NF-kappaB-abhängige MicroRNA-425 upregulation fördert Magenkrebs Zellwachstum durch PTEN-Targeting auf IL-1β Induktion

NF-kappaB-abhängige MicroRNA-425 upregulation fördert Magenkrebs Zellwachstum von PTEN auf IL-1β Induktion
Zusammenfassung
Überexpression des proinflammatorischen Zytokins IL-1β assoziiert ist mit diversen bedingte Krankheiten, einschließlich Krebs. Eine Veränderung von microRNAs hat in Krebszellen ausgesetzt proinflammatorischen Zytokinen, aber ihre Funktion bei der Entzündung Stress bleibt schwer zu beobachten. Hier zeigen wir, dass IL-1β die Aufregulation von miR-425 induziert, was sich negativ Phosphatase und tensin Homolog Expression reguliert von seinem 3'-UTR-Targeting. Eine Erhöhung der miR-425 ist abhängig von IL-1β-induzierte NF-kappaB-Aktivierung, die auf IL-1β Induktion miR-425 Gen-Transkription verbessert. Folglich fördert die Proliferation Magenkrebszellen Unterdrückung der Phosphatase und tensin Homolog von miR-425, die erforderlich ist, Zellen aus Cisplatin-induzierte Apoptose zu schützen. Zusammengenommen unterstützen unsere Daten eine entscheidende Rolle für die NF-kappaB-abhängige Hochregulation von miR-425, die für die Unterdrückung der Phosphatase und tensin Homolog Aktivierung und Förderung der das Überleben der Zellen auf IL-1β Induktion einen neuen Weg darstellt.
Schlüsselwörter IL-1β NF-kappaB miR-425 PTEN Magenkrebs hintergrund und Adenokarzinom des Magens ist die vierte und die fünfte am häufigsten auftretende Krebsart bei Männern und Frauen jeweils weltweit und ist stark an einer chronischen Entzündung verbunden [1]. Es ist jetzt gut, dass eine Infektion mit Helicobacter pylori akzeptiert
(H. pylori
) spielt eine wichtige Rolle, die zu malignen Erkrankungen chronische Entzündung bei der Auslösung [2]. Chronische Entzündung des Magen löst die histopathologische Progression der chronischen Gastritis magen Atrophie, intestinale Metaplasie und schließlich Magenkrebs [3]. Während H. pylori-Infektion
extrem weit verbreitet ist, nur eine kleine Minderheit (ca. 1%) der infizierten Personen wird Magenkrebs nach vielen Jahren zu entwickeln. Die variable Reaktion auf diesen gemeinsamen Erreger scheint durch eine genetische Veranlagung für hohe Expressionsniveaus von proinflammatorischen Zytokinen [4] geregelt werden.
Die nuclear factor kappa B (NF-kappaB) -Weg ist seit langem ein wichtiges entzündungsförderndes Signalweg betrachtet, weitgehend auf die Aktivierung von NF-kappaB durch proinflammatorische Zytokine und die Rolle von NF-kappaB in der transkriptionalen Aktivierung von responsiven Genen einschließlich Zytokinen und Chemokinen [5]. Die "canonical" Weg für NF-kappaB Aktivierung wird durch proinflammatorische Cytokine wie IL-1β ausgelöst und in der Regel führt zur Aktivierung von Beziehungen oder cRel haltige Komplexe [6]. NF-kappaB existiert im Zytoplasma in einer inaktiven Form, die mit regulatorischen Proteine ​​bezeichnet als Inhibitoren von &kgr; B (IkB), von denen der wichtigste IκBα, IκBβ und IκBε kann. IκBα mit transienten NF-kappaB-Aktivierung assoziiert, während IκBβ in nachhaltige Aktivierung beteiligt ist [7]. Allerdings ist eine chronische Entzündung ein komplexer physiologischer Prozess, und die Rolle von NF-kappaB in der Entzündungsreaktion wurde noch nicht vollständig erforscht.
