NF-kappaB-dependiente de la regulación al alza de microARN-425 promueve el crecimiento de células de cáncer gástrico mediante la focalización de PTEN en la inducción de IL-1β

NF-kappaB-dependiente upregulation microARN-425 promueve el crecimiento de células de cáncer gástrico por la orientación PTEN a la inducción de IL-1β
Abstract
La sobreexpresión de la citoquina proinflamatoria IL-1β se asocia con diversas enfermedades, incluyendo el cáncer. La alteración de microRNAs se ha observado en células de cáncer expuestos a citoquinas proinflamatorias, sin embargo, su función en la inflamación estrés sigue siendo difícil de alcanzar. Aquí, se muestra que la IL-1β induce la regulación al alza de miR-425, que regula negativamente la fosfatasa y tensina expresión homólogo apuntando a su extremo 3 'UTR. Un aumento de miR-425 depende inducida por IL-1β la activación de NF-kappaB, que mejora miR-425 la transcripción de genes tras la inducción de IL-1β. En consecuencia, la represión de la fosfatasa y homólogo de tensina por miR-425 promueve la proliferación de células de cáncer gástrico, que se requiere para proteger las células de la apoptosis inducida por cisplatino. Tomados en conjunto, nuestros datos apoyan un papel fundamental para la regulación positiva de NF-kappaB dependientes de miR-425, lo que representa una nueva vía para la represión de la activación de la fosfatasa y homólogo de tensina y la promoción de la supervivencia celular después de la inducción de IL-1β.
Palabras clave hotels, IL-1β Antecedentes el cáncer de NF-kappaB miR-425 PTEN gástrico
adenocarcinoma gástrico es el cuarto y el quinto cáncer más común entre los hombres y mujeres, respectivamente, en todo el mundo y está fuertemente ligada a la inflamación crónica [1]. Ahora es bien aceptado que la infección con Helicobacter pylori
(H. pylori
) juega un papel importante en el desencadenamiento de la inflamación crónica que conduce a la malignidad [2]. La inflamación crónica del estómago inicia la progresión histopatológico de gastritis crónica a atrofia gástrica, metaplasia intestinal y cáncer gástrico finalmente [3]. Mientras que la infección por H. pylori
es muy frecuente, sólo una pequeña minoría (aproximadamente 1%) de las personas infectadas desarrollará cáncer gástrico después de muchos años. La variable respuesta a este patógeno común parece regirse por una predisposición genética a niveles elevados de expresión de citoquinas proinflamatorias [4]. Francia El factor nuclear kappa B (NF-kappaB) y la vía ha sido considerado como una importante vía de señalización proinflamatoria, en gran medida basado en la activación de NF-kappaB por citoquinas proinflamatorias y el papel de NF-kappaB en la activación transcripcional de genes de respuesta incluyendo citocinas y quimiocinas [5]. La vía "canonical" para la activación de NF-kappaB se activa por citocinas proinflamatorias tales como IL-1β y por lo general conduce a la activación de relaciones o complejos que contienen cRel [6]. NF-kappaB existe en el citoplasma en una forma inactiva asociado con proteínas reguladoras que se hace referencia como inhibidores de la kappa B (I? B), de los cuales el más importante puede ser I? B?, IκBβ, y IκBε. I? B? Se asocia con la activación de NF-kappaB transitoria, mientras que IκBβ está implicado en la activación sostenida [7]. Sin embargo, la inflamación crónica es un proceso fisiológico complejo, y el papel de NF-kappaB en la respuesta inflamatoria todavía no se ha explorado completamente.
Además de afectar la expresión del gen codificante de la proteína, el estrés inflamación también cambia el nivel de expresión de microRNAs (miRNAs) [8]. Los microARN son una clase de endógeno, pequeña, no codificante ARN que regulan negativamente la expresión génica a nivel post-transcripcional principalmente a través de la unión a la región no traducida 3 'de un ARNm diana, y tienen importantes funciones reguladoras en el control de diversas fisiológica y procesos patológicos [9, 10]. Estos ARN se han demostrado estar involucrados en la regulación de muchos procesos celulares incluyendo la proliferación, la diferenciación y la apoptosis [11 a 13]. Sin embargo, si la inflamación crónica regula la expresión de los genes miARN mediante la modulación de la transcripción de genes o la alteración de la maduración post-transcripcional no se ha determinado.
