NF-kB-dépendante régulation positive microARN-425 favorise la croissance des cellules du cancer de l'estomac, en ciblant PTEN à l'IL-1β induction

NF-kB-dépendante régulation positive microARN-425 favorise la croissance des cellules du cancer de l'estomac, en ciblant PTEN lors de l'induction de l'IL-1β
Résumé de la surexpression de cytokines pro-inflammatoires IL-1β est associée à diverses maladies, y compris le cancer. La modification de microARN a été observée dans les cellules cancéreuses exposées à des cytokines pro-inflammatoires, mais leur fonction dans le stress inflammatoire reste difficile à atteindre. Ici, nous montrons que l'IL-1β induit la surexpression de miR-425, qui régule négativement la phosphatase et de la tensine homolog expression en ciblant son extrémité 3 'UTR. Une augmentation de miR-425 dépend de l'IL-1β induite par l'activation de NF-kB, qui améliore miR-425 sur la transcription du gène IL-1β induction. En conséquence, la répression de la phosphatase et de la tensine homolog par miR-425 favorise la prolifération cellulaire du cancer de l'estomac, ce qui est nécessaire pour protéger les cellules contre l'apoptose induite par le cisplatine. Pris ensemble, nos données confirment un rôle essentiel pour la régulation positive NF-kB-dépendante de miR-425, ce qui représente une nouvelle voie pour la répression de la phosphatase et de la tensine homolog activation et la promotion de la survie des cellules lors de l'induction de l'IL-1β.
Mots-clés
IL-1β cancer Contexte NF-kappaB miR-425 PTEN gastrique
adénocarcinome gastrique est le quatrième et le cinquième cancer le plus fréquent chez les hommes et les femmes, respectivement, dans le monde entier et est fortement liée à l'inflammation chronique [1]. Il est maintenant bien accepté que l'infection par Helicobacter pylori
(H. pylori
) joue un rôle majeur dans le déclenchement de l'inflammation chronique conduisant à la malignité [2]. L'inflammation chronique de l'estomac initie la progression histopathologique de gastrite chronique à l'atrophie gastrique, métaplasie intestinale et le cancer gastrique enfin [3]. Bien que l'infection de H. pylori est extrêmement répandue, seule une petite minorité (environ 1%) des personnes infectées développeront un cancer gastrique après de nombreuses années. La variable de réponse à ce pathogène commun semble être régie par une prédisposition génétique à des niveaux de cytokines pro-inflammatoires [4].
Le facteur nucléaire kappa B (NF-kappa B) voie a longtemps été considérée comme une voie de signalisation proinflammatoire majeure haute expression, en grande partie en fonction de l'activation de NF-kB par des cytokines pro-inflammatoires, et le rôle du NF-kB dans l'activation de la transcription des gènes sensibles, y compris des cytokines et chimiokines [5]. La voie "canonique" pour l'activation de NF-kB est déclenchée par des cytokines pro-inflammatoires telles que l'IL-1β et conduit à l'activation des relations ou cRel complexes contenant habituellement [6]. NF-kappa B existe dans le cytoplasme sous une forme inactive associée à des protéines régulatrices appelées inhibiteurs de kB (IKB), dont le plus important peut-être IKBa, IκBβ et IκBε. IKBa est associée à transitoire activation de NF-kappa B, alors que IκBβ est impliqué dans l'activation soutenue [7]. Cependant, l'inflammation chronique est un processus physiologique complexe, et le rôle du NF-kB dans la réponse inflammatoire n'a pas encore été pleinement explorées.
En plus d'affecter l'expression du gène codant pour la protéine, le stress de l'inflammation modifie également le niveau de microARN d'expression (miARN) [8]. Les microARN sont une classe de endogène, petit, non codant des ARN qui régulent négativement l'expression des gènes au niveau post-transcriptionnel principalement via une liaison à la région 3 'non traduite d'un ARNm cible, et ils ont des fonctions réglementaires importantes dans le contrôle de la diversité physiologique et des processus pathologiques [9, 10]. Ces ARN ont été révélés être impliqués dans la régulation de nombreux processus cellulaires, y compris la prolifération, la différenciation et l'apoptose [11-13]. Cependant, si l'inflammation chronique régule l'expression des miARN en modulant la transcription du gène ou la modification de la maturation post-transcriptionnelle n'a pas été déterminée.
Dans ce travail, nous avons constaté que miR-425 induction sur l'inflammation IL-1β induite était dépendante de l'activation de NF-kB, qui a renforcé miR-425 transcription du gène. En outre, le miR-425 upregulated procédures
expérimentales
déclaration éthique directement visé phosphatase et TENsin homolog (PTEN) et régulée négativement son expression, qui a favorisé la survie des cellules lors de l'induction de l'IL-1β.
