NF-kappaB-afhængig MicroRNA-425 opregulering fremmer gastrisk vækst cancercelle ved at målrette PTEN upon IL-1β induktion

NF-kappaB-afhængig MicroRNA-425 opregulering fremmer gastrisk cancercellevækst ved at målrette PTEN upon IL-1β induktion
Abstract
Overekspression af det proinflammatoriske cytokin IL-1β er associeret med forskellige sygdomme, herunder cancer. Ændring af microRNA er blevet observeret i kræftceller udsat for proinflammatoriske cytokiner, men deres funktion i inflammation stress stadig undvigende. Her viser vi, at IL-1β inducerer opregulering af MIR-425, som negativt regulerer phosphatase og tensin homolog ekspression ved at målrette dens 3'UTR. En stigning i MIR-425 afhænger IL-1β-induceret NF-kappaB aktivering, hvilket forbedrer MIR-425 gentranskription upon IL-1β induktion. Følgelig undertrykkelse af phosphatase og tensin homolog af MIR-425 fremmer gastrisk cancer celleproliferation, som kræves for at beskytte celler fra cisplatin-induceret apoptose. Tilsammen understøtter vores data en afgørende rolle for NF-kappaB-afhængig opregulering af miR-425, som repræsenterer en ny vej for undertrykkelsen af ​​fosfatase og tensin homolog aktivering og fremme af celle overlevelse på IL-1β induktion.
nøgleord
IL-1β NF-kappaB miR-425 PTEN mavekræft Baggrund
gastrisk adenocarcinom er den fjerde og femte mest almindelige kræftform blandt mænd og kvinder, henholdsvis på verdensplan og er stærkt knyttet til kronisk inflammation [1]. Det er nu godt accepteret, at infektion med Helicobacter pylori
(H. pylori
) spiller en vigtig rolle i udløsningen af ​​kronisk inflammation fører til malignitet [2]. Kronisk inflammation i mave initierer den histopatologiske progression af kronisk gastritis til gastrisk atrofi, intestinal metaplasi og endelig gastrisk cancer [3]. Mens H. pylori
infektion er ekstremt udbredt, vil kun et lille mindretal (ca. 1%) af inficerede individer udvikle mavekræft efter mange år. Den variable svar på denne fælles patogen synes at være styret af en genetisk disposition til høj ekspressionsniveauer af proinflammatoriske cytokiner [4].
Nukleare faktor kappa B (NF-kappaB) vej har længe været betragtet som en vigtig proinflammatorisk signalvej, vid udstrækning baseret på aktiveringen af ​​NF-kappaB af proinflammatoriske cytokiner og den rolle, NF-kappaB i den transkriptionelle aktivering af responsive gener, herunder cytokiner og kemokiner [5]. Den "canonical" vej for NF-kappaB-aktivering udløses af proinflammatoriske cytokiner såsom IL-1β og normalt fører til aktivering af forbindelserne eller CreL-holdige komplekser [6]. NF-kappaB eksisterer i cytoplasmaet i en inaktiv form forbundet med regulatoriske proteiner nævnt som inhibitorer af KB (IKB), hvoraf den vigtigste kan være kBa, IκBβ, og IκBε. KBa er forbundet med forbigående NF-kappaB-aktivering, hvorimod IκBβ er involveret i vedvarende aktivering [7]. Men kronisk inflammation er en kompleks fysiologisk proces, og den rolle, NF-kappaB i det inflammatoriske respons er endnu ikke fuldt udforsket.
Udover at påvirke protein-kodende genekspression, inflammation stress ændrer også ekspressionsniveauet af microRNA (miRNA) [8]. MikroRNA'er er en klasse af endogen, lille, ikke-kodende RNA, der negativt regulerer genekspression ved post-transkriptionel niveau hovedsageligt via binding til den 3 'utranslaterede region af et mål-mRNA, og de har vigtige regulatoriske funktioner i kontrollen af ​​forskellige fysiologiske og patologiske processer [9, 10]. Disse RNA har vist sig at være involveret i reguleringen af ​​mange cellulære processer, herunder proliferation, differentiering og apoptose [11-13]. Men om kronisk inflammation regulerer miRNA ekspression ved modulering af gentranskription eller ændring posttranskriptionel modning er ikke blevet bestemt.
I dette arbejde, fandt vi, at MIR-425 induktion efter IL-1β-induceret inflammation var afhængig af aktivering af NF-kappaB, som forbedret mIR-425 gentranskription. Desuden opreguleret miR-425 direkte målrettet fosfatase og tensin homolog (PTEN) og negativt reguleret sit udtryk, som fremmes celle overlevelse på IL-1β induktion.
