NF-kappaB-afhankelijke MicroRNA-425 opregulatie bevordert de maag de groei van kankercellen door zich te richten PTEN op IL-1β induction

NF-kappaB-afhankelijke MicroRNA-425 opregulatie bevordert de maag de groei van kankercellen door zich te richten PTEN op IL-1β inductie
Abstract
Overexpressie van de pro-inflammatoire cytokine IL-1β wordt geassocieerd met diverse aandoeningen, waaronder kanker. Wijziging van miRNA waargenomen in kankercellen blootgesteld aan proinflammatoire cytokines, maar hun functie bij ontsteking spanning blijft ongrijpbaar. Hier laten we zien dat IL-1β induceert de opregulatie van miR-425, die negatief reguleert fosfatase en tensine homoloog expressie doelwit zijn 3 'UTR. Een toename van miR-425 is afhankelijk van IL-1β geïnduceerde NF-kappaB activering, die miR-425 gentranscriptie verbetert op IL-1β inductie. Derhalve onderdrukking van fosfatase en tensine homoloog van miR-425 bevordert maagkanker celproliferatie, die nodig is om cellen van cisplatine geïnduceerde apoptose te beschermen. Samengenomen ondersteunen onze gegevens een cruciale rol voor NF-kappaB-afhankelijke opregulatie van miR-425, die een nieuwe route voor de onderdrukking van fosfatase en tensine homoloog activering en de bevordering van celoverleving na IL-1β inductie vertegenwoordigt.
trefwoorden
IL-1β NF-kappaB miR-425 PTEN Maagkanker Achtergrond
Maagdarmkanker is de vierde en de vijfde meest voorkomende kanker bij mannen en vrouwen, respectievelijk wereldwijd en is sterk verbonden met chronische ontsteking [1]. Het wordt nu algemeen aanvaard dat infectie met Helicobacter pylori
(H. pylori
) speelt een belangrijke rol bij het ontstaan ​​van chronische ontsteking leidt tot maligniteit [2]. Chronische maagontsteking initieert de histopathologische progressie van chronische gastritis bij maagatrofie, intestinale metaplasie en tenslotte maagkanker [3]. Hoewel H. pylori
-infectie is zeer wijd verspreid, zal slechts een kleine minderheid (ongeveer 1%) van de geïnfecteerde individuen maagkanker ontwikkelen na vele jaren. De variabele reactie op deze gemeenschappelijke pathogeen lijkt te worden geregeld door een genetische aanleg voor hoge expressie niveaus van pro-inflammatoire cytokines [4]. Ondernemingen De nucleaire factor kappa B (NF-kappaB) route is lange tijd beschouwd als een belangrijke pro-inflammatoire signaleringsroute, grotendeels gebaseerd op de activatie van NF-kappaB door pro-inflammatoire cytokines en de rol van NF-kappaB in de transcriptionele activering van genen die reageren zoals cytokines en chemokines [5]. De "canonical" route voor NF-kappaB activering wordt veroorzaakt door pro-inflammatoire cytokinen zoals IL-1β en doorgaans leidt tot de activering van relatieve of CREL-complexen [6]. NF-kappaB bestaat in het cytoplasma in een inactieve vorm geassocieerd met genoemd remmers van kB (IkB) regulerende eiwitten, waarvan de belangrijkste IKBa, IκBβ en IκBε zijn. IKBa geassocieerd met voorbijgaande NF-kappaB activatie, terwijl IκBβ betrokken is bij aanhoudende activatie [7]. Echter, chronische ontsteking is een complex fysiologisch proces, en de rol van NF-kappaB in de ontstekingsreactie is nog niet volledig onderzocht.
Naast invloed eiwit-coderende genexpressie inflammatie spanning verandert ook de expressie van microRNA (miRNAs) [8]. MicroRNAs zijn een klasse van endogene, kleine, niet-coderende RNA's die negatief reguleren genexpressie op post-transcriptioneel niveau hoofdzakelijk via binding aan getranslateerde gebied van een doel-mRNA de 3 ', en ze hebben belangrijke regulerende functies bij de controle van diverse fysiologische en pathologische processen [9, 10]. Deze RNA's bleken te zijn betrokken bij de regulering van vele cellulaire processen waaronder proliferatie, differentiatie en apoptose [11-13]. Maar of chronische ontsteking reguleert miRNA expressie moduleren van gentranscriptie of wijziging post- transcriptionele rijping is niet vastgesteld.