Tous les échantillons ont été obtenus à partir de les patients ayant subi une chirurgie à l'Université Fudan de Shanghai Cancer Center. Le protocole a été approuvé par le Comité d'éthique de la recherche clinique de l'Université Fudan, et de la recherche a été effectuée conformément aux dispositions de la Déclaration d'Helsinki de 1975. tissus normaux adjacents ont été excisés loin de la lésion de cancer gastrique macroscopiquement, et leur diagnostic histologique a été confirmée microscopiquement. Le consentement éclairé écrit a été obtenu à partir de tous les participants à l'étude.
culture cellulaire et réactifs
La embryonnaire lignée cellulaire rénale humaine HEK293 (ATCC® CRL-1573 ™), le sein humain lignée cellulaire du cancer MDA-MB361 (ATCC ® HTB-27 ™), l'estomac lignée cellulaire d'adénocarcinome humain AGS (ATCC® CRL-1739 ™), SNU-1 (ATCC® CRL-5971 ™), SNU-5 (ATCC® CRL-5973 ™), SNU-16 (ATCC® 5974 ™ CRL), Hs746T (ATCC® HTB-135 ™), NCI-N87 (ATCC® CRL-5822 ™), et KATO III (ATCC®HTB-103 ™) ont été maintenues dans DMEM contenant 10% foetal sérum bovin. Toutes les lignées cellulaires ont été maintenues dans des milieux contenant de la pénicilline (100 UI /ml) et de la streptomycine (100 mg /ml) à 37 ° C avec 5% de CO 2. Les miARN imite et anti-miARN ont été achetés chez Ambion (Austin, TX, USA). L'inhibiteur de IKK TPCA-1 (Cat. No. S2824), l'inhibiteur de la p38 MAPK BIX02188 (Cat. No. S1574) et l'inhibiteur de JNK SP600125 (Cat. No. S1460) ont été achetés chez Selleckchem (Houston, TX, USA). IL-1β humains recombinants ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich (Cat. No. H6291, Shanghai, Chine).
Extraction de l'ARN et en temps réel L'ARN total de PCR a été extrait des cellules en utilisant Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA ). Pour l'analyse par micro-ARN, poly (A) ont été ajoutés à la queue de l'ARN total en utilisant le poly (A) polymérase (Ambion, Carlsbad, CA) avant la transcription inverse. Le kit de détection MiRcute miRNA qPCR (TIANGEN, Beijing, Chine) a été utilisé pour quantifier les niveaux de maturité miR-425 expression selon le protocole fourni, et GAPDH a été utilisée comme contrôle interne. PCR en temps réel a été réalisée dans les conditions suivantes: 95 ° C 10 m, 1 cycle; 95 ° C 10 s, 55 ° C 34 s, 40 cycles.
Pour tous les résultats obtenus par des méthodes de PCR en temps réel, nous avons utilisé le delta delta méthode CT pour calculer le facteur de variation de l'expression génique entre les différents groupes. La quantité de cible (PTEN /miR-425), normalisée à la GAPDH de gène de ménage endogène et par rapport à un échantillon de référence, est donnée par l'équation suivante:. Quantité de target = 2 - △△ CT
immunotransfert
protéines ont été séparées sur un gel SDS-PAGE à 10% et ensuite transférés sur une membrane de PVDF. Après le blocage avec 5% de lait écrémé, la membrane a été incubée avec un anticorps monoclonal de souris anti-PTEN (1: 500, Santa Cruz, sc-7974) et un Phospho (pS536) (RELA) anticorps NF-kB p65 (1: 10000 #, Epitomics, Cat. 2220-1). IRDye-anticorps secondaires marqués ont été utilisés pour la quantification du signal de immunoblotting, et les signaux ont été analysées à l'aide d'un scanner Odyssey (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA).