En este trabajo, hemos encontrado que el miR-425 inducción tras la inflamación inducida por IL-1β fue dependiente de la activación de NF-kappaB, lo que mejora el miR-425 transcripción de genes. Por otra parte, la upregulated miR-425 directamente dirigido fosfatasa y tensina homólogo (PTEN) y regulada negativamente su expresión, que promueve la supervivencia celular después de la inducción de IL-1β.
Procedimientos experimentales
comunicado Ética
Todas las muestras se obtuvieron a partir los pacientes que se sometieron a cirugía en la Universidad de Fudan Centro de cáncer de Shanghai. El protocolo fue aprobado por el Comité Ético de Investigación Clínica de la Universidad de Fudan, y la investigación se llevó a cabo de acuerdo con las disposiciones de la Declaración de Helsinki de 1975. Los tejidos normales adyacentes fueron extirpados lejos de la lesión cáncer gástrico macroscópicamente, y su diagnóstico histológico se confirmó microscópicamente. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los participantes involucrados en el estudio.
Cultivo de células y reactivos México La línea celular de riñón embrionario humano HEK293 (ATCC® CRL-1573 ™), la línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB361 (ATCC ® HTB-27 ™), el gástrico línea celular de adenocarcinoma humano AGS (ATCC® CRL-1739 ™), SNU-1 (ATCC® CRL-5971 ™), SNU-5 (ATCC® CRL-5973 ™), SNU-16 (ATCC® CRL- 5974 ™), Hs746T (ATCC® HTB-135 ™), NCI-N87 (ATCC® CRL-5822 ™), y KATO III (ATCC®HTB-103 ™) se mantuvieron en DMEM que contiene 10% fetal de suero bovino. Todas las líneas celulares se mantuvieron en medios que contienen penicilina (100 UI /ml) y estreptomicina (100 mg /ml) a 37 ° C con 5% de CO 2. Los miméticos de miARN y anti-miARN fueron adquiridos de Ambion (Austin, TX, EE.UU.). El inhibidor de IKK TPCA-1 (Cat. Nº S2824), el inhibidor de p38 MAPK BIX02188 (Cat. Nº S1574) y el inhibidor de JNK SP600125 (Cat. Nº S1460) fueron adquiridos de Selleckchem (Houston, TX, EE.UU.). IL-1β humanos se adquirieron de Sigma-Aldrich (Cat. No. H6291, Shanghai, China).
Extracción de RNA y PCR en tiempo real
ARN total fue extraído de las células utilizando TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA ). Para el análisis de microRNA, se añadieron colas de poli (A) de RNA total utilizando poli (A) polimerasa (Ambion, Carlsbad, CA) antes de la transcripción inversa. El kit de detección de MiRcute miRNA qPCR (Tiangen, Beijing, China) se utilizó para cuantificar los niveles de expresión de miR-425 madura de acuerdo con el protocolo proporcionado, y GAPDH se utilizó como control interno. PCR en tiempo real se realizó en las siguientes condiciones: 95 ° C 10 m, 1 ciclo; 95 ° C 10 s, 55ºC 34 s, 40 ciclos.
Para todos los resultados obtenidos por métodos de PCR en tiempo real, que utilizaron el método delta CT delta para calcular el factor de cambio en la expresión de genes entre diferentes grupos. La cantidad de diana (PTEN /miR-425), normalizado a la endógeno limpieza gen GAPDH y en relación con una muestra de referencia, viene dada por la siguiente ecuación:. Cantidad de target = 2 - △△ CT
inmunotransferencia
Las proteínas se separaron en un gel de SDS-PAGE 10% y posteriormente se transfirieron a una membrana PVDF. Después de bloquear con 5% de leche sin grasa, la membrana se incubó con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-PTEN (1: 500, Santa Cruz, sc-7974) y una fosfo anticuerpo NF-kappaB p65 (pS536) (RELA) (1: 10.000 ., Epitomics, Cat #: 2220-1). IRDye marcado con anticuerpos secundarios fueron utilizados para la cuantificación de la señal de inmunotransferencia, y las señales se analizaron mediante un escáner Odyssey (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, EE.UU.).
Ensayo de luciferasa
células HEK293 y células AGS eran transfectadas con el miR-425 y pGL3 reportero de luciferasa constructos contenía la secuencia diana de miR-425. Después de 24 h, las actividades de la luciferasa de luciérnaga y luciferasa de Renilla en los lisados ​​celulares se midieron con el sistema de doble ensayo de luciferasa (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Para el ensayo de reportero de luciferasa de la transcripción, miR-425 secuencias promotoras de genes (WT o deleción sitio) fueron clonados en la región promotora del vector pGL3-Basic, y se midió la actividad de luciferasa como se describe anteriormente.
De inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)
resumen, las células tratadas fueron reticulado con 1% de formaldehído, cortado a un tamaño medio de 400 pb, y, posteriormente, se inmunoprecipitaron con anticuerpos contra NF-kappaB (Santa Cruz, sc-166 588). Los cebadores ChIP-PCR fueron diseñados para amplificar las regiones promotoras que contienen sitios de unión de NF-kappaB putativos dentro de miR-425 como se ilustra. Un anticuerpo de control positivo (RNA polimerasa II) y un control negativo no inmune IgG se utilizaron para demostrar la eficacia de los reactivos del kit (Epigentek Group Inc, P-2025-48). a continuación, se limpia ADN inmunoprecipitado, puesto en libertad, y se eluyó. ADN eluido se puede utilizar para aplicaciones posteriores chip-PCR. enriquecimiento Fold (FE) se calculó mediante el uso de una relación de eficiencia de amplificación de la muestra de chip sobre la de no inmune IgG. la eficiencia de amplificación de la polimerasa de ARN II se utilizó como control positivo. FE% = 2 (IgG CT - CT muestra). × 100% Ensayo de proliferación celular
un ensayo de proliferación celular se realizó utilizando el Kit-8 Recuento celular (Dojindo, Kumamoto, Japón) de acuerdo con la Instrucciones del fabricante. Antes de la adición de CCK-8, las células se lavaron con medio de cultivo caliente haciendo girar la placa a 500 rpm durante 3 m y, a continuación desechar el sobrenadante. Ensayo de apoptosis de la célula
se recogieron y se resuspendieron en 500 Las células cancerosas l de un tampón de unión. La suspensión celular (100 l) se incubó con 5 l de anexina-V y yoduro de propidio a temperatura ambiente durante 20 minutos. Las células teñidas se analizaron con células activadas por fluorescencia (FACS) usando flujo BD LSR II citometría.
Análisis del ciclo celular
Para la citometría de flujo análisis, se tripsinizaron las células y se fijaron en 70% de etanol durante la noche. Las células fueron incubadas en 0,5 ml de solución de yoduro de propidio que contiene 25 mg ml -1 RNasa durante 15 minutos a 37 ° C y medido.
Experimentos con ratones
las células NCI-N87 (3 × 10 6) se inyectaron en los flancos derecho de ratones nu /nu atímicos. Una semana después de la inyección, los ratones con tumores de tamaño comparable se trataron durante 4 semanas con anti-miR-425. El anti-miR-425 (2 nmol) se inyecta directamente en los tumores dos veces por semana durante 4 semanas. El análisis estadístico

Los resultados se presentan como medias ± SEM, y los datos se analizaron con la prueba t de Student. Un valor de p Hotel < 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
tratamiento con IL-1β induce la expresión de miR-425
Para caracterizar los miRNAs responsables de la IL-1β inducción, perfilamos miARN expresión en células AGS tratados con PBS y IL-1β células AGS inducidas utilizando el Sistema de Arreglo Exiqon miRCURY ™ LNA (v.14.0). Los niveles de miARN diferían mucho entre el grupo tratado con PBS y el grupo inducida por IL-1β, como se ilustra en el mapa de calor se muestra en la Figura 1A. Entre los 1.891 sondas de captura, 46 miRNAs se expresan diferencialmente en células AGS IL-1 inducida por comparación con las células AGS tratados con PBS apareados; de estos miRNAs, 29 se incrementaron y 17 se redujo en las células AGS IL-1ß inducida (Tabla 1), lo que indica que un patrón miRNA específico está asociado con la inducción de IL-1β. Figura 1 La desregulación de miRNAs en células AGS humanos tratados con IL-1β. células (A) AGS humana fueron tratados con IL-1β (10 ng /ml) [14], y 24 h más tarde, el perfil miRNAs expresión se analizó con la tecnología de microarrays. diagrama de mapa de calor generada por el análisis de agrupamiento no supervisado con 46 miRNAs disregulados significativamente. El color rojo indica la regulación al alza; verde indica regulación a la baja. (B) Aumento de los niveles de miR-425 en 36 muestras de tumores en relación con sus niveles en los tejidos normales adyacentes emparejados según lo determinado por PCR en tiempo real. Normales: los tejidos normales adyacentes. (C) El nivel de expresión de miR-425 se examinó mediante PCR en tiempo real en múltiples líneas celulares de cáncer gástrico y seis células de la mucosa gástrica normal.