In dit werk hebben we vastgesteld dat miR-425 inductie na IL-1β-geïnduceerde ontsteking was afhankelijk van de activering van NF-kappaB, die miR-425 gentranscriptie verbeterd. Bovendien is de opgereguleerd miR-425 rechtstreeks gericht fosfatase en tensin homoloog (PTEN) en negatief gereguleerd zijn expressie, welke cel overleving gepromoot op IL-1β inductie.
Experimentele procedures
Ethics statement
Alle monsters werden verkregen uit patiënten die een operatie ondergaan aan de Fudan Universiteit in Shanghai Cancer Center. Het protocol werd goedgekeurd door de Clinical Research Ethics Committee van Fudan University, en het onderzoek werd uitgevoerd volgens de bepalingen van de Verklaring van Helsinki van 1975. Naast de normale weefsels uitgevoerd werden van de maagkanker laesie macroscopisch uitgesneden, en hun histologische diagnose werd bevestigd microscopisch. Schriftelijke toestemming werd verkregen van alle bij de deelnemers aan de studie.
Cell cultuur en reagentia Ondernemingen De menselijke embryonale niercellijn HEK293 (ATCC® CRL-1573 ™), de humane borstkanker cellijn MDA-MB361 (ATCC ® HTB-27 ™), de menselijke adenocarcinoom cellijn AGS (ATCC® CRL-1739 ™), SNU-1 (ATCC® CRL-5971 ™), SNU-5 (ATCC® CRL-5973 ™), SNU-16 (ATCC® CRL 5974 ™), Hs746T (ATCC® HTB-135 ™), NCI-N87 (ATCC® CRL-5822 ™), en KATO III (ATCC®HTB-103 ™) werden aangehouden in DMEM met 10% foetaal runderserum. Alle cellijnen werden in medium bevattende penicilline (100 IU /ml) en streptomycine (100 mg /ml) bij 37 ° C met 5% CO 2. Het miRNA bootst en anti-miRNA werden verkregen van Ambion (Austin, TX, USA). De IKK inhibitor TPCA-1 (Cat. No. S2824), de p38 MAPK remmer BIX02188 (Cat. No. S1574) en de JNK inhibitor SP600125 (Cat. No. S1460) werden gekocht bij Selleckchem (Houston, TX, USA). Recombinant humaan IL-1β werden gekocht bij Sigma-Aldrich (cat. Nr H6291, Shanghai, China).
RNA-extractie en real-time PCR
Totaal RNA werd geëxtraheerd uit cellen met behulp van TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA ). Voor microRNA analyse werden poly (A) staarten toegevoegd aan totale RNA met behulp van poly (A) polymerase (Ambion, Carlsbad, CA) voorafgaand aan omgekeerde transcriptie. De MiRcute miRNA qPCR detectie kit (TIANGEN, Beijing, China) werd gebruikt om de expressieniveaus van volwassen miR-425 kwantificeren volgens het protocol en GAPDH werd gebruikt als een interne controle. Real-time PCR werd uitgevoerd onder de volgende omstandigheden: 95 ° C 10 m, 1 cyclus; 95 ° C 10 s, 55 ° C 34 s, 40 cycles.
Voor alle resultaten verkregen door real-time PCR methoden gebruikten we de delta delta CT methode om de voudige verandering in genexpressie tussen verschillende groepen berekenen. De hoeveelheid doel (PTEN /miR-425), genormaliseerd naar de endogene housekeeping gen GAPDH en ten opzichte van een referentie-monster, wordt gegeven door de volgende vergelijking:. Hoeveelheid target = 2 - △△ CT
Immunoblottingtest
Eiwitten werden gescheiden op een 10% SDS-PAGE gel en daarna overgebracht naar een PVDF membraan. Na het blokkeren met 5% magere melk werd het membraan geïncubeerd met een muizen monoklonaal anti-PTEN antilichaam (1: 500, Santa Cruz, sc-7974) en NF-kappaB p65 Phospho (pS536) (RELA) antilichaam (1: 10.000 ., Epitomics, Cat #: 2220-1). IRdye-gelabelde secundaire antilichamen werden gebruikt voor kwantificering van de immunoblotting signaal en de signalen werden geanalyseerd met een Odyssey scanner (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA).
Luciferase assay
HEK293 cellen en cellen AGS getransfecteerd met miR-425 en pGL3 luciferase reporter constructen herbergen van de miR-425 doelsequentie. Na 24 uur werden de activiteiten van vuurvlieg luciferase en Renilla luciferase in de cellysaten gemeten met de Dual-Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI, USA). Voor de transcriptie luciferase reporter assay, miR-425-genpromotor sequenties (WT of site deletie) werden gekloneerd in het promotorgebied van de pGL3-Basic vector, en luciferaseactiviteit werd gemeten zoals hierboven beschreven.