Dosage luciférase
cellules HEK293 et ​​les cellules AGS étaient transfectée avec miR-425 et pGL3 reporter luciférase constructions abritant la séquence cible miR-425. Après 24 h, les activités de luciférase de luciole et la luciférase de Renilla dans les lysats cellulaires ont été mesurées avec le double Luciférase Assay System (Promega, Madison, WI, USA). Pour la transcription dosage de rapporteur de luciférase, miR-425 des séquences de promoteur de gène (WT ou un site suppression) ont été clones dans la région du promoteur du vecteur pGL3-Basic et l'activité luciférase a été mesurée comme décrit ci-dessus. Le plus Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)
brièvement, les cellules traitées ont été réticulé avec 1% de formaldéhyde, cisaillé à une taille moyenne de 400 bp, puis immunoprécipités avec des anticorps dirigés contre le NF-kappa B (Santa Cruz, sc-166588). Les amorces de PCR ont été ChIP conçues pour amplifier les régions de promoteur contenant des sites putatifs de liaison NF-kB au sein miR-425, comme illustré. Un anticorps de contrôle positif (ARN polymérase II) et un contrôle négatif IgG non immune ont été utilisés pour démontrer l'efficacité des réactifs du kit (Epigentek Group Inc, P-2025-48). ADN immunoprécipitée est ensuite nettoyé, libéré, et élue. ADN élué peut être utilisé pour les applications en aval ChIP-PCR. enrichissement de pliage (FE) est calculée en utilisant un rapport d'amplification de l'efficacité de l'échantillonnage de bribe par rapport à celle de l'IgG non immune. Efficacité de l'amplification de l'ARN polymérase II a été utilisé comme témoin positif. FE% = 2 (IgG CT - Extrait du CT). × 100% test
de prolifération cellulaire
Un essai de prolifération cellulaire a été réalisée en utilisant le comptage de cellules Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japon) en fonction de la les instructions du fabricant. Avant l'addition de la CCK-8, les cellules ont été lavées avec un milieu de culture chaud en faisant tourner la plaque à 500 tpm pendant 3 m, puis jeter le surnageant.
Dosage d'apoptose cellulaire
Les cellules cancéreuses ont été récoltées et remises en suspension dans 500 ul d'un tampon de liaison. La suspension cellulaire (100 ul) a été mis en incubation avec 5 ul de l'annexine V et l'iodure de propidium à la température ambiante pendant 20 minutes. Les cellules colorées ont été analysées avec la cellule activé par fluorescence (FACS) en utilisant un écoulement BD LSR II cytométrie. Analyse du cycle cellulaire
Pour l'analyse par cytométrie en flux, les cellules ont été trypsinisées et fixées dans 70% d'éthanol pendant une nuit. Les cellules ont ensuite été incubées dans 0,5 ml de solution d'iodure de propidium contenant 25 pg ml -1 RNase pendant 15 minutes à 37 ° C et mesurée.
Expériences souris
Les cellules NCI-N87 (3 × 10 6) ont été injectés dans les flancs droits des souris nu /nu athymiques. Une semaine après les injections, les souris ayant des tumeurs de taille comparable ont été traitées pendant 4 semaines avec des anti-miR-425. L'anti-miR-425 (2 nmol) ont été injectés directement dans les tumeurs deux fois par semaine pendant 4 semaines.
Analyse statistique
Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± SEM, et les données ont été analysées avec le test t de Student. Une valeur de p
< Résultats de 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.
traitement IL-1β induit miR-425 expression
Pour caractériser les miARN responsables de l'IL-1β induction, nous avons présenté l'expression de miARN dans les cellules AGS PBS-traitées et IL-1β les cellules AGS induites en utilisant le système Array Exiqon miRCURY ™ LNA (de v.14.0). Les niveaux d'ARNmi diffèrent considérablement entre le groupe traité par le PBS et au groupe IL-1β induite, comme illustré sur la carte de chaleur représenté sur la figure 1A. Parmi les sondes de capture 1.891, 46 miARN ont été exprimés de manière différentielle dans les cellules AGS 1'IL-lß induite par comparaison avec les cellules AGS PBS traitées par paires; de ces miARN, 29 ont été augmentés et 17 ont été réduites dans les cellules AGS IL-1ß-induite (tableau 1), indiquant qu'un motif de miRNA spécifique est associée à l'induction de l'IL-1β. Figure 1 dysrégulation des miARN dans les cellules AGS humains traités avec de l'IL-1β. (A) Les cellules AGS humaines ont été traitées avec l'IL-1β (10 ng /ml) [14], et 24 heures plus tard, le profil d'expression de miARN ont été analysées avec la technologie des puces à ADN. carte thermique diagramme généré par l'analyse de classification non supervisée avec 46 miARN significativement surexprimés. Le rouge indique une régulation positive; vert indique la régulation négative. (B) Augmentation des niveaux de miR-425 dans 36 échantillons de tumeurs par rapport à leurs niveaux dans les tissus normaux adjacents appariés telle que mesurée par PCR en temps réel. Normal: les tissus normaux adjacents. (C) niveau de miR-425 Expression a été examiné par PCR en temps réel dans plusieurs lignées cellulaires de cancer gastrique et six cellules de la muqueuse gastrique normale.