Zusätzlich zu Protein-kodierenden Gen-Expression beeinflussen, Entzündungen Stress ändert sich auch die Expression von microRNAs (miRNAs) [8]. MicroRNAs sind eine Klasse von endogenem, kleine, nicht-kodierenden RNAs, die sich negativ auf die Genexpression auf der posttranskriptionellen Ebene regulieren hauptsächlich an das 3'-untranslatierten Region einer Ziel-mRNA durch Bindung, und sie haben wichtige regulatorische Funktionen bei der Steuerung der verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen [9, 10]. Diese RNAs wurden in der Regulation vieler zellulärer Vorgänge, einschließlich Proliferation, Differenzierung und Apoptose [11-13] beteiligt werden gezeigt. Unabhängig davon, ob eine chronische Entzündung miRNA-Expression Reifung durch Modulation der Gentranskription oder Veränderung posttranskriptionales reguliert wurde nicht bestimmt. In dieser Arbeit
fanden wir, dass miR-425 Induktion auf IL-1β-induzierte Entzündung auf die Aktivierung abhängig war von NF-kappaB, die miR-425 Gen-Transkription verstärkt. Darüber hinaus gezielt die upregulated miR-425 direkt Phosphatase und tensin homolog (PTEN) und negativ sein Ausdruck geregelt, die das Überleben der Zellen auf IL-1β Induktion gefördert.
Versuchsverfahren
Aussage Ethik
Alle Proben wurden erworben Patienten, die Operation an der Fudan-Universität Shanghai Cancer Center unterzog. Das Protokoll wurde von der Clinical Research Ethics Committee der Fudan-Universität genehmigt, und die Forschung wurde nach der Helsinki-Deklaration von 1975 angrenzenden normalen Gewebe der Bestimmungen durchgeführt weg makroskopisch vom Magenkrebs Läsion herausgeschnitten wurden, und ihre histologische Diagnose wurde bestätigt, mikroskopisch. Eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von allen Teilnehmern der Studie.
Zellkultur und Reagenzien
Die humane embryonale Nierenzelllinie HEK293 (ATCC® CRL-1573 ™), die menschliche Brustkrebs-Zelllinie MDA-MB361 (ATCC beteiligt erhalten ® HTB-27 ™), der menschliche Magen-Adenokarzinom-Zelllinie AGS (ATCC® CRL-1739 ™), SNU-1 (ATCC® CRL-5971 ™), SNU-5 (ATCC® CRL-5973 ™), SNU-16 (ATCC® CRL-5974 ™), Hs746T (ATCC® HTB-135 ™), NCI-N87 (ATCC® CRL-5822 ™) und KATO III (ATCC®HTB-103 ™) wurden in DMEM gehalten, das 10% fötales Rinderserum. Alle Zelllinien wurden in Medien, enthaltend Penicillin (100 IU /ml) und Streptomycin (100 mg /ml) bei 37 ° C mit 5% CO 2 gehalten. Die miRNA imitiert und anti-miRNA wurden von Ambion (Austin, TX, USA) erworben. Die IKK Inhibitor TPCA-1 (Kat. Nr S2824), der p38 MAPK-Inhibitor BIX02188 (Kat. Nr S1574) und der JNK-Inhibitor SP600125 (Kat. Nr S1460) wurden von Selleckchem (Houston, TX, USA) erworben. Rekombinante humane IL-1β wurden von Sigma-Aldrich bezogen (Kat. Nr H6291, Shanghai, China).
RNA-Extraktion und real-time PCR
Gesamt-RNA wurde aus den Zellen extrahiert TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA ). Für MikroRNA Analyse Poly (A) Schwänze wurden auf Gesamt-RNA unter Verwendung von Poly (A) polymerase (Ambion, Carlsbad, CA) vor hinzugefügt reversen Transkription. Die MiRcute miRNA qPCR-Nachweis-Kit (TIANGEN, Beijing, China) wurde verwendet, um die Expression von reifen miR-425 gemäß dem mitgelieferten Protokoll quantitativ zu bestimmen, und GAPDH wurde als interne Kontrolle verwendet. Echtzeit-PCR wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 95 ° C 10 m, 1 Zyklus; 95 ° C 10 s, 55 ° C 34 s, 40 Zyklen.
Für alle durch Echtzeit-PCR-Verfahren erhaltenen Ergebnisse verwendeten wir das Delta-Delta-CT-Verfahren die Falte Änderung in der Genexpression zwischen verschiedenen Gruppen zu berechnen. Die Menge des Target (PTEN /miR-425), normalisiert auf die endogene Housekeeping-Gen GAPDH und relativ zu einer Referenzprobe, die durch die folgende Gleichung gegeben:. Menge target = 2 - △△ CT
Immunoblotting
Die Proteine ​​wurden auf einem 10% SDS-PAGE-Gel aufgetrennt und anschließend auf eine PVDF-Membran übertragen. (500, Santa Cruz, sc-7974 1) und eine NF-kappaB p65 Phospho (pS536) (RELA) Antikörper (1: 10000 nach mit 5% fettfreier Milch blockiert wurde die Membran mit einem monoklonalen Maus-anti-PTEN-Antikörper ., Epitomics, Cat #: 2220-1). IRdye-markierten sekundären Antikörper wurden für die Quantifizierung des Immunoblotting-Signal verwendet, und die Signale wurden unter Verwendung eines Scanners Odyssey (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA) analysiert.