Chromatine immunoprecipitatie (ChIP)
kort behandelde cellen waren verknoopt met 1% formaldehyde, geknipt met een gemiddelde grootte van 400 bp, en vervolgens aan immunoprecipitatie met antilichamen tegen NF-kappaB (Santa Cruz, sc-166.588). De chip-PCR primers werden ontworpen om de promotergebieden bevattende putatieve NF-kappaB bindingsplaatsen binnen miR-425 amplificeren zoals afgebeeld. Een positieve controle antilichaam (RNA polymerase II) en een negatieve controle niet-immune IgG werden gebruikt om de doeltreffendheid van de kit reagentia (Epigentek Group Inc, P-2025-48) tonen. Immunogeprecipiteerd DNA wordt vervolgens gereinigd, vrijgelaten, en geëlueerd. Geëlueerde DNA kunnen worden gebruikt voor verdere toepassingen ChIP-PCR. Voudige verrijking (FE) werd berekend onder toepassing van een verhouding van amplificatie-efficiëntie van de ChIP monster dan die van niet-immune IgG. Amplificatie-efficiëntie van RNA polymerase II werd gebruikt als een positieve controle. FE% = 2 (IgG CT - Sample CT). X 100%
celproliferatie assay
een celproliferatie assay werd uitgevoerd met de Cell Counting kit-8 (DOJINDO, Kumamoto, Japan) volgens de fabrikant. Vóór de toevoeging van CCK-8 werden de cellen met warm kweekmedium gewassen door het draaien van de plaat bij 500 rpm gedurende 3 m en gooi de supernatant.
Cell apoptoseassay
kankercellen werden geoogst en geresuspendeerd in 500 ul van een bindingsbuffer. De celsuspensie (100 pl) werd geïncubeerd met 5 gl annexine-V en propidium jodide bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. De gekleurde cellen werden geanalyseerd met fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) gebruikt BD LSR II flowcytometrie.
Celcyclusanalyse
Voor de flowcytometrie-analyse, werden cellen getrypsiniseerd en overnacht in 70% ethanol gefixeerd. De cellen werden vervolgens geïncubeerd in 0,5 ml propidiumjodide-oplossing bevattende 25 pg ml -1 RNase gedurende 15 minuten bij 37 ° C en gemeten.
Muisexperimenten Ondernemingen De NCI-N87-cellen (3 x 10 6) werden geïnjecteerd in de rechter flank van athymische nu /nu-muizen. Een week na de injectie werden muizen met vergelijkbare afmetingen tumoren behandeld gedurende 4 weken met anti-miR-425. De anti-miR-425 (2 nmol) werden direct geïnjecteerd in de tumoren tweemaal per week gedurende 4 weken.

Statistische analyse De resultaten worden weergegeven als het gemiddelde ± SEM, en de gegevens werden geanalyseerd met Student's t-test. Een waarde van p
< 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.
Resultaten
IL-1β behandeling induceert miR-425 expressie Belgique Om de miRNAs die verantwoordelijk is voor IL-1β inductie karakteriseren, geprofileerde we miRNA expressie in PBS-behandelde AGS cellen en IL-1β geïnduceerde AGS cellen met behulp van de Exiqon miRCURY ™ LNA Array System (v.14.0). Het miRNA niveaus sterk verschilde tussen de PBS-behandelde groep en de IL-1β geïnduceerde groep, zoals in de hitte kaart getoond in figuur 1A. Onder de 1.891 capture probes werden 46 miRNAs differentieel tot expressie in-IL-1β geïnduceerde AGS cellen in vergelijking met gepaarde PBS-behandelde AGS cellen; deze miRNAs, 29 verhoogd en 17 verminderden in de IL-1β geïnduceerde AGS cellen (Tabel 1), wat aangeeft dat een specifiek miRNA patroon wordt geassocieerd met IL-1β inductie. Figuur 1 ontregeling van miRNAs in humane AGS cellen behandeld met IL-1β. (A) Menselijke AGS cellen werden behandeld met IL-1β (10 ng /ml) [14] en 24 uur later werd de miRNAs expressieprofiel geanalyseerd microarray technologie. Heat kaart diagram gegenereerd door onbewaakte clustering analyse met 46 aanzienlijk ontregeld miRNAs. Rood geeft aan opregulatie; groen geeft downregulatie. (B) Verhoogde niveaus van miR-425 in 36 tumormonsters opzichte van het niveau in gelijke aangrenzende normale weefsels zoals gemeten door real-time PCR. Normaal: aangrenzend normaal weefsel. (C) Het expressieniveau van miR-425 werd onderzocht door real-time PCR in gastrische meerdere kankercellijnen en zes normale maagslijmvlies cellen.