Tableau 1 dysrégulation significative des miARN
surexprimé dans les cellules induites par AGS IL-1
miRNA
Pliez la valeur
p de changement
hsa-miR-425
12,36
0.00
hsa-miR-584
11.03
0.01
hsa-miR-31
8.12
0.00
hsa-miR-155
6.22
0.00
hsa-let-7i
5.55
0.00
hsa-miR-21
5.11
0.00
hsa-miR-335
4.89
0.01
hsa-miR-191
4.73
0.03
hsa-miR-519d
4.37
0.02
hsa-miR-520d-5p
3,95
0.00
hsa-miR-331
3.67
0.01
hsa-miR-142
3.45
0.01
hsa-miR-518a-5p
3.28
0.01
hsa-miRPlus-F1231
3.11
0.01
hsa-miR-2113
2.94
0.02
hsa-miR-196a*
2.88
0.02
hsa-miR-1304
2.78
0.02
hsa-miR-185
2.65
0.01
hsa-let-7a
2.61
0.00
hsa-miR-130
2.52
0.02
hsa-miR-1280
2.50
0.01
hsa-miR-222
2.47
0.01
hsa-let-7c
2.43
0.00
hsa-miR-602
2.31
0.00
hsa-miR-548e
2.31
0.03
hsa-miR-32
2.27
0.04
hsa-miR-181a
2.24
0.02
hsa-miR-7
2.13
0.00
hsa-miR-21*
2.06
0.00
Fold changement de sous-exprimés
valeur p de miARN de l'IL-1ß cellules induite-AGS
hsa-miR-143
0.06
0.02
hsa-miR-200
0.08
0.01
hsa-miR-451
0.13
0.01
hsa-miR-144
0.17
0.00
hsa-miR-363
0.20
0.01
hsa-miR-637
0.25
0.03
hsa-miR-153
0.39
0.01
hsa-miR-139
0.39
0.00
hsa-miR-617
0.42
0.01
hsa-miR-1915
0.43
0.00
hsa-miRPlus-F1153
0.45
0.00
hsa-miR-381
0.46
0.00
hsa-miR-145
0.47
0.02
hsa-miR-659
0.47
0.03
hsa-miR-125b
0.48
0.00
hsa-miR-183*
0.49
0.00
hsa-miR-638
0.49
0.01
*: Lorsque deux miARN matures proviennent de bras opposés de la même pré-miARN, un astérisque après le nom indique un miARN exprimé à de faibles niveaux par rapport à la miARN dans le bras opposé d'une épingle à cheveux
Parmi ces miARN, Mir-. 425 a été le plus fortement régulée à la hausse lors de l'IL-1β induction. En utilisant en temps réel une analyse par PCR, nous avons analysé l'expression de miR-425 dans des échantillons appariés (36 tumeur et les tissus normaux adjacents à partir du même patient). Nous avons trouvé un niveau significativement plus élevé d'expression de miR-425 dans les échantillons de tumeurs par rapport aux niveaux dans les tissus normaux adjacents (p
< 0,0001) (figure 1B). Nous avons examiné le niveau d'expression de miR-425 dans un ensemble de lignées cellulaires de cancer gastrique et six cellules de la muqueuse gastrique normale. Comme le montre la figure 1C, nous avons ramassé les cellules AGS avec régulé à la baisse miR-425 et les cellules NCI-N87 avec un maximum régulé miR-425 pour une étude plus approfondie. Bien que l'activation de miR-425 a été rapporté pour avoir un impact fondamental sur l'initiation du cancer et à la progression des cellules cancéreuses, en réduisant l'expression d'un vaste réseau de gènes [15], le rôle de miR-425 dans les cancers humains n'a pas été élucidé . . Expression de Nous avons donc choisi miR-425 pour une enquête plus approfondie de PTEN est régulée négativement par miR-425
Pour identifier les cibles de miR-425, nous avons utilisé un algorithme couramment utilisé, miRecords (http: //mirecords . biolead. org /), qui est une ressource intégrée pour les interactions miARN cibles animales. Pour augmenter la précision de cette prédiction, les gènes qui ont été prédit par au moins cinq des bases de données de onze (Diana, microinspector, miranda, mirtarget2, mitarget, nbmirtar, pictar, pita, RNA22, rnahybrid et targetscan) ont été choisis comme cibles potentielles. Parmi ces cibles putatives de miR-425, l'analyse de l'ontologie de gène a révélé que les niveaux de 9 gènes candidats d'expression ont été modifiées; Ainsi, cette modification pourrait contribuer au phénotype malin. Utilisation de 3 'UTR essais luciférase rapporteurs, nous avons trouvé que la surexpression de miR-425 activité luciférase inhibé de manière significative dans les cellules HEK293 et ​​les cellules AGS exprimant le type sauvage PTEN 3' UTR reporter (figure 2A). Nous avons