Eksperimentelle procedurer
Etik erklæring
Alle prøver blev opnået fra patienter, som gennemgik kirurgi ved Fudan University i Shanghai Cancer center. Protokollen blev godkendt af Clinical Research etiske komité for Fudan University, og forskningen blev udført i henhold til bestemmelserne i Helsinki-erklæringen af ​​1975. Tilstødende normale væv blev fjernet fra den mavekræft læsion makroskopisk og deres histologiske diagnose blev bekræftet mikroskopisk. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle deltagere i undersøgelsen.
Cellekultur og reagenser
human embryonisk nyrecellelinie HEK293 (ATCC @ CRL-1573 ™), den humane brystcancer-cellelinie MDA-MB361 (ATCC ® HTB-27 ™), den humane gastrisk adenocarcinom cellelinie AGS (ATCC @ CRL 1739 ™), SNU-1 (ATCC @ CRL-5971 ™), SNU-5 (ATCC @ CRL-5973 ™), SNU-16 (ATCC ® EF- referencelaboratoriet 5974 ™), Hs746T (ATCC @ HTB-135 ™), blev NCI-N87 (ATCC @ CRL-5822 ™), og KATO III (ATCC®HTB-103 ™) opretholdt i DMEM indeholdende 10% føtalt bovint serum. Alle cellelinier blev opretholdt i medium indeholdende penicillin (100 IE /ml) og streptomycin (100 mg /ml) ved 37 ° C med 5% CO 2. MiRNA efterligner og anti-miRNA blev indkøbt fra Ambion (Austin, TX, USA). IKK-inhibitoren TPCA-1 (katalog nr. S2824), p38 MAPK inhibitor BIX02188 (katalog nr. S1574), og JNK-inhibitor SP600125 (katalog nr. S1460) blev indkøbt fra Selleckchem (Houston, TX, USA). Rekombinante human IL-1β blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (Cat. No. H6291, Shanghai, Kina).
RNA-ekstraktion og real-time PCR
Totalt RNA blev ekstraheret fra celler under anvendelse af TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA ). For microRNA analyse blev poly (A) haler tilsat til totalt RNA under anvendelse af poly (A) polymerase (Ambion, Carlsbad, CA) forud for revers transkription. Den MiRcute miRNA qPCR detektion kit (TIANGEN, Beijing, Kina) blev anvendt til at kvantificere ekspressionsniveauerne af kønsmodne MIR-425 ifølge den medfølgende protokol, og GAPDH blev anvendt som en intern kontrol. Real-time PCR blev udført under følgende betingelser: 95 ° C 10 m, 1 cyklus; 95 ° C 10 s, 55 ° C 34 s, 40 cykler.
For alle resultater, som real-time PCR-metoder, vi brugte delta delta CT metode til beregning af gange ændring i genekspression mellem forskellige grupper. Mængden af ​​mål (PTEN /miR-425), normaliseret til det endogene husholdning gen GAPDH og i forhold til en reference prøve, er givet ved følgende ligning:. Mængde target = 2 - △△ CT
Immunoblotting Salg Proteiner blev separeret på en 10% SDS-PAGE-gel og efterfølgende overført til en PVDF-membran. Efter blokering med 5% fedtfri mælk blev membranen inkuberet med et monoklonalt muse-anti-PTEN antistof (1: 500, Santa Cruz, sc-7974) og en NF-kappaB p65 Phospho (pS536) (RELA) antistof (1: 10000 ., EPITOMICS, Cat #: 2220-1). IRdye-mærkede sekundære antistoffer blev anvendt til kvantificering af immunoblotting signal, og signalerne blev analyseret ved anvendelse af en Odyssey scanner (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA).
Luciferase assay
HEK293-celler og AGS celler var transficeret med mIR-425 og pGL3 luciferase reporter-konstruktioner, der huser mIR-425 målsekvensen. Efter 24 timer blev aktiviteterne i ildflue-luciferase og renilla luciferase i cellelysaterne målt med Dual-Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI, USA). For luciferase transkription reporter assay, MIR-425-gen promotorsekvenser (WT eller websted tekst udgår) blev klonet ind i promotorregionen af ​​pGL3-Basic vektor, og luciferaseaktiviteten blev målt som beskrevet ovenfor.