Tabel 1 Significante ontregeling van miRNAs
overexpressie in IL-1β geïnduceerde AGS-cellen
miRNA
Vouw verandering
p-waarde
HSA-miR-425
12.36
0.00
hsa-miR-584
11.03
0.01
hsa-miR-31
8.12
0.00
hsa-miR-155
6.22
0.00
hsa-let-7i
5.55
0.00
hsa-miR-21
5.11
0.00
hsa-miR-335
4.89
0.01
hsa-miR-191
4.73
0.03
hsa-miR-519d
4.37
0.02
hsa-miR-520d-5p
3,95
0.00
hsa-miR-331
3.67
0.01
hsa-miR-142
3.45
0.01
hsa-miR-518a-5p
3.28
0.01
hsa-miRPlus-F1231
3.11
0.01
hsa-miR-2113
2.94
0.02
hsa-miR-196a*
2.88
0.02
hsa-miR-1304
2.78
0.02
hsa-miR-185
2.65
0.01
hsa-let-7a
2.61
0.00
hsa-miR-130
2.52
0.02
hsa-miR-1280
2.50
0.01
hsa-miR-222
2.47
0.01
hsa-let-7c
2.43
0.00
hsa-miR-602
2.31
0.00
hsa-miR-548e
2.31
0.03
hsa-miR-32
2.27
0.04
hsa-miR-181a
2.24
0.02
hsa-miR-7
2.13
0.00
hsa-miR-21*
2.06
0.00
Underexpressed in IL-1β geïnduceerde-AGS cellen
miRNA
Fold change
p-waarde
hsa-miR-143
0.06
0.02
hsa-miR-200
0.08
0.01
hsa-miR-451
0.13
0.01
hsa-miR-144
0.17
0.00
hsa-miR-363
0.20
0.01
hsa-miR-637
0.25
0.03
hsa-miR-153
0.39
0.01
hsa-miR-139
0.39
0.00
hsa-miR-617
0.42
0.01
hsa-miR-1915
0.43
0.00
hsa-miRPlus-F1153
0.45
0.00
hsa-miR-381
0.46
0.00
hsa-miR-145
0.47
0.02
hsa-miR-659
0.47
0.03
hsa-miR-125b
0.48
0.00
hsa-miR-183*
0.49
0.00
hsa-miR-638
0.49
0.01
*: Als twee volwassen miRNAs zijn afkomstig uit verschillende armen van dezelfde pre-miRNA, een sterretje achter de naam duidt op een miRNA uitgedrukt op een laag niveau ten opzichte van de miRNA in de tegenovergestelde arm van een haarspeld
Onder deze miRNAs, buitenspiegels. 425 is de meest opgereguleerd op IL-1β inductie. Middels real-time PCR-analyse, analyseerden we miR-425 expressie in 36 gepaarde monsters (tumor en aangrenzend normaal weefsel van dezelfde patiënt). We vonden een aanzienlijk hogere miR-425 expressie in de tumormonsters opzichte van de niveaus van de aangrenzende normale weefsels (p
< 0,0001) (Figuur 1B). Onderzochten we de expressie van miR-425 in een set van maagkanker cellijnen en zes normale maagslijmvlies cellen. Zoals getoond in figuur 1C, kozen we de AGS cellen met neergereguleerd miR-425 en NCI-N87 cellen met opgereguleerd miR-425 voor verdere studie. Hoewel de activatie van miR-425 is vermeld dat van wezenlijk belang voor kanker initiatie en progressie van kankercellen door het verminderen van de expressie van een uitgebreid netwerk van genen [15], de rol van miR-425 in humane kankers is niet opgehelderd . . We hebben daarom gekozen voor miR-425 voor verder onderzoek
expressie van PTEN negatief wordt gereguleerd door miR-425 Belgique Om de doelstellingen van miR-425 te identificeren, gebruikten we een veel gebruikte algoritme, miRecords (http: //mirecords . biolead. org /), dat is een geïntegreerde bron voor dierlijke miRNA-doelwit interacties. Om de juistheid van deze voorspelling, genen die werden voorspeld door ten minste vijf van de elf databases (Diana, microinspector, miranda, mirtarget2, mitarget, nbmirtar, PicTar, pita, rna22, rnahybrid en targetscan) te verhogen werden geselecteerd als mogelijke doelwitten. Onder deze vermeende doelen van miR-425, gen ontologie analyse bleek dat het expressieniveau van 9 kandidaatgenen gewijzigd; aldus kan deze wijziging bijdragen tot het kwaadaardige fenotype. Gebruik 3'UTR luciferase reporter assays, vonden we dat overexpressie