confirmé que PTEN est une cible directe putatif de miR-425. Pour illustrer la spécificité de miR-425, nous avons montré que l'anti-miR-425 a supprimé spécifiquement l'inhibition de l'activité de la luciférase induite par miR-425 dans des cellules HEK293 et ​​des cellules NCI-N87 (figure 2B). Des mutations dans les sites de liaison miARN (figure 2C) ont rendu les constructions qui ne répondent pas à miR-425 induction (figure 2D), confirmant en outre que le gène PTEN est une cible directe de miR-425. Figure 2 miR-425 vise directement PTEN. (A) un essai rapporteur dans des cellules HEK293 et ​​des cellules AGS transfectées avec miR-425 et des constructions portant l'ADNc de luciférase fusionné à l'extrémité 3 'UTR des cibles candidates prédites (moyenne ± SEM). (B) Les effets de l'anti-miR-425 sur l'activité de luciferase de constructions luciférase fusionné avec l'extrémité 3 'UTR de PTEN dans des cellules HEK293 et ​​des cellules NCI-N87 (moyenne ± SEM). (C, D), un essai rapporteur dans des cellules HEK293 et ​​des cellules AGS transfectées avec des constructions luciférase portant PTEN 3 'UTR des mutations dans les sites de miR-425 de liaison (moyenne ± SEM). (E) des cellules HEK293 et ​​des cellules AGS ont été transfectées avec une construction de luciférase de type sauvage portant le PTEN 3 'UTR (LUC-WT) ou une construction portant une mutation PTEN 3' UTR (LUC-Mut). Au bout de 24 h, les cellules ont été traitées avec l'IL-1β, et l'activité de luciférase a été quantifiée 24 heures après le traitement. (F) par transfert de Western et RT-PCR montrant les taux de protéine PTEN et les niveaux d'ARNm dans les cellules AGS après 48 h de miR-425 transfection. (G), les cellules AGS ont été transfectées avec des anticorps anti-miR-425, et 24 heures plus tard, les cellules ont été soit laissées non traitées ou traitées avec de l'IL-1β et ensuite récolté 24 h après le traitement. Des lysats de cellules entières ont été immunotransfert avec des anticorps de PTEN. cellules (H) NCI-N87 ont été transfectées avec anti-miR-425 et récoltées 24 h après le traitement. Des lysats de cellules entières ont été immunotransfert avec des anticorps de PTEN. (I) les cellules AGS ont été transfectées avec un plasmide portant uniquement la séquence de PTEN (PTEN-CDS) de cadre de lecture ouvert. Au bout de 24 h, les cellules ont été traitées avec l'IL-1β ou miR-425. Des lysats de cellules entières ont été soumises à un immunotransfert après 24 heures de traitement. (* P < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001): page En outre, une mutation de la séquence cible miR-425 a également significativement atténué l'IL-1β induite par la répression de la PTEN UTR 3 '. l'activité du rapporteur de la luciférase dans des cellules HEK293 et ​​des cellules AGS (figure 2E). La surexpression de miR-425 était suffisante pour réguler négativement l'expression de PTEN à la fois le taux d'ARNm dans les cellules AGS (Figure 2F) protéines et. En conséquence, l'IL-1β induite par la répression de PTEN a été sauvé en exprimant anti-miR-425 dans les cellules AGS (Figure 2G). Anti-miR-425 a été capable de réguler à la hausse l'expression de PTEN dans les cellules NCI-N87 sans stimulation IL-1β (Figure 2H).
Nos données indiquent également que la 3 'UTR est nécessaire pour miR-425 médiée par la régulation négative de PTEN parce que l'expression d'une région codante d'assemblage PTEN PTEN (CDS) est insensible à la surexpression de miR-425 et de l'induction de l'IL-1β dans les cellules AGS (figure 2I). Pris ensemble, ces résultats indiquent que miR-425 joue un rôle essentiel dans l'expression de PTEN refoulant en ciblant son extrémité 3 'UTR lors de l'induction de l'IL-1β.