Chromatin immunoprecipitation (chip)
Kort fortalt behandlede celler blev tværbundet med 1% formaldehyd, forskydes til en gennemsnitlig størrelse på 400 bp, og efterfølgende immunpræcipiteret med antistoffer mod NF-kappaB (Santa Cruz, sc-166.588). Chippen-PCR-primere blev udformet til at opformere promotorområder indeholdende formodede NF-kappaB bindingssites inden MIR-425 som illustreret. En positiv kontrol antistof (RNA-polymerase II) og en negativ kontrol ikke-immunt IgG blev anvendt til at påvise effekten af ​​de kitreagenser (Epigentek Group Inc, P-2025-48). Immunpræcipiteret DNA renses derefter, frigives, og elueret. Elueret DNA kan anvendes til efterfølgende anvendelser chip-PCR. Fold berigelse (FE) blev beregnet ved anvendelse af et forhold af amplificeringseffektiviteten af ​​chip stikprøven over den for ikke-immunt IgG. Amplifikationseffektivitet af Polymerase RNA II blev anvendt som en positiv kontrol. FE% = 2 (IgG CT - Sample CT). × 100%
Celleproliferationsassay
En celle proliferation assay blev udført under anvendelse af Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) i henhold til producentens anvisninger. Før tilsætningen af ​​CCK-8, blev cellerne vasket med varmt dyrkningsmedier ved spinding pladen ved 500 rpm i 3 m og derefter bortkastning af supernatanten.
Cell apoptose assay Salg The cancerceller blev høstet og resuspenderet i 500 pi af en bindingspuffer. Cellesuspensionen (100 pi) blev inkuberet med 5 pi annexin-V og propidiumiodid ved stuetemperatur i 20 minutter. De farvede celler blev analyseret med fluorescent cellesortering (FACS) under anvendelse af BD LSR II flowcytometri.
Cellecyklusanalyse
For flowcytometrianalyse blev celler trypsiniseret og fikseret i 70% ethanol natten over. Cellerne blev derefter inkuberet i 0,5 ml propidiumiodid opløsning indeholdende 25 ug ml -1 RNase i 15 minutter ved 37 ° C og måles.
Mouse eksperimenter
NCI-N87-celler (3 x 10 6) injiceret i den højre flanker på athymiske nu /nu mus. En uge efter injektionerne blev mus med sammenligneligt mellemstore tumorer behandlet i 4 uger med anti-MIR-425. Den anti-MIR-425 (2 nmol) blev injiceret direkte i tumorerne to gange ugentligt i 4 uger.
Statistisk analyse
Resultaterne er vist som middelværdi ± SEM, og dataene blev analyseret med Students t-test. En værdi på p
< 0.05 blev betragtet som statistisk signifikant.
Resultater
IL-1β behandling inducerer miR-425 udtryk
at karakterisere de miRNA er ansvarlige for IL-1β induktion, profileret vi miRNA udtryk i PBS-behandlede AGS celler og IL-1β inducerede AGS celler ved hjælp af Exiqon miRCURY ™ LNA Array System (v.14.0). De miRNA niveauer afveg stærkt mellem PBS-behandlede gruppe og IL-1β-induceret gruppe, som illustreret i varmen kortet vist i figur 1A. Blandt de 1.891 indfangningsprober blev 46 miRNA differentielt udtrykt i IL-1p-induceret AGS celler sammenlignet med parrede PBS-behandlede AGS celler; af disse miRNA, 29 blev forøget, og 17 blev reduceret i IL-1p-induceret AGS-celler (tabel 1), hvilket indikerer, at en specifik miRNA mønster er associeret med IL-1β induktion. Figur 1 dysregulering af miRNA i humane AGS celler behandlet med IL-1β. (A) menneskets AGS celler blev behandlet med IL-1β (10 ng /ml) [14], og 24 timer senere blev miRNA ekspressionsprofil analyseret med microarray teknologi. Heat map diagram genereret af uovervåget clustering analyse med 46 betydeligt dysreguleret miRNA. Rød indikerer opregulering; grøn indikerer nedregulering. (B) Øgede niveauer af miR-425 i 36 tumorprøver forhold til niveauet i matchede tilstødende normale væv som målt ved real-time PCR. Normal: tilstødende normale væv. (C) Ekspression niveau af MIR-425 blev undersøgt ved real-time PCR i flere gastriske cancercellelinier og seks normale gastriske mucosa celler.