van miR-425 remde significant luciferaseactiviteit in HEK293 cellen en AGS cellen die het wildtype PTEN 3 'UTR reporter (Figuur 2A). We bevestigd dat PTEN is een vermeend direct doelwit van miR-425. Om de specificiteit van miR-425 illustreren we aangetoond dat anti-miR-425 specifiek schafte de remming van luciferaseactiviteit geïnduceerd door miR-425 in HEK293 cellen en NCI-N87-cellen (Figuur 2B). Mutaties in het miRNA bindingsplaatsen (figuur 2C) maakte de constructies die niet reageren op miR-425 inductie (figuur 2D), verder bevestigd dat het PTEN-gen is een directe doelwit van miR-425. Figuur 2 miR-425 rechtstreeks richt PTEN. (A) Reporter assay HEK293 cellen en AGS cellen getransfecteerd met miR-425 en constructen dragen luciferase cDNA gefuseerd aan het 3 'UTR's van voorspelde kandidaatdoelwitten (gemiddelde ± SEM). (B) Effect van anti-miR-425 op de luciferase activiteit van luciferase constructen gefuseerd met het 3 'UTR's van PTEN in HEK293 cellen en NCI-N87-cellen (gemiddelde ± SEM). (C, D) Reporter assay HEK293 cellen en AGS cellen getransfecteerd met luciferase constructen dragen PTEN 3 'UTR's met mutaties in de miR-425-bindingsplaatsen (gemiddelde ± SEM). (E) HEK293 cellen en AGS cellen werden getransfecteerd met een luciferase construct die het wildtype PTEN 3 'UTR (LUC-WT) of een construct die een gemuteerd PTEN 3' UTR (LUC-Mut). Na 24 uur werden de cellen behandeld met IL-1β, en luciferaseactiviteit werd gekwantificeerd 24 uur na behandeling. (F) Western blot en RT-PCR toont PTEN proteïne niveaus en mRNA niveaus in AGS cellen na 48 uur van miR-425 transfectie. (G) AGS cellen werden getransfecteerd met anti-miR-425, en 24 h later werden de cellen onbehandeld gelaten of behandeld met IL-1β en vervolgens 24 uur na behandeling verzameld. Hele cellysaten werden onderworpen aan immunoblotting met antilichamen PTEN. (H) NCI-N87 cellen werden met anti-miR-425 en geoogst 24 uur na behandeling. Hele cellysaten werden onderworpen aan immunoblotting met antilichamen PTEN. (I) AGS cellen werden getransfecteerd met een plasmide dat alleen het open afleesraam sequentie van PTEN (PTEN-CDS). Na 24 uur werden de cellen behandeld met IL-1β of miR-425. Hele cellysaten werden onderworpen aan immunoblotting na 24 uur behandeling. (* P < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001)
Bovendien mutatie van de miR-425 doelsequentie ook aanzienlijk verzwakt IL-1β-geïnduceerde onderdrukking van PTEN 3 'UTR. luciferase reporter-activiteit in HEK293 cellen en AGS-cellen (Figuur 2E). Overexpressie van miR-425 was voldoende om PTEN expressie downregulate op zowel eiwit en mRNA levels in AGS-cellen (figuur 2F). Dienovereenkomstig werd IL-1β geïnduceerde onderdrukking PTEN gered door expressie anti-miR-425 in AGS cellen (figuur 2G). Anti-miR-425 kon up-reguleren PTEN expressie in NCI-N87 cellen zonder IL-1β stimulatie (Figuur 2H).
Onze gegevens ook aan dat de 3 'UTR is vereist voor miR-425 gemedieerde PTEN downregulatie omdat de expressie van een PTEN coderend gebied construct (PTEN-CDS) is ongevoelig voor miR-425 overexpressie en IL-1β-inductie in AGS-cellen (figuur 2I). Samengenomen geven deze resultaten aan dat miR-425 speelt een cruciale rol bij de onderdrukking van PTEN expressie doelwit zijn 3 'UTR van IL-1β inductie.