Tabla 1 desregulación significativa de miRNAs
sobreexpresa en IL-1ß células inducida por AGS
miARN
doble cambio
valor
p
HSA-miR-425
12.36 0.00

hsa-miR-584
11.03
0.01
hsa-miR-31
8.12
0.00
hsa-miR-155
6.22
0.00
hsa-let-7i
5.55
0.00
hsa-miR-21
5.11
0.00
hsa-miR-335
4.89
0.01
hsa-miR-191
4.73
0.03
hsa-miR-519d
4.37
0.02
hsa-miR-520d-5p
3,95
0.00
hsa-miR-331
3.67
0.01
hsa-miR-142
3.45
0.01
hsa-miR-518a-5p
3.28
0.01
hsa-miRPlus-F1231
3.11
0.01
hsa-miR-2113
2.94
0.02
hsa-miR-196a*
2.88
0.02
hsa-miR-1304
2.78
0.02
hsa-miR-185
2.65
0.01
hsa-let-7a
2.61
0.00
hsa-miR-130
2.52
0.02
hsa-miR-1280
2.50
0.01
hsa-miR-222
2.47
0.01
hsa-let-7c
2.43
0.00
hsa-miR-602
2.31
0.00
hsa-miR-548e
2.31
0.03
hsa-miR-32
2.27
0.04
hsa-miR-181a
2.24
0.02
hsa-miR-7
2.13
0.00
hsa-miR-21*
2.06
0.00
Underexpressed de IL-1 inducida por las células AGS
miARN
valor de p cambio
Fold
hsa-miR-143
0.06
0.02
hsa-miR-200
0.08
0.01
hsa-miR-451
0.13
0.01
hsa-miR-144
0.17
0.00
hsa-miR-363
0.20
0.01
hsa-miR-637
0.25
0.03
hsa-miR-153
0.39
0.01
hsa-miR-139
0.39
0.00
hsa-miR-617
0.42
0.01
hsa-miR-1915
0.43
0.00
hsa-miRPlus-F1153
0.45
0.00
hsa-miR-381
0.46
0.00
hsa-miR-145
0.47
0.02
hsa-miR-659
0.47
0.03
hsa-miR-125b
0.48
0.00
hsa-miR-183*
0.49
0.00
hsa-miR-638
0.49
0.01
*: Cuando dos miRNAs maduros se originan en los brazos opuestos de la misma pre-miARN, un asterisco después del nombre indica un miARN expresa en niveles bajos en relación con el miARN en el brazo opuesto de una horquilla Estar entre estos miRNAs, miR. 425 fue el más altamente regulados positivamente a la inducción de IL-1β. El uso de análisis en tiempo real PCR, analizamos la expresión de miR-425 en 36 muestras pareadas (tumor y los tejidos normales adyacentes del mismo paciente). Encontramos un nivel significativamente mayor de expresión de miR-425 en las muestras tumorales con respecto a los niveles en los tejidos normales adyacentes (p
< 0,0001) (Figura 1B). Se examinó el nivel de expresión de miR-425 en un conjunto de líneas celulares de cáncer gástrico y seis células de mucosa gástrica normal. Como se muestra en la Figura 1C, recogimos las células AGS con regulado por las células NCI-N87 con hasta reguladas miR-425 para el estudio adicional de miR-425 y. Aunque la activación de miR-425 se ha informado que tienen un impacto fundamental en la iniciación y progresión del cáncer de las células cancerosas mediante la reducción de la expresión de una amplia red de genes [15], el papel de miR-425 en los cánceres humanos no se ha dilucidado . . Por lo tanto, elegimos el miR-425 para una mayor investigación
expresión de PTEN está regulada negativamente por el miR-425
Para identificar los objetivos de miR-425, se empleó un algoritmo de uso general, miRecords (http: //mirecords . biolead. org /), que es un recurso integrado para animales interacciones miARN objetivo. Para aumentar la precisión de esta predicción, los genes que se predijo por al menos cinco de las bases de datos once (Diana, microinspector, miranda, mirtarget2, mitarget, nbmirtar, PicTar, pita, rna22, RNAhybrid y TargetScan) fueron seleccionados como posibles dianas. Entre estos supuestos objetivos de miR-425, el análisis de genes ontología reveló que fueron alterados los niveles de expresión de genes candidatos 9; Por lo tanto, esta alteración puede contribuir al fenotipo