Luciferaseassay
HEK293-Zellen und Zellen wurden AGS transfiziert mit miR-425 und pGL3-Luciferase-Reporterkonstrukte, die miR-425 Zielsequenz beherbergen. Nach 24 h wurden die Aktivitäten von Glühwürmchen-Luciferase und Renilla-Luciferase in Zelllysaten mit dem Doppel-Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI, USA) gemessen. Für den Luciferase-Reporter-Transkriptionsassay, miR-425-Gen-Promotor-Sequenzen (WT oder Endele) in die Promotorregion des pGL3-Basic-Vektor kloniert, und die Luciferase-Aktivität wurde wie oben beschrieben gemessen.
Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)
kurz gesagt, behandelten Zellen wurden vernetzt mit 1% Formaldehyd, auf eine durchschnittliche Größe von 400 bp geschert und anschließend mit Antikörpern gegen NF-kappaB (Santa Cruz, sc-166.588) immunpräzipitiert. Der Chip-PCR-Primer wurden entworfen, um die Promotorregionen enthalten, mutmaßliche NF-kappaB-Bindungsstellen innerhalb miR-425 zu verstärken, wie dargestellt. Eine positive Kontrollantikörper (RNA-Polymerase II) und eine negative Kontrolle nicht-immune IgG wurden verwendet, um die Wirksamkeit der Kit Reagenzien (Epigentek Group Inc, P-2025-48) zu demonstrieren. Die immunpräzipitierten DNA wird dann gereinigt, freigegeben und eluiert. Eluierte DNA kann für Downstream-Anwendungen ChIP-PCR verwendet werden. Fache Anreicherung (FE) unter Verwendung eines Verhältnisses von Amplifikationseffizienz der ChIP Probe gegenüber derjenigen der nicht-immune IgG berechnet. Amplifikationseffizienz Polymerase RNA II wurde als positive Kontrolle verwendet. FE% = 2 (IgG CT - Probe CT). × 100%
Zellproliferationsassays
A-Zellproliferationstest wurde durchgeführt unter Verwendung der Zellzählung Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) nach dem Anweisungen des Herstellers. Vor der Zugabe von CCK-8, wurden die Zellen mit warmem Kulturmedium gewaschen, indem die Platte bei 500 rpm Zentrifugieren für 3 m und dann der Überstand verworfen.
Zell-Apoptose-Assay
Die Krebszellen wurden geerntet und resuspendiert in 500 ul einer Bindungspuffer. Die Zellsuspension (100 ul) wurde 20 Minuten mit 5 &mgr; l Annexin-V und Propidiumiodid bei Raumtemperatur inkubiert. Die gefärbten Zellen wurden analysiert mit fluoreszenzaktivierte Zell (FACS) unter Verwendung von BD LSR II Durchflusszytometrie.
Zellzyklusanalyse
für die Flusszytometrie-Analyse sortiert wird, wurden die Zellen mit Trypsin behandelt und über Nacht in 70% Ethanol fixiert. Die Zellen wurden dann in 0,5 ml Propidiumjodid-Lösung inkubiert, die 25 &mgr; g ml -1 RNase für 15 Minuten bei 37 ° C und gemessen.
Mausexperimenten, Die NCI-N87-Zellen (3 x 10 6) wurden in die rechten Flanken von athymischen nu /nu-Mäusen injiziert. Eine Woche nach den Injektionen, Mäuse mit vergleichbarer Größe Tumoren wurden 4 Wochen mit anti-miR-425 behandelt. Die Anti-miR-425 (2 nmol) wurden 4 Wochen direkt in die Tumoren zweimal wöchentlich injiziert.
Statistische Analyse
Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± SEM, und die Daten wurden mit dem Student-t-Test analysiert. Ein Wert von p
< 0,05 wurde als statistisch signifikant betrachtet.
Ergebnisse

• Einfluss von IL17A Polymorphismen auf die anomale Methylierung von DAPK und CDH1 in Nicht-Krebs Magen mucosa
• Ungewöhnliche Trichobezoar des Magens und des Darms: ein Fall report