IL-1β induite par l'activation de NF-kB est nécessaire pour l'induction de miR-425
Pour déterminer le mécanisme impliqué dans miR-425 transactivation lors de l'induction de l'iL-1β, nous avons examiné l'impact de divers inhibiteurs de kinases sur miR-425 induction dans les cellules AGS iL-1β-traités. IL-1β induite par miR-425 a été inhibée de manière significative la régulation positive de l'inhibiteur de IKK-1 TPCA mais non par l'inhibiteur p38 BIX02188 ou SP600125 inhibiteur de JNK (figure 3A). Des études antérieures ont démontré que IKK est une kinase essentielle requise pour la signalisation NF-kappa B; par conséquent, ce résultat indique le rôle critique de la signalisation NF-kB dans la régulation de miR-425 transcription sur l'IL-1β induction. La figure 3 activation IKK est nécessaire pour l'induction de miR-425 en réponse à l'IL-1β induction. (A) Les cellules AGS ont été traitées avec l'IL-1β, en présence de l'inhibiteur de IKK-1 TPCA, l'inhibiteur de la MAPK p38 BIX02188 et le SP600125 inhibiteur de JNK. expression Mature miR-425 à 12 h après le traitement a été quantifiée par PCR en temps réel. Le facteur de variation de miR-425 par rapport l'expression (miR-425 /U6) a été normalisée à celle observée dans les cellules traitées avec du STP. (B) L'expression de primaire miR-425 (pri-miR-425) a été analysé par PCR en temps réel comme dans A. (C) Les niveaux de la protéine NF-kappa B et pri-miR-425 ont été analysés par expression réel PCR en temps dans les cellules traitées avec AGS siRNA pour NF-kappaB. (D) les cellules AGS ont été traités avec des inhibiteurs de la chimie ou de siRNA pour NF-kappaB. Les lysats cellulaires ont été obtenus 24 heures après le traitement et l'IL-1β immunotransfert avec des anticorps de PTEN. (E) Analyse par transfert Western de phosphorylée p65 NF-kB (sérine 536). (F) Les niveaux de la protéine NF-kappa B et d'expression pri-miR-425 ont été analysés par PCR en temps réel dans les cellules NCI-N87 traités avec siRNA pour NF-kappaB. (* P < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001).
Systématiquement, l'induction de la pri-miR-425 lors d'un traitement d'IL-1β a été remarquablement inhibée en présence de l'inhibiteur de IKK ou ARNsi pour NF-kappa B (figure 3B et C). Nous avons également observé que l'IL-1β répression induite par PTEN a été atténuée en présence de l'inhibiteur de IKK ou ARNsi pour NF-kB (figure 3D). Pour déterminer si l'activité de NF-kappa B était présent dans les cellules AGS traités avec IL-1β, nous avons utilisé un western blot pour déterminer le niveau de phosphorylée p65 NF-kappa B (sérine 536). Le niveau de phosphorylation de p65 NF-kB (sérine 536) est élevée dans les cellules AGS traitées avec IL-1 ß (10 ng /ml, 24 heures) (figure 3E). En outre, le silençage de NF-kappa B a inhibé l'expression de miR-425 dans les cellules NCI-N87 sans traitement IL-1β (Figure 3F). Ces résultats suggèrent que le NF-kappaB activation de IKK-dépendant du traitement IL-1β est requis pour PTEN downregulation, probablement par sa mise en valeur de miR-425 transcription.
Pour déterminer si NF-kappa B régule directement miR-425 transcription, nous analysé les séquences en amont de miR-425 en utilisant la bibliothèque WeightMatrix (matrixTFP60.lib) et identifié trois sites potentiels NF-kappaB de liaison dans la région du promoteur de miR-425 (seuils: matrice similarité = 0,9 et de similarité de base = 0,95) ( La figure 4A). Nous avons effectué une immunoprécipitation de chromatine (ChIP), des dosages avec des cellules cancéreuses AGS utilisant des anticorps anti-NF-kappaB monoclonaux. Comme cela est représenté sur la figure 4B, seule amorce B de miR-425 a produit des produits de PCR solides, ce qui suggère que la protéine NF-kB formé des complexes avec le site de liaison B du promoteur miR-425. Les résultats des dosages de rapporteur de luciférase ont suggéré que le site de liaison B potentiel dans le promoteur miR-425 est nécessaire pour la transactivation du gène en aval lors de l'induction de l'IL-1β (figure 4A et C). Figure 4 sites de liaison NF-kappaB dans le promoteur miR-425. (A) Caractéristiques du miR-425 5 'ADN flanquant. régions promotrices humaines de miR-425 contiennent trois sites de liaison putatifs pour NF-kappaB. essais (B) ChIP avec les anticorps anti-NF-kB a montré la liaison de NF-kB du promoteur de miR-425 dans les cellules AGS. Les usages relatifs de NF-kappa B sont indiquées sous forme de barres verticales. Les graphiques à barres représentent les moyennes de trois expériences indépendantes ChIP. (C) Le promoteur de miR-425 a été activé par NF-kB. les cellules AGS ont été traitées avec NF-kB et transfectées avec les vecteurs indiqués GCU.