maligno. Usando 3 'UTR ensayos de reportero de la luciferasa, se encontró que la sobreexpresión de miR-425, inhibió la actividad de la luciferasa en células HEK293 y células AGS que expresan el tipo salvaje PTEN 3' UTR reportero (Figura 2A). Se confirmó que PTEN es un objetivo directo putativa de miR-425. Para ilustrar la especificidad de miR-425, puso de manifiesto que el anti-miR-425 abolida específicamente la inhibición de la actividad de la luciferasa inducida por el miR-425 en células HEK293 y células NCI-N87 (Figura 2B). Las mutaciones en los genes miARN sitios de unión (Figura 2C), hace que las construcciones que no responden a la inducción de miR-425 (Figura 2D), lo que confirma, además, que el gen PTEN es un objetivo directo de miR-425. Figura 2 miR-425 se dirige directamente a PTEN. (A) ensayo de indicador en células HEK293 y células AGS transfectadas con miR-425 y constructos que lleva el ADNc de luciferasa fusionado a los 3 'UTRs de los objetivos candidatos predichos (media ± SEM). (B) Efectos de la anti-miR-425 en la actividad luciferasa de construcciones de luciferasa fusionados con los 3 'UTRs de PTEN en células HEK293 y células NCI-N87 (media ± SEM). (C, D) ensayo de informador en células HEK293 y células AGS transfectadas con construcciones de luciferasa que llevan PTEN 3 'UTRs con mutaciones en los sitios de miR-425-unión (media ± SEM). (E) y células HEK293 células AGS se transfectaron con una construcción de luciferasa que lleva el PTEN salvaje tipo 3 'UTR (LUC-WT) o una construcción que lleva un PTEN mutado 3' UTR (LUC-Mut). Después de 24 h, las células fueron tratadas con IL-1β, y la actividad de luciferasa se cuantificó 24 h después del tratamiento. (F) Western blot y RT-PCR que muestra los niveles de proteína PTEN y los niveles de ARNm en las células AGS después de 48 h de miR-425 de la transfección. (G) células AGS se transfectaron con anti-miR-425, y 24 h después, las células se dejaron sin tratar o tratados con IL-1β y posteriormente cosecharon 24 h después del tratamiento. lisados ​​de células enteras se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos PTEN. células (H) NCI-N87 fueron transfectadas con anti-miR-425 y se recogieron 24 h después del tratamiento. lisados ​​de células enteras se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos PTEN. (I) células AGS se transfectaron con un plásmido que lleva sólo la secuencia marco de lectura abierto de PTEN (PTEN-CDS). Después de 24 h, las células fueron tratadas con IL-1β o miR-425. Lisados ​​de células enteras se sometieron a inmunotransferencia después de 24 h de tratamiento. (* P < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001): perfil Además, la mutación de la secuencia diana miR-425 también significativamente atenuada IL-1β inducida por la represión de la UTR PTEN 3 '. la actividad de luciferasa en células HEK293 y células AGS (Figura 2E). La sobreexpresión de miR-425 era suficiente para regular a la baja la expresión de PTEN en tanto la proteína y los niveles de mRNA en células AGS (Figura 2F). En consecuencia, inducida por IL-1β represión PTEN fue rescatado mediante la expresión de anti-miR-425 en células AGS (Figura 2G). Anti-miR-425 fue capaz de un máximo de regular la expresión de PTEN en las células NCI-N87 sin estimulación de IL-1β (Figura 2H).