Tabel 1 Signifikant dysregulering af miRNA
overudtrykt i IL-1p-induceret-AGS celler
miRNA
Fold forandring
p-værdi
HSA-miR-425
12.36
0.00
hsa-miR-584
11.03
0.01
hsa-miR-31
8.12
0.00
hsa-miR-155
6.22
0.00
hsa-let-7i
5.55
0.00
hsa-miR-21
5.11
0.00
hsa-miR-335
4.89
0.01
hsa-miR-191
4.73
0.03
hsa-miR-519d
4.37
0.02
hsa-miR-520d-5p
3,95
0.00
hsa-miR-331
3.67
0.01
hsa-miR-142
3.45
0.01
hsa-miR-518a-5p
3.28
0.01
hsa-miRPlus-F1231
3.11
0.01
hsa-miR-2113
2.94
0.02
hsa-miR-196a*
2.88
0.02
hsa-miR-1304
2.78
0.02
hsa-miR-185
2.65
0.01
hsa-let-7a
2.61
0.00
hsa-miR-130
2.52
0.02
hsa-miR-1280
2.50
0.01
hsa-miR-222
2.47
0.01
hsa-let-7c
2.43
0.00
hsa-miR-602
2.31
0.00
hsa-miR-548e
2.31
0.03
hsa-miR-32
2.27
0.04
hsa-miR-181a
2.24
0.02
hsa-miR-7
2.13
0.00
hsa-miR-21*
2.06
0.00
Underexpressed i IL-1-induceret-AGS celler
miRNA
Fold ændring
p-værdi
hsa-miR-143
0.06
0.02
hsa-miR-200
0.08
0.01
hsa-miR-451
0.13
0.01
hsa-miR-144
0.17
0.00
hsa-miR-363
0.20
0.01
hsa-miR-637
0.25
0.03
hsa-miR-153
0.39
0.01
hsa-miR-139
0.39
0.00
hsa-miR-617
0.42
0.01
hsa-miR-1915
0.43
0.00
hsa-miRPlus-F1153
0.45
0.00
hsa-miR-381
0.46
0.00
hsa-miR-145
0.47
0.02
hsa-miR-659
0.47
0.03
hsa-miR-125b
0.48
0.00
hsa-miR-183*
0.49
0.00
hsa-miR-638
0.49
0.01
*: Når to modne miRNA stammer fra modsatte arme af samme pre-miRNA, en stjerne efter navnet angiver en miRNA udtrykt på et lavt niveau i forhold til miRNA i den modsatte arm af en hårnål
Blandt disse miRNA, miR-. 425 blev den mest opreguleret på IL-1β-induktion. Brug real-time PCR-analyse, vi analyserede miR-425-ekspression i 36 parrede prøver (tumor og tilstødende normale væv fra den samme patient). Vi fandt en signifikant højere niveau af miR-425 udtryk i tumorprøver forhold til niveauerne i de tilstødende normale væv (p
< 0,0001) (Figur 1B). Vi undersøgte ekspressionsniveauet af MIR-425 i et sæt af gastriske cancercellelinier og seks normale gastriske mucosa celler. Som vist i figur 1C, vi afhentet AGS celler med nedreguleret MIR-425 og NCI-N87 celler med opreguleret MIR-425 til yderligere undersøgelse. Selv aktiveringen af ​​MIR-425 er blevet rapporteret at have en afgørende indflydelse på kræft initiering og progression af cancerceller ved at reducere ekspressionen af ​​et omfattende netværk af gener [15], rolle MIR-425 i humane cancere er ikke blevet belyst . . Vi valgte derfor miR-425 for yderligere undersøgelser
Ekspression af PTEN er negativt reguleret af miR-425
At identificere målene i miR-425, har vi ansat en almindeligt anvendt algoritme, miRecords (http: //mirecords . biolead. org /), som er en integreret ressource for dyr miRNA-target interaktioner. For at øge nøjagtigheden af ​​denne forudsigelse, gener, der blev forudsagt af mindst fem af elleve databaser (Diana, microinspector, miranda, mirtarget2, mitarget, nbmirtar, pictar, pita, rna22, rnahybrid og Targetscan) blev udvalgt som formodede mål. Blandt disse formodede mål for MIR-425, afslørede gen ontologi analyse, at ekspressionsniveauerne af 9 kandidatgener blev ændret; således kan denne ændring bidrage til maligne fænotype. Brug af 3'UTR luciferase reporter assays, fandt vi, at overekspression af MIR-425 signifikant inhiberede luciferaseaktivitet