatinu ošetrených buniek AGS, kotransfekcí konštruktu, ktorý obsahuje iba kódujúci oblasť Ptení (Ptení-CD), ktorý je necitlivý na MIR-425, obišiel antiapoptotických účinok nadmernej expresie MIR-425 (obr 5C). V súlade s tým, transfekcia anti-MIR-425 v bunkách AGS významne zvýšená kaspázy-3 aktivácia a apoptózu v odpovedi na IL-1 ošetrenie (obrázok 5D). Okrem toho, transfekcia anti-MIR-425 v NCI-N87 buniek významne zvýšená kaspázy-3 aktivácia a apoptózu bez IL-1 stimulácia (obr 5E). Obrázok 5 MIR-425 inhibuje apoptózu buniek potlačením Ptení. (A). AGS bunky boli ošetrené s kontrolou (PBS) alebo IL-1. Po 48 hodinách, lyzáty celých buniek boli imunoblotovány. (B). AGS bunky boli prechodne transfekovány s negatívnou kontrolou (MIR-NC) alebo MIR-425 samotného. Po 24 hodinách boli bunky ošetrené s cisplatinou a zozbieraného 24 hodín po ošetrení. Lyzáty celých buniek boli imunoblotovány. (C). AGS bunky boli transfekovány s Mir-NC, MIR-425, a Ptení-CD, ako je uvedené. Po 24 hodinách boli bunky ošetrené s cisplatinou a zozbieraného 24 hodín po ošetrení. Miera apoptózy buniek bola stanovená s použitím metódy prietokovej cytometrie. (D). AGS bunky boli transfekovány s Mir-NC alebo anti-MIR-425. Po 48 hodinách boli bunky ošetrené IL-1 a zozbieraného 24 hodín po ošetrení. Celkové fragmenty buniek boli imunoblotovány s uvedenými protilátkami, a miera apoptózy buniek bola stanovená s použitím metódy prietokovej cytometrie. (E) NCI-N87 bunky boli transfekovány s Mir-NC alebo anti-MIR-425. Celkové fragmenty buniek boli imunoblotovány s uvedenými protilátkami, a miera apoptózy buniek bola stanovená s použitím metódy prietokovej cytometrie.
V súlade so svojou úlohu v inhibíciu aktivácie kaspasy, upregulaci Mir-425 v podstate zvýšenú proliferáciu buniek AGS, zatiaľ čo pro- účinok prežitie bol kompletne blokovaný ko-transfekcia s exogénnym Ptení (Ptení-CDS) (obrázok 6A). Anti-MIR-425 sa znížil percento proliferujúcich buniek pre NCI-N87 buniek (obrázok 6B). Tiež sme zistili, že inhibícia Ptení má ochranný účinok podobný ako u buniek s nadmernou expresiou Mir-425 (obr 6c), čo naznačuje, že Ptení represie môže hrať významnú úlohu v Mir-425-závislé ochrany v bunkách ošetrených IL-1. Obrázok 6 MIR-425 podporuje bunkovú proliferáciu potlačením Ptení. (A) AGS bunky boli ošetrené s PBS, IL-1, MIR-NC, MIR-425, a Ptení-CD, ako je uvedené. Po 72 hodinách, množenia buniek stanovený s použitím súpravy pre značenie EDU. (B) NCI-N87 bunky boli transfekovány s Mir-NC alebo anti-MIR-425. Po 72 hodinách sa rýchlosť proliferácie buniek bola stanovená s použitím súpravy pre značenie EDU. (C) AGS bunky boli ošetrené s siRNA-Ptení alebo MIR-425. Po 72 hodinách, množenia buniek stanovený s použitím súpravy pre značenie EDU. (D) Fotografie expresie Ptení proteínu v nádorovom tkanive (horný panel) a nádorov (dolný panel). (E) Graf ukazuje hmotnosť 3 nádorov po 4 týždne (n = 3). (F) Významná inverzná korelácia je pozorovaná medzi úrovňou expresie Mir-425 a Ptení v rakovinových tkanivách žalúdka (n = 52). (G) Hladiny expresie Ptení sú stanovené v šiestich normálnych buniek žalúdočnej sliznice žalúdka a nádorových bunkových línií s použitím PCR v reálnom čase. (H) model znázorňujúci predpokladanej role IL-1 a Mir-425 v riadení Ptení dráhy v ľudských bunkách karcinómu žalúdka.