Nuestros datos también indican que el 3 'UTR es necesaria para la regulación negativa mediada PTEN-miR-425 porque la expresión de un constructo de codificación región PTEN (PTEN-CDS) fue insensible a la sobreexpresión de miR-425 y la inducción de IL-1β en las células AGS (Figura 2I). Tomados en conjunto, estos resultados indican que miR-425 juega un papel crítico en la represión de la expresión de PTEN por la orientación de su 3 'UTR a la inducción de IL-1β. Se requiere inducida por IL-1β
la activación de NF-kappaB para miR-425 de inducción
Para determinar el mecanismo involucrado en el miR-425 transactivación tras la inducción de IL-1β, se analizó el impacto de varios inhibidores de la quinasa de miR-425 en la inducción de células AGS tratados con IL-1β. IL-1β inducida miR-425 upregulation fue significativamente inhibido por el inhibidor de IKK TPCA-1 pero no por el inhibidor de p38 MAPK BIX02188 o la SP600125 inhibidor de JNK (Figura 3A). Estudios anteriores han demostrado que IKK es una quinasa esencial requerido para la señalización de NF-kappaB; Por lo tanto, este resultado indica el papel crítico de la señalización de NF-kappaB en la regulación de la transcripción de miR-425 en la inducción de IL-1β. Se requiere la Figura 3 activación IKK para la inducción de miR-425 en respuesta a la inducción de IL-1β. células AGS (A) fueron tratados con IL-1β en presencia del inhibidor de IKK TPCA-1, el inhibidor p38 MAPK BIX02188 y la SP600125 inhibidor de JNK. expresión madura de miR-425 a las 12 h después del tratamiento se cuantificó por PCR en tiempo real. El factor de cambio de la relación de expresión de miR-425 (miR-425 /U6) se normalizó a la observada en las células tratadas con PBS. (B) La expresión de miR-425 primaria (pri-miR-425) se analizó por PCR en tiempo real como en A. (C) Los niveles de expresión de la proteína NF-kappaB y pri-MIR-425 se analizaron mediante real PCR en tiempo en las células AGS tratadas con siRNAs para NF-kappaB. (D) células AGS fueron tratados con inhibidores de la química o de los siRNA para NF-kappaB. Los lisados ​​celulares se obtuvieron 24 h después de IL-1β tratamiento y a inmunotransferencia con anticuerpos PTEN. (E) Análisis de transferencia Western de fosforilados p65 NF-kappaB (serina 536). (F) Los niveles de expresión de la proteína NF-kappaB y pri-miR-425 se analizaron por PCR en tiempo real en las células NCI-N87 tratadas con siRNAs para NF-kappaB. (* P < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001).
Consistentemente, la inducción de la pri-miR-425 en el tratamiento de IL-1β fue notablemente inhibida en presencia del inhibidor de IKK o siRNAs para NF-kappaB (Figura 3B y C). También se observó que la inducida por IL-1β represión PTEN se atenuó en presencia del inhibidor de IKK o siRNAs para NF-kappaB (Figura 3D). Para determinar si la actividad de NF-kappaB estaba presente en las células AGS tratados con IL-1β, se utilizó un Western blot para determinar el nivel de fosforilados p65 NF-kappaB (serina 536). El nivel de fosforilados p65 NF-kappaB (serina 536) fue alta en las células AGS tratados con IL-1ß (10 ng /ml; 24 horas) (Figura 3E). Además, el silenciamiento de NF-kappaB inhibe la expresión de miR-425 en células NCI-N87 y sin tratamiento con IL-1β (Figura 3F). Se requiere Estos resultados sugieren que IKK-dependiente de la activación de NF-kappaB en el tratamiento con IL-1β de PTEN regulación a la baja, muy probablemente a través de su mejora de miR-425 de la transcripción.
Para determinar si NF-kappaB regula directamente el miR-425 de la transcripción, que analizaron las secuencias de aguas arriba de miR-425 utilizando la biblioteca WeightMatrix (matrixTFP60.lib) e identificó tres posibles sitios de unión a NF-kappaB en la región promotora de miR-425 (cut-off: matriz de similitud = 0,9 y similitud núcleo = 0,95) ( Figura 4A). Se realizó la inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP) ensayos con células de cáncer AGS utilizando anticuerpos anti-NF-kappaB monoclonales. Como se muestra en la Figura 4B, sólo el cebador-B de miR-425 produce productos de PCR fuertes, lo que sugiere que la proteína NF-kappaB complejos formados con el sitio de unión B en el promotor de miR-425. Los resultados de los ensayos de reportero de luciferasa sugirieron que se requiere que el sitio de unión B potencial en el promotor de miR-425 para la transactivación del gen aguas abajo después de la inducción de IL-1β (Figura 4A y C). Figura 4 sitios de unión de NF-kappaB en el promotor de miR-425. (A) Características del miR-425 de ADN que flanquean 5 '. regiones promotoras humanos de miR-425 contienen tres supuestos sitios de unión de NF-kappaB. ensayos (B) chip con anticuerpos anti-NF-kappaB mostraron unión de NF-kappaB al promotor de miR-425 en células AGS. Las ocupaciones relativas de NF-kappaB se indican como barras verticales. Los gráficos de barras representan la media de tres experimentos independientes chip. (C) El promotor de miR-425 fue activado por NF-kappaB. células AGS se trataron con NF-kappaB y se transfectaron con los vectores de LUC indicados.