i HEK293-celler og AGS celler, der udtrykker vildtype PTEN 3'UTR reporter (figur 2A). Vi bekræftede, at PTEN er et formodet direkte mål for miR-425. For at illustrere specificiteten af ​​MIR-425, viste vi, at anti-MIR-425 specifikt afskaffet inhibering af luciferaseaktivitet fremkaldt af MIR-425 i HEK293-celler og NCI-N87-celler (figur 2B). Mutationer i miRNA bindingssteder (figur 2C) afsmeltet konstruktionerne ikke reagerer på miR-425 induktion (figur 2D), hvilket yderligere bekræfter, at PTEN gen er et direkte mål for miR-425. Figur 2 miR-425 direkte rettet mod PTEN. (A) reporterassay i HEK293-celler og AGS celler transficeret med MIR-425 og, som bærer luciferase cDNA fusioneret til 3'UTR'er af forudsagte kandidat mål (gennemsnit ± SEM). (B) Virkningerne af anti-MIR-425 på luciferaseaktiviteten af ​​luciferase konstruktioner fusioneret med 3'UTR'er af PTEN i HEK293-celler og NCI-N87-celler (gennemsnit ± SEM). (C, D) reporterassay i HEK293-celler og AGS celler transficeret med luciferase-, som bærer PTEN 3'UTR'er med mutationer i MIR-425-bindingssteder (gennemsnit ± SEM). (E) HEK293-celler og AGS-celler blev transficeret med en luciferase-konstruktion, der bærer vildtype PTEN 3'UTR (LUC-WT) eller en konstruktion der bærer et muteret PTEN 3'UTR (LUC-Mut). Efter 24 timer blev cellerne behandlet med IL-1β, og luciferaseaktivitet blev kvantificeret 24 timer efter behandling. (F) Western blot og RT-PCR viser PTEN proteinniveauer og mRNA-niveauer i AGS celler efter 48 timers MIR-425 transfektion. (G) AGS celler blev transficeret med anti-MIR-425, og 24 timer senere blev cellerne enten ubehandlede eller behandlet med IL-1β og efterfølgende høstes 24 timer efter behandling. Hele cellelysater blev immunoblottedes med PTEN antistoffer. (H) NCI-N87-celler blev transficeret med anti-MIR-425 og høstet 24 timer efter behandling. Hele cellelysater blev immunoblottedes med PTEN antistoffer. (I) AGS celler blev transficeret med et plasmid, der bærer kun den åbne læseramme sekvens af PTEN (PTEN-CDS). Efter 24 timer blev cellerne behandlet med IL-1β eller MIR-425. Hele cellelysater blev underkastet immunoblotting efter 24 timers behandling. (* P < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001)
Endvidere mutation af MIR-425 målsekvensen også signifikant svækket IL-1β-induceret undertrykkelse af PTEN 3'UTR. luciferase reporter aktivitet i HEK293-celler og AGS celler (Figur 2E). Overekspression af MIR-425 var tilstrækkelig til at nedregulere PTEN ekspression på både proteinet og mRNA-niveauer i AGS-celler (figur 2F). Derfor blev IL-1β-induceret PTEN undertrykkelse reddet ved ekspression anti-MIR-425 i AGS celler (Figur 2G). Anti-MIR-425 var i stand til at opregulere PTEN ekspression i NCI-N87 celler uden IL-1β stimulation (Figur 2H).
Vore data også angivet, at 3'UTR er påkrævet for MIR-425-medieret PTEN nedregulering fordi ekspression af et PTEN kodende region konstrukt (PTEN-CDS) blev ufølsom over for mIR-425 overekspression og IL-1β induktion i AGS celler (Figur 2i). Taget sammen indikerer disse resultater, at MIR-425 spiller en kritisk rolle i at undertrykke PTEN ekspression ved at målrette dens 3'UTR upon IL-1β induktion.