induction de miR-425 favorise la survie cellulaire lors de l'induction de l'IL-1β
Il a été montré que PTEN est parmi les gènes suppresseurs de tumeurs les plus fréquemment inactivé. La surexpression de PTEN dans différentes cellules de culture de tissus de mammifères affecte divers procédés, y compris la prolifération cellulaire, la mort cellulaire et la migration cellulaire [16]. Nous avons également constaté que l'inhibition de la PTEN a diminué l'activation de la caspase-3 dans les cellules traitées avec l'IL-1β (figure 5A). Il est plausible que miR-425 peut inhiber l'induction de l'apoptose par l'intermédiaire de la régulation négative de PTEN dans des cellules IL-1 ß-traités. En effet, la surexpression de miR-425 a inhibé l'activation de la caspase-3 dans les cellules AGS de cisplatine traitées (figure 5B). En outre, dans les cellules AGS de cisplatine traitée, la co-transfection d'une construction ne contenant que la région codante de PTEN PTEN (CDS), qui est insensible à miR-425, court-circuité l'effet anti-apoptotique de miR-425 surexpression (figure 5C). Par conséquent, la transfection d'anticorps anti-miR-425 dans les cellules AGS considérablement amélioré la caspase-3 activation et l'apoptose en réponse au traitement de l'IL-1β (figure 5D). En outre, la transfection de l'anti-miR-425 dans les cellules NCI-N87 considérablement améliorée caspase-3 activation et l'apoptose sans stimulation IL-1β (Figure 5E). Figure 5 miR-425 inhibe l'apoptose des cellules en refoulant PTEN. (UNE). les cellules AGS ont été traités avec le contrôle (PBS) ou l'IL-1β. Au bout de 48 h, des lysats de cellules entières ont été immunotransfert. (B). les cellules AGS ont été transitoirement transfectées avec contrôle négatif (miR-NC) ou miR-425 seul. Au bout de 24 h, les cellules ont été traitées avec du cisplatine et récoltées 24 h après le traitement. Des lysats de cellules entières ont été immunotransfert. (C). les cellules AGS ont été transfectées avec miR-NC, miR-425, et PTEN-CDS comme indiqué. Au bout de 24 h, les cellules ont été traitées avec du cisplatine et récoltées 24 h après le traitement. Le taux d'apoptose des cellules a été déterminée en utilisant la méthode de cytométrie en flux. (RÉ). les cellules AGS ont été transfectées avec miR-NC ou anti-miR-425. Au bout de 48 h, les cellules ont été traitées avec l'IL-1β et récoltées 24 h après le traitement. Lysats cellulaires totaux ont été immunotransfert avec les anticorps indiqués, et le taux d'apoptose des cellules a été déterminée en utilisant la méthode de cytométrie en flux. cellules (E) NCI-N87 ont été transfectées avec miR-NC ou anti-miR-425. Lysats cellulaires totaux ont été immunotransfert avec les anticorps indiqués, et le taux d'apoptose des cellules a été déterminée en utilisant la cytométrie en flux procédé.
Conformément à son rôle dans l'inhibition de l'activation des caspases, la régulation positive de miR-425 sensiblement améliorée AGS la prolifération cellulaire, tandis que la pro- l'effet de survie a été complètement bloquée par co-transfection avec PTEN exogène PTEN (CDS) (figure 6A). Anti-miR-425 a diminué le pourcentage de cellules en prolifération pour les cellules NCI-N87 (figure 6B). Nous avons également trouvé que l'inhibition de la PTEN a eu un effet protecteur similaire à celui observé dans les cellules surexprimant miR-425 (figure 6C), ce qui suggère que la répression PTEN peut jouer un rôle majeur dans miR-425 dépendant de protection dans les cellules traitées avec l'IL-1β. La figure 6 miR-425 favorise la prolifération cellulaire en réprimant PTEN. (A) les cellules AGS ont été traitées avec du PBS, IL-1β, miR-NC, miR-425, et PTEN-CDS comme indiqué. Après 72 h, la prolifération cellulaire a été déterminée en utilisant le kit de marquage edu. cellules (B) NCI-N87 ont été transfectées avec miR-NC ou anti-miR-425. Au bout de 72 h, le taux de prolifération des cellules a été déterminée en utilisant le kit de marquage edu. (C) les cellules AGS ont été traités avec le siRNA-PTEN ou miR-425. Après 72 h, la prolifération cellulaire a été déterminée en utilisant le kit de marquage edu. (D) Photographies de la protéine PTEN expression dans les tissus tumoraux (panneaux supérieurs) et des tumeurs (panneaux inférieurs). (E) Le graphique indique le poids des tumeurs 3 après 4 semaines (n = 3). (F) Une corrélation inverse significative est observée entre les niveaux d'expression de miR-425 et PTEN dans les tissus de cancer gastrique (n = 52). (G) Les niveaux de PTEN d'expression sont déterminés en six cellules de la muqueuse gastrique normale et des lignées cellulaires de cancer gastrique à l'aide de la PCR en temps réel. (H) un modèle illustrant le rôle présumé de l'IL-1β et miR-425 dans le contrôle de la voie PTEN dans des cellules de carcinome de l'estomac humain.