Inducción de miR-425 promueve la supervivencia celular después de la inducción de IL-1β
Se demostró que PTEN se encuentra entre los genes supresores de tumores más frecuentemente inactivadas. La sobreexpresión de PTEN en diferentes células de cultivo de tejidos de mamíferos afecta varios procesos incluyendo la proliferación celular, la muerte celular y la migración celular [16]. También se encontró que la inhibición de PTEN disminuyó la activación de caspasa-3 en células tratadas con IL-1β (Figura 5A). Es plausible que la inducción miR-425 puede inhibir la apoptosis a través de la regulación a la baja de PTEN en las células IL-1ß-tratada. En efecto, la sobreexpresión de miR-425 inhibe la activación de la caspasa-3 en células AGS tratados con cisplatino (Figura 5B). Por otra parte, en las células AGS tratados con cisplatino, la cotransfección de una construcción que contiene sólo la región de codificación de PTEN (PTEN-CDS), que es insensible a miR-425, pasa por alto el efecto antiapoptótico de miR-425 sobreexpresión (Figura 5C). De acuerdo con ello, la transfección de anti-miR-425 en células AGS mejora significativamente la activación de caspasa-3 y la apoptosis en respuesta al tratamiento IL-1β (Figura 5D). Además, la transfección de anti-miR-425 en células NCI-N87 mejora significativamente la activación de caspasa-3 y la apoptosis sin estimulación IL-1β (Figura 5E). Figura 5 miR-425 inhibe la apoptosis de las células mediante la represión de PTEN. (UN). células AGS fueron tratados con control (PBS) o IL-1β. Después de 48 h, se inmunotransfirieron los lisados ​​de células enteras. (SEGUNDO). células AGS se transfectaron transitoriamente con el control negativo (miR-NC) o miR-425 solo. Después de 24 h, las células se trataron con cisplatino y se recogieron 24 h después del tratamiento. Se immunoblotted lisados ​​de células enteras. (DO). células AGS se transfectaron con el miR-NC, miR-425, y PTEN-CDS como se indica. Después de 24 h, las células se trataron con cisplatino y se recogieron 24 h después del tratamiento. La tasa de apoptosis de las células se determinó usando el método de citometría de flujo. (RE). células AGS se transfectaron con el miR-NC o anti-miR-425. Después de 48 h, las células fueron tratadas con IL-1β y se recogieron 24 h después del tratamiento. Total de lisados ​​celulares se inmunotransfirieron con los anticuerpos indicados, y la tasa de apoptosis de las células se determinó usando el método de citometría de flujo. células (E) del NCI-N87 fueron transfectadas con el miR-NC o anti-miR-425. Total de lisados ​​celulares se inmunotransfirieron con los anticuerpos indicados, y la tasa de apoptosis de las células se determinó usando el método de citometría de flujo.
De acuerdo con su papel en la inhibición de la activación de caspasas, la regulación positiva de miR-425 mejorado sustancialmente la proliferación de células AGS, mientras que el pro- efecto de supervivencia fue completamente bloqueado por co-transfección con PTEN exógeno (PTEN-CDS) (Figura 6A). Anti-miR-425 disminuyó el porcentaje de células en proliferación de las células NCI-N87 (Figura 6B). También se encontró que la inhibición de PTEN tuvo un efecto protector similar a la observada en células que sobreexpresan miR-425 (Figura 6C), lo que sugiere que la represión PTEN puede jugar un papel importante en la protección dependiente de miR-425 en células tratadas con IL-1β. Figura 6 miR-425 promueve la proliferación celular mediante la represión de PTEN. (A) células AGS fueron tratados con PBS, IL-1β, miR-NC, miR-425, y PTEN-CDS como se indica. Después de 72 h, la proliferación celular se determinó usando el kit de marcaje de edu. células (B) NCI-N87 fueron transfectadas con el miR-NC o anti-miR-425. Después de 72 h, la tasa de proliferación celular se determinó usando el kit de marcaje de edu. (C) células AGS fueron tratados con siRNA-PTEN o miR-425. Después de 72 h, la proliferación celular se determinó usando el kit de marcaje de edu. (D) Fotografías de expresión de la proteína PTEN en los tejidos tumorales (paneles superiores) y tumores (paneles inferiores). (E) El gráfico muestra el peso de los 3 tumores después de 4 semanas (n = 3). Se observa (F) una correlación inversa significativa entre los niveles de expresión de miR-425 y PTEN en los tejidos de cáncer gástrico (n = 52). (G) Los niveles de expresión de PTEN se determinan en seis células normales de la mucosa gástrica y líneas celulares de cáncer gástrico utilizando PCR en tiempo real. (H) Un modelo que ilustra las funciones putativas de IL-1β y miR-425 en el control de la vía de PTEN en células de carcinoma gástrico humano.