IL-1β-induceret NF-kappaB aktivering kræves for MIR-425 induktion
for at bestemme den mekanisme er involveret i miR-425 transaktivering på IL-1β induktion undersøgte vi effekten af ​​forskellige kinase inhibitorer på miR-425 induktion i IL-1β-behandlede AGS celler. IL-1β-induceret MIR-425 opregulering blev signifikant inhiberet af IKK-inhibitoren TPCA-1, men ikke af p38 MAPK inhibitor BIX02188 eller JNK-inhibitoren SP600125 (figur 3A). Tidligere undersøgelser har vist, at IKK er en væsentlig kinase kræves til NF-kappaB signalering; derfor, dette resultat angives den kritiske rolle af NF-kappaB signalering i reguleringen af ​​miR-425 transskription på IL-1β induktion. Figur 3 IKK-aktivering er påkrævet for induktionen af ​​MIR-425 som respons på IL-1β-induktion. (A) AGS celler blev behandlet med IL-1β i nærværelse af IKK-inhibitoren TPCA-1, p38 MAPK inhibitor BIX02188 og JNK-inhibitor SP600125. Modent MIR-425-ekspression ved 12 timer efter behandling blev kvantificeret ved real-time PCR. Den fold ændring af relativ miR-425-ekspression (miR-425 /U6) blev normaliseret til den observeret i PBS-behandlede celler. (B) Ekspression af primære MIR-425 (PRI-MIR-425) blev analyseret ved real-time PCR som i A. (C) Ekspressionsniveauerne for NF-kappaB protein og PRI-MIR-425 blev analyseret ved real- time PCR i AGS celler behandlet med siRNA'er for NF-kappaB. (D) AGS-celler blev behandlet med kemi inhibitorer eller siRNA'er for NF-kappaB. Cellelysater blev opnået 24 timer efter IL-1β behandling og immunblottet med PTEN antistoffer. (E) Western blot-analyse af phosphoryleret NF-kappaB p65 (serin 536). (F) Ekspressionsniveauerne for NF-kappaB protein og PRI-MIR-425 blev analyseret ved realtids-PCR i NCI-N87 celler behandlet med siRNA'er for NF-kappaB. (* P < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001).
Konsekvent, induktion af PRI-MIR-425 upon IL-1β-behandling var bemærkelsesværdigt inhiberet i nærvær af IKK-inhibitoren eller siRNA'er for NF-kappaB (figur 3B og C). Vi observerede også, at IL-1β-induceret PTEN undertrykkelse var svækket i nærvær af IKK inhibitor eller siRNA'er for NF-kappaB (figur 3D). For at bestemme om NF-kappaB-aktivitet var til stede i AGS celler behandlet med IL-1β, anvendte vi en Western blot for at bestemme niveauet af phosphoryleret NF-kappaB p65 (serin 536). Niveauet af phosphoryleret NF-kappaB p65 (serin 536) var høj i AGS celler behandlet med IL-1 (10 ng /ml; 24 timer) (fig 3E). Desuden inaktivering af NF-kappaB inhiberede MIR-425-ekspression i NCI-N87 celler uden IL-1β-behandling (figur 3F). Disse resultater antyder, at IKK-afhængig NF-kappaB-aktivering ved IL-1β behandling er påkrævet for PTEN nedregulering, sandsynligvis via dens forøgelse af MIR-425 transkription.
At bestemme om NF-kappaB direkte regulerer MIR-425 transkription, vi analyserede opstrøms sekvenser af miR-425 ved hjælp af WeightMatrix biblioteket (matrixTFP60.lib) og identificeret tre potentielle NF-kappaB bindingssteder i promotorområdet af miR-425 (cut-offs: matrix lighed = 0,9 og core lighed = 0,95) ( Figur 4A). Vi udførte chromatin immunoprecipitation (chip) assays med AGS cancerceller anvendelse af monoklonale anti-NF-kappaB antistoffer. Som vist i figur 4B, kun primer-B i MIR-425 leveret betydningsfulde PCR-produkter, der tydede på, at NF-kappaB protein dannet komplekser med B bindingssted i MIR-425-promotoren. Resultaterne af luciferase reporter assays foreslået, at potentielle B-bindingsstedet i MIR-425-promotoren er nødvendig for transaktivering af den nedstrøms gen upon IL-1β induktion (figur 4A og C). Figur 4 NF-kappaB bindingssteder i miR-425 promotor. (A) Funktioner af MIR-425 5 'flankerende DNA. Humane promotorområder af miR-425 indeholder tre formodede bindingssteder for NF-kappaB. (B) chip assays med anti-NF-kappaB antistoffer viste binding af NF-kappaB til promotoren for miR-425 i AGS celler. De relative occupancies af NF-kappaB er angivet som lodrette streger. De søjlediagrammer viser gennemsnittet af tre uafhængige chip eksperimenter. (C) Promotoren af ​​MIR-425 blev aktiveret ved NF-kappaB. AGS-celler blev behandlet med NF-kappaB og transficeret med de angivne LUC vektorer.