Nous avons étudié les effets de miR-425 sur la tumorigénicité in vivo. Les tumeurs traitées avec l'anti-miR-425 ont montré des niveaux de la protéine PTEN (figure 6D) augmente. En outre, l'anti-miR-425 a réduit le poids de la tumeur des souris par rapport au groupe miR-NC-traitées (figure 6E). À l'aide de tests non paramétriques, nous avons trouvé une corrélation inverse significative entre l'expression de l'ARNm de PTEN et miR-425 dans les échantillons de cancer de l'estomac (figure 6F). Les niveaux de PTEN d'expression ont également été déterminées en six cellules de la muqueuse gastrique normale et des lignées cellulaires de cancer gastrique à l'aide de la PCR en temps réel. Comme le montre, les cellules avec "down-régulée" miR-425 ont des quantités plus élevées de PTEN par rapport aux lignées cellulaires avec "up-régulés" miR-425 niveaux (Figure 6G). Rapport de En conclusion, nos résultats ont prouvé que miR-425 joue un rôle causal en ciblant PTEN dans les cancers gastriques.
interleukine-1 (IL-1) est une cytokine pro-inflammatoire majeure qui est produite par maligne ou cellules microenvironnement [17]. IL-1 fonctionne également comme une cytokine pléiotropique impliquée dans la tumorigenèse et la tumeur invasivité; Elle représente donc un candidat possible pour une cytokine modulatrice qui peut faire pencher la balance entre l'inflammation et l'immunité envers l'induction des réponses anti-tumorales [18]. IL-1α et IL-1β sont les principaux agonistes de l'IL-1. Dans leurs formes sécrétées, l'IL-1 a et d'IL-1β se lient aux mêmes récepteurs et induisent les mêmes fonctions biologiques [19]. Cependant, l'IL-1α et IL-1β diffèrent dans leur compartimentalisation dans la cellule ou le micro-environnement [20]. IL-1β est actif uniquement dans sa forme sécrétée et médie l'inflammation, ce qui favorise la carcinogenèse, l'invasivité de la tumeur et l'immunosuppression [21]. Certains agents anti-IL-1 ß nouveaux ont été utilisés dans des essais cliniques chez les patients présentant diverses maladies avec des manifestations inflammatoires [22]. Une meilleure compréhension du rôle intégrateur de l'IL-1β les voies de signalisation dans le processus malin permettra l'application de nouvelle modulation IL-1β approches chez les patients cancéreux.
PTEN a été découvert comme un suppresseur de tumeur importante qui est souvent muté ou perdu dans divers cancers [23]. Plusieurs sources de données ont mis en évidence PTEN comme une phosphatase lipidique qui hydrolyse le phosphate 3 'dans phosphoinositides [24]. PTEN peut également réguler l'activité de la sérine /thréonine kinase AKT /PKB et peut ainsi influencer la survie de la signalisation cellulaire [25]. l'exposition aux UV peut déclencher l'interaction PTEN avec mélanocortine-1 variantes des récepteurs de type sauvage, qui protège contre la dégradation PTEN WWP2 médiée, conduisant à AKT inactivation dans le mélanome [26]. Il existe plusieurs mécanismes pour la régulation de PTEN, y compris la transcription, la stabilité de l'ARNm, microRNA ciblage, la traduction et la stabilité des protéines. PTEN est transcriptionnelle réduit au silence par méthylation de promoteur dans le carcinome gastrique [27]. PTEN peut également être post-traductionnelle réglementé par acétylation, ubiquitylation, l'oxydation, la phosphorylation, et la localisation subcellulaire [28]. Malgré une caractérisation de mutations PTEN dans les cancers humains et une assez bonne compréhension des rôles moléculaires de PTEN dans le contrôle des processus cellulaires, on sait peu sur les modes de régulation PTEN.
PTEN peut être inhibée dans les cellules cancéreuses lors de l'induction de la cytokine pro-inflammatoire IL-1β [29]. La stimulation par IL-1β active NF-kappaB par la phosphorylation et la dégradation des IKB. Cette activation permet de NF-kappa B à translocation dans le noyau et activer la transcription des gènes cibles [30]. NF-kB est un activateur de transcription hétérodimère consistant en la liaison de la sous-unité p50 de l'ADN et de la sous-unité de transactivation de p65 [31]. Des niveaux élevés de endogène NF-kappa B a diminué l'expression de PTEN, et l'expression de PTEN pourraient être sauvés par inhibition spécifique de la voie NF-kappa B [32]. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit.
Auteurs fichiers originaux soumis pour les images
Voici les liens vers les auteurs originaux soumis fichiers pour les images . Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

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