IL-1β geïnduceerde NF-kappaB activering vereist voor miR-425 inductie
Om het mechanisme betrokken bij miR-425 transactivatie op IL-1β inductie te bepalen, onderzochten we de impact van de diverse kinase-remmers op miR-425-inductie in IL-1β-behandelde AGS cellen. -IL-1β geïnduceerde miR-425 opregulatie werd significant geremd door de IKK inhibitor TPCA-1 maar niet door de p38 MAPK remmer BIX02188 of JNK-remmer SP600125 (Figuur 3A). Eerdere studies hebben aangetoond dat IKK een essentieel kinase vereist voor NF-kappaB signalen; derhalve dit resultaat gaf de kritische rol van NF-kappaB signalering in de regulatie van miR-425 transcriptie van IL-1β inductie. Figuur 3 IKK activatie vereist voor de inductie van miR-425 in reactie op IL-1β inductie. (A) AGS cellen werden behandeld met IL-1β in aanwezigheid van IKK inhibitor TPCA-1, de p38 MAPK remmer BIX02188 en JNK inhibitor SP600125. Rijpe miR-425 expressie bij 12 uur na behandeling werd gekwantificeerd door real-time PCR. De vouw verandering van relatieve miR-425 expressie (miR-425 /U6) werd genormaliseerd aan dat van PBS-behandelde cellen. (B) De expressie van primaire miR-425 (miR-425) werd geanalyseerd door real-time PCR zoals in A. (C) De expressieniveaus van NF-kappaB proteïne en miR-425 werden geanalyseerd door real time PCR in AGS cellen behandeld met siRNA voor NF-kappaB. (D) AGS cellen werden behandeld met chemische remmers of siRNA voor NF-kappaB. Cellysaten werden verkregen 24 uur na IL-1β behandeling en onderworpen aan immunoblotting met antilichamen PTEN. (E) Western blot-analyse van gefosforyleerde NF-kappaB p65 (serine 536). (F) De expressieniveaus van NF-kappaB proteïne en miR-425 werden geanalyseerd door real-time PCR in NCI-N87 cellen behandeld met siRNA voor NF-kappaB. (* P < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001).
Consequent, inductie van miR-425 op IL-1β behandeling opmerkelijk geremd in aanwezigheid van de IKK inhibitor of siRNA voor NF-kappaB (afbeelding 3B en C). We waargenomen dat IL-1β geïnduceerde onderdrukking PTEN werd verzwakt in aanwezigheid van IKK inhibitor of siRNA voor NF-kappaB (Figuur 3D). Bepalen of NF-kappaB activiteit aanwezig in AGS cellen behandeld met IL-1β was, gebruikten we een western blot op het niveau van gefosforyleerde NF-kappaB p65 (serine 536) te bepalen. Het niveau van gefosforyleerd NF-kappaB p65 (serine 536) was hoog in AGS cellen behandeld met IL-1β (10 ng /ml; 24 uur) (Figuur 3E). Bovendien silencing van NF-kappaB remde miR-425 expressie in NCI-N87 cellen zonder IL-1β behandeling (Figuur 3F). Deze resultaten suggereren dat IKK-afhankelijke NF-kappaB activering van IL-1β behandeling nodig voor PTEN downregulatie, hoogstwaarschijnlijk via de versterking van miR-425 transcriptie.
Te bepalen of NF-kappaB direct regelt miR-425 transcriptie, we analyseerde de stroomopwaartse sequenties van miR-425 met behulp van de WeightMatrix library (matrixTFP60.lib) en geïdentificeerd drie potentiële NF-kappaB bindingsplaatsen in de promotorregio van miR-425 (cut-offs: gelijksoortige matrices = 0,9 en de kern gelijkenis = 0,95) ( figuur 4A). We voerden chromatine immunoprecipitatie (ChIP) assays met AGS kankercellen gebruikmaking van monoklonale anti-NF-kappaB antilichamen. Zoals getoond in figuur 4B, alleen primer-B van miR-425 geproduceerde sterk PCR-producten, waaruit bleek dat de NF-kappaB proteïne gevormde complexen met de B bindingsplaats in de miR-425-promotor. De resultaten van luciferase reporter assays gesuggereerd dat de potentiële B bindingsplaats in de miR-425-promotor vereist is voor transactivatie van het stroomafwaartse gen van IL-1β inductie (Figuur 4A en C). Figuur 4 NF-kappaB bindingsplaatsen in de miR-425-promotor. (A) Kenmerken van de miR-425 5 'flankerende DNA. Human promotor regio van miR-425 bevat drie vermoedelijke bindingsplaatsen voor NF-kappaB. (B) ChIP assays met anti-NF-kappaB antilichamen toonden binding van NF-kappaB de promoter van miR-425 in AGS cellen. De relatieve inbezitnemingen van NF-kappaB worden aangeduid als verticale staven. De grafieken tonen de gemiddelden van drie onafhankelijke ChIP experimenten. (C) De promotor van miR-425 werd geactiveerd door NF-kappaB. AGS cellen werden behandeld met NF-kappaB en getransfecteerd met de aangegeven LUC vectoren.