Induktion af MIR-425 fremmer celleoverlevelse upon IL-1β induktion
Det blev vist, PTEN er blandt de hyppigst inaktiverede tumorsuppressorgener. Overekspression af PTEN i forskellige mammale vævskulturceller påvirker forskellige processer, herunder celleproliferation, celledød og cellemigrering [16]. Vi fandt også, at inhibering PTEN faldt aktiveringen af ​​caspase-3 i celler behandlet med IL-1β (figur 5A). Det er plausibelt, at MIR-425 induktion kan inhibere apoptose via nedregulering af PTEN i IL-1-behandlede celler. Faktisk overekspression af MIR-425 inhiberede caspase-3 aktivering i cisplatin-behandlede AGS celler (figur 5B). Desuden er der i cisplatin-behandlede AGS-celler, cotransfektion af en konstruktion indeholdende kun PTEN kodende region (PTEN-CDS), som er ufølsom overfor MIR-425, omgået den antiapoptotisk effekt af MIR-425 overekspression (figur 5C). Følgelig transfektion af anti-MIR-425 i AGS celler signifikant forøget caspase-3-aktivering og apoptose som respons på IL-1β-behandling (figur 5D). Desuden transfektion af anti-MIR-425 i NCI-N87 celler signifikant forøget caspase-3-aktivering og apoptose uden IL-1β stimulation (figur 5E). Figur 5 MIR-425 inhiberer celle apoptose ved at undertrykke PTEN. (EN). AGS-celler blev behandlet med kontrol (PBS) eller IL-1β. Efter 48 timer blev helcellelysater immunoblottedes. (B). AGS-celler blev transient transficeret med negativ kontrol (MIR-NC) eller MIR-425 alene. Efter 24 timer blev cellerne behandlet med cisplatin og høstet 24 timer efter behandling. Hele cellelysater blev immunoblottet. (C). AGS-celler blev transficeret med MIR-NC, MIR-425, og PTEN-CDS som angivet. Efter 24 timer blev cellerne behandlet med cisplatin og høstet 24 timer efter behandling. Celleapoptosen blev bestemt under anvendelse af flowcytometri metode. (D). AGS-celler blev transficeret med MIR-NC eller anti-MIR-425. Efter 48 timer blev cellerne behandlet med IL-1β og høstet 24 timer efter behandling. Totale cellelysater blev immunoblottedes med de angivne antistoffer og celleapoptosen blev bestemt under anvendelse af flowcytometri metode. (E) NCI-N87-celler blev transficeret med MIR-NC eller anti-MIR-425. Totale cellelysater blev immunoblottedes med de angivne antistoffer og celleapoptosen blev bestemt under anvendelse af flowcytometri metode.
Overensstemmelse med dets rolle i inhibering caspaseaktivering, opregulering af MIR-425 forbedres væsentligt AGS celleproliferation, hvorimod pro- overlevelse virkning blev helt blokeret ved co-transfektion med eksogen PTEN (PTEN-CDS) (figur 6A). Anti-MIR-425 faldt procentdelen af ​​prolifererende celler til NCI-N87-celler (figur 6B). Vi fandt også, at inhibering PTEN havde en beskyttende virkning svarende til den observeret i celler, der overudtrykker MIR-425 (figur 6C), hvilket antyder, at PTEN undertrykkelse kan spille en væsentlig rolle i MIR-425-afhængig beskyttelse i celler behandlet med IL-1β. Figur 6 MIR-425 fremmer celleproliferation ved at undertrykke PTEN. (A) AGS-celler blev behandlet med PBS, IL-1β, MIR-NC, MIR-425, og PTEN-CDS som angivet. Efter 72 timer blev celleproliferation bestemt ved anvendelse af edu mærkningskittet. (B) NCI-N87-celler blev transficeret med MIR-NC eller anti-MIR-425. Efter 72 timer blev celleproliferationen hastighed, der bestemmes ved anvendelse af edu mærkningskittet. (C) AGS celler blev behandlet med siRNA-PTEN eller MIR-425. Efter 72 timer blev celleproliferation bestemt ved anvendelse af edu mærkningskittet. (D) Fotografier af PTEN proteinekspression i tumorvæv (øverste paneler) og tumorer (lavere paneler). (E) Grafen viser vægten af ​​de 3 tumorer efter 4 uger (n = 3). observeres (F) En signifikant omvendt korrelation mellem MIR-425 og PTEN ekspressionsniveauer i de gastrisk cancer væv (n = 52). (G) Ekspressionsniveauerne for PTEN bestemmes i seks normale ventrikelslimhinder celler og gastriske cancer cellelinjer under anvendelse real-time PCR. (H) En model, der illustrerer de formodede roller IL-1β og MIR-425 i kontrollen af ​​PTEN vej hos humane gastriske carcinomceller.