Investigamos el efecto de miR-425 en la tumorigenicidad in vivo. Los tumores tratados con anti-miR-425 mostraron niveles de la proteína PTEN (Figura 6D) aumentaron. Además, anti-miR-425 redujo el peso del tumor de los ratones en comparación con el grupo tratado con miR-NC (Figura 6E). El uso de pruebas no paramétricas, se encontró una correlación inversa significativa entre PTEN ARNm y la expresión de miR-425 en las muestras de cáncer gástrico (Figura 6F). Los niveles de expresión de PTEN se determinaron también en seis células normales de la mucosa gástrica y líneas celulares de cáncer gástrico utilizando PCR en tiempo real. Como se muestra, las células con "las reguladas" miR-425 tienen una mayor cantidad de PTEN en comparación con las líneas celulares con "up-regulados" miR-425 niveles (Figura 6G). En conclusión, nuestros resultados han demostrado que miR-425 juega un papel causal a través de la orientación PTEN en los cánceres gástricos.
Discusión
interleucina-1 (IL-1) es una citoquina pro-inflamatoria importante que se produce por o maligno microambientales células [17]. IL-1 también funciona como una citoquina pleiotrópica implicada en la tumorigénesis y el tumor invasivo; por lo tanto, representa un candidato viable para una citoquina modulador que puede inclinar el equilibrio entre la inflamación y la inmunidad hacia la inducción de respuestas antitumorales [18]. IL-1α e IL-1β son los principales agonistas de IL-1. En sus formas secretadas, IL-1a y IL-1β se unen a los mismos receptores e inducir las mismas funciones biológicas [19]. Sin embargo, IL-1α e IL-1β difieren en su compartimentación dentro de la célula o el microambiente [20]. IL-1β sólo está activo en su forma secretada y mediador de la inflamación, que promueve la carcinogénesis, invasión tumoral y la inmunosupresión [21]. Algunos nuevos agentes anti-IL-1 han sido utilizados en ensayos clínicos en pacientes que muestran diversas enfermedades con manifestaciones inflamatorias [22]. Una mejor comprensión de la función integradora de la IL-1β vías de señalización en el proceso maligno permitirá la aplicación de la novela de modulación IL-1β se acerca en pacientes con cáncer.
PTEN se descubrió como un importante supresor de tumores que a menudo está mutado o se pierde en varios tipos de cáncer [23]. Varias líneas de evidencia han puesto de relieve PTEN como una fosfatasa lipídica que hidroliza fosfato 3 'en fosfoinosítidos [24]. PTEN también puede regular la actividad de la serina /treonina quinasa AKT /PKB y por lo tanto puede influir en la supervivencia celular de señalización [25]. la exposición UV puede provocar la interacción con PTEN de tipo salvaje de melanocortina-1 variantes del receptor, que protege PTEN de la degradación mediada por WWP2, lo que lleva a la inactivación AKT en el melanoma [26]. Existen varios mecanismos para la regulación de PTEN, incluyendo la transcripción, la estabilidad del ARNm, la orientación microARN, la traducción y la estabilidad de la proteína. PTEN es transcripcionalmente silenciados por la metilación del promotor en el carcinoma gástrico [27]. PTEN también puede ser después de la traducción regulada por acetilación, ubiquitylation, oxidación, fosforilación, y la localización subcelular [28]. A pesar de una amplia caracterización de mutaciones de PTEN en los cánceres humanos y una relativamente buena comprensión de las funciones moleculares de PTEN en el control de procesos celulares, poco se sabe acerca de los modos de regulación de PTEN.
PTEN puede ser inhibida en las células cancerosas después de la inducción de la citocina proinflamatoria IL-1β [29]. La estimulación con IL-1β activa NF-kappaB por la fosforilación y degradación de I? B. Esta activación permite NF-kappaB a translocan en el núcleo y activar transcripcionalmente genes diana [30]. NF-kappaB es un activador de la transcripción heterodimérico que consiste en la unión p50 subunidad ADN y la transactivación de la subunidad p65 [31]. Los altos niveles de endógeno NF-kappaB disminuyeron la expresión de PTEN, PTEN y la expresión podrían ser rescatados por la inhibición específica de la vía de NF-kappaB [32]. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

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