Inductie van miR-425 promoot cel overleving na IL-1β inductie
Aangetoond werd dat PTEN is een van de meest geïnactiveerde tumorsuppressorgenen. Overexpressie van PTEN in verschillende zoogdiercellen weefselkweek cellen beïnvloedt verschillende processen zoals celproliferatie, celdood en celmigratie [16]. We vonden ook dat remmen van PTEN verlaagde de activatie van caspase-3 in cellen behandeld met IL-1β (Figuur 5A). Het is aannemelijk dat miR-425 apoptose inductie kan remmen via downregulatie van PTEN in IL-1β behandelde cellen. Inderdaad, overexpressie van miR-425 remde caspase-3 activatie in cisplatine behandelde AGS cellen (Figuur 5B). Bovendien, in cisplatina behandelde cellen AGS, gezamenlijke transfectie van een construct dat alleen het PTEN coderingsgebied (PTEN-CDS), dat ongevoelig voor miR-425, omzeild het anti-apoptotische effect van miR-425 overexpressie (figuur 5C). Dienovereenkomstig transfectie van anti-miR-425 in AGS cellen significant verbeterde caspase-3 activatie en apoptose in respons op IL-1β behandeling (figuur 5D). Bovendien transfectie van anti-miR-425 in NCI-N87 cellen significant verhoogd caspase-3 activatie en apoptose zonder IL-1β stimulatie (Figuur 5E). Figuur 5 miR-425 remt cel apoptose door het onderdrukken van PTEN. (EEN). AGS cellen werden behandeld met controle (PBS) of IL-1β. Na 48 uur werden gehele cellysaten onderworpen aan immunoblotting. (B). AGS-cellen werden tijdelijk met negatieve controle (miR-NC) of miR-425 alleen. Na 24 uur werden de cellen behandeld met cisplatine en geoogst 24 uur na behandeling. Hele cellysaten werden onderworpen aan immunoblotting. (C). AGS-cellen werden met miR-NC, miR-425, en PTEN-CDS zoals aangegeven. Na 24 uur werden de cellen behandeld met cisplatine en geoogst 24 uur na behandeling. De apoptose werd bepaald met de methode flowcytometrie. (D). AGS-cellen werden met miR-NC of anti-miR-425. Na 48 uur werden de cellen behandeld met IL-1β en geoogst 24 uur na behandeling. Totale cellysaten werden onderworpen aan immunoblotting met de aangegeven antilichamen en de cel apoptose werd bepaald met de methode flowcytometrie. (E) NCI-N87-cellen werden met miR-NC of anti-miR-425. Totale cellysaten werden onderworpen aan immunoblotting met de aangegeven antilichamen en de cel apoptose werd bepaald met behulp van de flowcytometrie methode.
Consistent met zijn rol in het remmen van caspase activering, opregulatie van miR-425 aanzienlijk verbeterd AGS cel proliferatie, terwijl de pro- overleving effect werd volledig geblokkeerd door co-transfectie met exogeen PTEN (PTEN-CDS) (figuur 6A). Anti-miR-425 daalde het percentage prolifererende cellen voor NCI-N87-cellen (Figuur 6B). We vonden ook dat het remmen van PTEN een beschermend effect vergelijkbaar met dat in de cellen tot overexpressie miR-425 (figuur 6C) hadden, wat suggereert dat PTEN repressie kan een belangrijke rol in miR-425-afhankelijke bescherming spelen in cellen behandeld met IL-1β. Figuur 6 miR-425 bevordert celproliferatie door het onderdrukken van PTEN. (A) AGS cellen werden behandeld met PBS, IL-1β, miR-NC, miR-425 en PTEN-CDS aangegeven. Na 72 uur werd de celproliferatie bepaald volgens de EDU labeling kit. (B) NCI-N87-cellen werden met miR-NC of anti-miR-425. Na 72 uur werd het celproliferatiesnelheid bepaald volgens de EDU labeling kit. (C) AGS cellen werden behandeld met siRNA-PTEN of miR-425. Na 72 uur werd de celproliferatie bepaald volgens de EDU labeling kit. (D) Foto's van PTEN eiwit expressie in de tumor weefsels (bovenste panelen) en tumoren (onderste panelen). (E) De grafiek toont het gewicht van het 3 tumoren na 4 weken (n = 3). (F) Een significante omgekeerde correlatie waargenomen tussen miR-425 en PTEN expressieniveaus in de maagkanker weefsel (n = 52). (G) De expressieniveaus van PTEN worden bepaald in zes normale maagslijmvlies cellen en maagkanker cellijnen middels real-time PCR. (H) Een model ter illustratie van de mogelijke rol van IL-1β en miR-425 in de controle van het PTEN route in humane gastrische carcinoomcellen.