Vi undersøgte virkningen af ​​MIR-425 på tumorigenicitet in vivo. Tumorerne behandlet med anti-MIR-425 viste øget niveauer af PTEN-protein (figur 6D). Også anti-MIR-425 reducerede tumorvægt af musene sammenlignet med MIR-NC-behandlede gruppe (figur 6E). Brug af ikke-parametriske tests, fandt vi en signifikant omvendt korrelation mellem PTEN mRNA og miR-425 udtryk i mavekræft prøver (figur 6F). Ekspressionsniveauerne af PTEN blev også bestemt i seks normale ventrikelslimhinder celler og gastriske cancer cellelinjer under anvendelse real-time PCR. Som vist af cellerne med "nedreguleret" MIR-425 har højere mængder af PTEN sammenlignet med cellelinjer med "opreguleret" MIR-425 niveauer (figur 6G). Som konklusion har vores resultater vist, at MIR-425 spiller en kausal rolle ved at målrette PTEN i gastriske cancere.
Diskussion
Interleukin-1 (IL-1) er en større pro-inflammatorisk cytokin, som produceres af maligne eller microenvironmental celler [17]. IL-1 fungerer også som en pleiotropisk cytokin involveret i tumorigenese og tumorindtrængen; derfor, det repræsenterer en realistisk kandidat til en modulerende cytokin, der kan vippe balancen mellem inflammation og immunitet mod induktion af antitumor svar [18]. IL-1α og IL-1β er de store agonister af IL-1. I deres udskilte former, IL-1a og IL-1β binder til de samme receptorer og inducere de samme biologiske funktioner [19]. Imidlertid IL-1α og IL-1β er forskellige i deres opdeling i cellen eller mikromiljøet [20]. IL-1β er kun aktiv i sin udskilt form og medierer inflammation, der fremmer carcinogenese, tumorindtrængen og immunosuppression [21]. Nogle nye anti-IL-1 midler er blevet anvendt i kliniske forsøg i patienter, der udviser forskellige sygdomme med inflammatoriske manifestationer [22]. En bedre forståelse af den integrerende rolle af IL-1β signalveje i den maligne proces vil muliggøre anvendelsen af ​​hidtil ukendte IL-1β modulation tilgange hos kræftpatienter.
PTEN blev opdaget som en vigtig tumorsuppressor, der ofte muteret eller tabt i forskellige kræftformer [23]. Flere linjer af beviser har fremhævet PTEN som lipid fosfatase, der hydrolyserer 3'fosfat i phosphoinositider [24]. PTEN kan også regulere aktiviteten af ​​serin /threonin-kinase AKT /PKB og kan således påvirke celleoverlevelse signalering [25]. UV-eksponering kan udløse PTEN interaktion med vildtype-melanocortin-1 receptor-varianter, som beskytter PTEN fra WWP2-medieret nedbrydning, hvilket fører til AKT inaktivering i melanom [26]. Der er flere mekanismer til regulering af PTEN, herunder transskription, mRNA stabilitet, microRNA målretning, oversættelse og protein stabilitet. PTEN er transkriptionelt tavse af promotor methylering i gastrisk karcinom [27]. PTEN kan også være posttranslationelt reguleret ved acetylering, ubiquitylering, oxidering, phosphorylering, og subcellulære lokalisering [28]. Trods omfattende karakterisering af PTEN mutationer i humane kræftformer og en forholdsvis god forståelse for de molekylære roller PTEN i kontrollen af ​​cellulære processer, er lidt om former for PTEN regulering.
PTEN kan hæmmes i kræftceller efter induktion af pro-inflammatoriske cytokin IL-1β [29]. Stimulering med IL-1β aktiverer NF-kappaB ved phosphorylering og nedbrydning af IKB. Denne aktivering tillader NF-kappaB til at translokere ind i kernen og transskriptionelt aktiverer målgener [30]. NF-kappaB er et heterodimert transskriptionsaktivator bestående af det DNA-bindende underenhed p50 og transaktivering underenhed p65 [31]. Høje niveauer af endogent NF-kappaB faldt ekspressionen af ​​PTEN, og PTEN ekspression kunne reddes ved specifik inhibering af NF-kappaB pathway [32]. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.
Forfattere 'originale indsendte filer til Images of Nedenfor er links til forfatternes oprindelige indsendte filer til billeder . Alle forfattere læst og godkendt den endelige manuskript.

• Indflydelse af IL17A polymorfier på afvigende methylering af DAPK og CDH1 i ikke-kræft gastrisk mucosa
• Usædvanlige trichobezoar i maven og tarmen: en sag report