Skúmali sme účinok Mir-425 na skúšky na tvorbu nádorov in vivo. Nádory liečené anti-MIR-425 ukázali zvýšenú hladinu v Ptení proteínu (obrázok 6D). Tiež, anti-MIR-425 znižuje hmotnosť nádoru u myší v porovnaní s Mir-NC-liečenej skupiny (obrázok 6E). Použitie non-parametrické testy sme zistili významný inverzný koreláciu medzi Ptení mRNA a expresie Mir-425 vo vzorkách karcinómu žalúdka (obr 6f). Hladiny expresie Ptení boli tiež stanovené v šiestich normálnych buniek žalúdočnej sliznice žalúdka a nádorových bunkových línií s použitím PCR v reálnom čase. Ako je znázornené, bunky sa "down-regulované" MIR-425 majú vyššie množstvo Ptení v porovnaní s bunkovými líniami s "up-regulované" hladiny Mir-425 (obr 6G). Záverom možno povedať, naše výsledky preukázali, že mier-425 hrá príčinnú úlohu prostredníctvom zacielenia Ptení v karcinómov žalúdku.
Diskusia
Interleukín-1 (IL-1), je hlavnou pre-zápalový cytokín, ktorý je produkovaný alebo malígne mikroprostredie buniek [17]. IL-1 tiež funguje ako pleiotropické cytokín podieľa na vzniku nádorov a nádorov zasahovania; preto predstavuje uskutočniteľný kandidáta modulačné cytokín, ktorý môže nakláňať rovnováhu medzi zápalu a imunity voči indukciu protinádorových odpovedí [18]. IL-1α a IL-1β sú hlavné agonisty IL-1. Vo svojich secernovanej formy, IL-1α a IL-1β viazať na rovnaké receptory a indukujú rovnaké biologické funkcie [19]. Avšak, IL-1α a IL-1β sa líšia v ich kompartmentalizace v bunke alebo v mikroprostredia [20]. IL-1β je aktívna len vo svojej vylučované forme a sprostredkováva zápal, ktorý podporuje karcinogenéze, nádorové invazívnosti a imunosupresiu [21]. Niektoré nové anti-IL-1 činidlá boli použité v klinických štúdiách u pacientov vykazujúcich rôzne choroby sa zápalovými prejavmi [22]. Lepšie pochopenie integračné role IL-1β signálnych dráh v malígneho procesu umožní uplatnenie nových IL-1 moduláciu prístupy u pacientov s rakovinou.
Ptení bol objavený ako významný nádorový supresor, ktorý je často zmutovaný alebo stratené v rôzne druhy rakoviny [23]. Niekoľko línií dôkazov ukázali Ptení ako lipidovej fosfatázy, ktorá hydrolyzuje 3 'fosfát v fosfoinositidů [24]. Ptení môže tiež regulovať aktivitu serín /treonín kinázy Akt /PKB a môžu tak ovplyvňovať prežívanie buniek signalizácie [25]. UV žiarenie môže vyvolať Ptení interakciu s variantmi receptora divokého typu melanokortinu-1, ktorý chráni Ptení z WWP2 sprostredkovaná degradácia, čo vedie k inaktivácii AKT v melanómu [26]. Existuje niekoľko mechanizmov pre reguláciu Ptení, vrátane transkripcie, stabilita mRNA, mikroRNA cielenie, preklady a stability proteínov. Ptení je Transkripční umlčaný metylácie promótorom v karcinómu žalúdka [27]. Ptení môže byť tiež post-translačný regulovaná acetyláciou, ubiquitylation, oxidácii, fosforylácie, a subcelulárnu lokalizácia [28]. Cez rozsiahly charakterizáciu Ptení mutácií v ľudských nádoroch a pomerne dobré pochopenie molekulárnej rolí Ptení v riadení bunkových procesov, málo sa vie o režimy regulácie Ptení.
Ptení môže byť inhibovaná v rakovinových bunkách po indukcii pre-zápalový cytokín IL-1β [29]. Stimulácia s IL-1 aktivuje NF-kappa B fosforyláciou a degradácie IKB. Táto aktivácia umožňuje, NF-kappaB translokácie do jadra a transkripčný aktiváciu cieľových génov [30]. NF-kappaB je heterodimerní transkripčný aktivátor skladajúci sa z DNA väzbové podjednotky p50 a transaktivační podjednotky P65 [31]. Vysoké hladiny endogénneho NF-kappa B znížila expresie Ptení, a Ptení expresie by mohla byť zachránená špecifickou inhibíciou dráhy NF-kappa B [32]. Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo príprave rukopisu.
Autorov pôvodné predloženej súbory obrazov
Nižšie sú uvedené odkazy na autorov pôvodných predložených súborov pre obrázky , Všetci autori čítať a schválená konečná rukopis.

• Vplyv IL17A polymorfizmov na aberantne metylácie DAPK a CDH1 v non-rakovinové žalúdočné mucosa
• Neobvyklý trichobezoárov žalúdka a čriev: prípad report