We onderzochten de effecten van miR-425 op tumorgeniciteit in vivo. De tumoren behandeld met anti-miR-425 vertoonden verhoogde niveaus van het PTEN proteïne (figuur 6D). Ook anti-miR-425 verminderde het tumorgewicht van de muizen in vergelijking met de miR-NC-behandelde groep (figuur 6E). Het gebruik van niet-parametrische testen, vonden we een significante inverse correlatie tussen PTEN mRNA en miR-425 expressie in de maagkanker monsters (figuur 6F). De expressieniveaus van PTEN Bovendien werden de zes normale maagslijmvlies cellen en maagkanker cellijnen middels real-time PCR. Zoals getoond is de cellen met "neerwaarts gereguleerd" miR-425 hogere hoeveelheden PTEN opzichte cellijnen "opwaarts gereguleerd" miR-425 niveaus (Figuur 6G). Concluderend, hebben de resultaten aangetoond dat miR-425 speelt een causale rol door targeting PTEN in maagkanker.
Bespreking
Interleukine-1 (IL-1) is een belangrijk pro-inflammatoir cytokine dat wordt geproduceerd door kwaadaardige of micro-omgeving van de cellen [17]. IL-1 functioneert ook als een pleiotrope cytokine betrokken bij tumorigenese en tumor invasiviteit; daarom is een haalbare kandidaat voor een modulerend cytokine dat de balans tussen ontsteking en immuniteit tegen de inductie van antitumor reacties [18] kan kantelen. IL-1α en IL-1β zijn de belangrijkste agonisten van IL-1. In hun uitgescheiden vormen, IL-1α en IL-1β binden aan dezelfde receptoren en induceren dezelfde biologische functies [19]. Echter, IL-1α en IL-1β verschillen in hun compartimentering in de cel of micro [20]. IL-1β is alleen actief in de uitgescheiden vorm en medieert ontstekingen, die kankerverwekkend, tumor invasiviteit en immuunsuppressie [21] bevordert. Sommige nieuwe anti-IL-1β middelen zijn gebruikt in klinische studies bij patiënten vertonen diverse ziekten met inflammatoire verschijnselen [22]. Een beter begrip van de integrerende rol van IL-1β signaalwegen in het maligne proces de toepassing van nieuwe IL-1β modulatie inschakelen zal bij kankerpatiënten.
PTEN werd ontdekt als een belangrijk tumorsuppressor die vaak gemuteerd of verloren verschillende vormen van kanker [23]. Verschillende feiten hebben PTEN genoemd als een lipide fosfatase dat de 3 'fosfaat phosphoinositides [24] hydrolyseert. PTEN kunnen regelen ook de activiteit van de serine /threonine kinase AKT /PKB en dus invloed celoverleving signaling [25]. UV-blootstelling kan PTEN interactie met wildtype melanocortine-1 receptor varianten die van PTEN WWP2-afhankelijke afbraak beschermt activeren, wat leidt tot AKT inactivatie bij melanomen [26]. Er zijn meerdere mechanismen voor de regulering van PTEN, waaronder transcriptie, mRNA stabiliteit, microRNA targeting, vertaling en eiwit stabiliteit. PTEN wordt transcriptioneel het zwijgen opgelegd door promoter methylering in maagcarcinoom [27]. PTEN kunnen ook post-translationeel gereguleerd door acetylering, ubiquitinering, oxidatie, fosforylering, en subcellulaire lokalisatie [28]. Ondanks uitgebreide karakterisering van PTEN mutaties in humane kankers en relatief goed begrip van de moleculaire rol van PTEN in de controle van cellulaire processen weinig bekend over wijzen van regulering PTEN.
PTEN kan worden geremd in kankercellen na inductie van de pro-inflammatoire cytokine IL-1β [29]. Stimulatie met IL-1β activeert NF-kappaB door fosforylering en afbraak van IKB. Deze activering maakt NF-kappaB te transloceren naar de kern en transcriptioneel activeren doelwitgenen [30]. NF-kappaB is een heterodimere transcriptiefactor activator bestaande uit het DNA-bindende subeenheid p50 en de p65 transactivatie subeenheid [31]. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript.
Authors 'originele ingediende dossiers voor afbeeldingen
Hieronder staan ​​de links naar de auteurs oorspronkelijke ingediende dossiers voor afbeeldingen . Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.

• Invloed van IL17A polymorfismen op de afwijkende methylering van DAPK en CDH1 in niet-kankerachtige maagslijmvlies
• Ongebruikelijke trichobezoar van de maag en de darm: een case report