NF-kappaB dependente upregulation MicroRNA-425 promove o crescimento de células de câncer gástrico, visando PTEN em cima IL-1β induction

NF-kappaB dependente MicroRNA-425 upregulation promove o crescimento de células de câncer gástrico, visando PTEN após indução de IL-1β da arte abstracta
a sobre-expressão da citocina pró-inflamatória IL-1β está associada a diversas doenças, incluindo o cancro. A alteração de microARNs tem sido observada em células cancerosas expostas a citocinas pró-inflamatórias, mas a sua função no stress inflamação permanece elusiva. Aqui, mostramos que a IL-1β induz a regulação positiva de miR-425, que regula negativamente a expressão de fosfatase e tensina homólogo por sua segmentação UTR 3 '. Um aumento na miR-425 depende induzida por IL-1β activação de NF-kappaB, o que aumenta o miR-425 a transcrição de genes mediante a indução de IL-1β. Por conseguinte, a repressão da fosfatase e homólogo tensina por miR-425 promove a proliferação de células de cancro gástrico, o que é necessário para proteger as células de apoptose induzida por cisplatina. Tomados em conjunto, os nossos dados suportam um papel crítico para a supra-regulação de NF-kappaB-dependente de miR-425, o que representa um novo caminho para a repressão da fosfatase e homólogo tensina activação e promoção da sobrevivência celular após indução de IL-1β.
Palavras-chave
IL-1β NF-kappaB miR-425 PTEN gástrica fundo câncer
adenocarcinoma gástrico é o quarto e quinto câncer mais comum entre machos e fêmeas, respectivamente, em todo o mundo e está fortemente ligada à inflamação crônica [1]. É agora bem aceite que a infecção por Helicobacter pylori
(H. pylori
) desempenha um papel importante no desencadeamento de inflamação crónica que conduz a malignidade [2]. A inflamação crônica do estômago inicia a progressão histopatológica da gastrite crónica para atrofia gástrica, metaplasia intestinal e câncer gástrico, finalmente, [3]. Embora a infecção por H. pylori
é extremamente prevalente, apenas uma pequena minoria (cerca de 1%) de indivíduos infectados irá desenvolver câncer gástrico após muitos anos. A variável resposta a este patógeno comum parece ser governado por uma predisposição genética para níveis de citocinas pró-inflamatórias [4].
O fator nuclear kappa B (NF-kappaB) via tem sido considerada uma importante via de sinalização pró-inflamatória alta expressão, em grande parte com base na activação do NF-kappaB por citocinas pró-inflamatórias e o papel do NF-kappaB na activação da transcrição de genes responsivos incluindo citocinas e quimiocinas [5]. A via de "canónica" para activação do NF-kappaB é desencadeada por citocinas pró-inflamatórias, tais como IL-1β e geralmente conduz à activação de relações Crel ou complexos contendo [6]. NF-kappaB existe no citoplasma numa forma inactiva associada com proteínas reguladoras que se refere a como inibidores da kB (IkB), dos quais o mais importante pode ser IκBα, IκBβ, e IκBε. IκBα está associada com a activação transiente NF-kB, ao passo que IκBβ está envolvido na activação sustentada [7]. No entanto, a inflamação crónica é um processo fisiológico complexo, e o papel do NF-kappaB na resposta inflamatória não foi ainda completamente explorada.
Além de afectar a expressão do gene que codifica a proteína, o stress inflamação também altera o nível de expressão microARNs (miRNAs) [8]. MicroRNAs são uma classe de endógena, pequena, não-codificante RNAs que regulam negativamente a expressão do gene ao nível pós-transcricional, principalmente, por meio da ligação à região não traduzida a 3 'de um ARNm alvo, e que tem funções reguladoras importantes no controlo da fisiológica diversa e processos patológicos [9, 10]. Estes RNAs foram mostrados para ser envolvidos na regulação de diversos processos celulares, incluindo a proliferação, a diferenciação e a apoptose [11-13]. No entanto, se a inflamação crónica regula a expressão de miARN modulando a transcrição do gene ou alterando a maturação pós-transcricional ainda não foi determinada.
Neste trabalho, verificou-se que o miR-425 sobre a indução da inflamação induzida por IL-1β era dependente da activação de NF-kappaB, que aprimorou miR-425 transcrição do gene. Além disso, o upregulated miR-425 com destino direto da fosfatase e tensina homólogo (PTEN) e regulados negativamente a sua expressão, que promoveu a sobrevivência das células após indução de IL-1β. Procedimentos
experimentais
declaração Ética
Todos os espécimes foram obtidos a partir de pacientes submetidos à cirurgia na Universidade de Fudan Shanghai Cancer Center. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Fudan de Investigação Clínica, ea pesquisa foi realizada de acordo com as disposições da Declaração de Helsinki de 1975. tecidos normais adjacentes foram excisadas longe da lesão câncer gástrico macroscopicamente, e seu diagnóstico histológico foi confirmado microscopicamente. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes envolvidos no estudo.
cultura de células e reagentes
A linhagem humana embrionária da célula renal HEK293 (ATCC CRL-1573 ™), a linha de células de cancro da mama humano MDA-MB361 (ATCC ® HTB-27 ™), a linha celular de adenocarcinoma gástrico humano AGS (ATCC CRL-1739 ™), SNU-1 (ATCC CRL-5971 ™), SNU-5 (ATCC CRL-5973 ™), SNU-16 (ATCC CRL- 5974 ™), Hs746T (ATCC HTB-135 ™), NCI-N87 (ATCC CRL-5822 ™), e Kato III (ATCC®HTB-103 ™) foram mantidas em DMEM contendo 10% de fetal de soro de bovino. Todas as linhas celulares foram mantidas em meios contendo penicilina (100 UI /ml) e estreptomicina (100 mg /ml) a 37 ° C com 5% de CO 2. Os imitadores de miARN e anti-miARN foram adquiridos da Ambion (Austin, TX, EUA). O inibidor de IKK TPCA-1 (Cat. No. S2824), o inibidor de p38 MAPK BIX02188 (No. Cat. S1574) e o inibidor da JNK SP600125 (No. Cat. S1460) foram adquiridos a Selleckchem (Houston, TX, EUA). Recombinantes IL-1β humanos foram adquiridos de Sigma-Aldrich (No. Cat. H6291, Xangai, China).
Extração de RNA e PCR em tempo real
O ARN total foi extraído a partir de células utilizando TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA ). Para a análise de microARN, caudas poli (A) foram adicionados a ARN total utilizando poli (A) polimerase (Ambion, Carlsbad, CA) antes da transcrição reversa. O kit de detecção de miARN MiRcute qPCR (TIANGEN, Pequim, China) foi utilizado para quantificar os níveis de miR-425 maduro de expressão de acordo com o protocolo fornecido, e GAPDH foi usada como um controlo interno. PCR em tempo real foi realizado sob as seguintes condições: 95 ° C a 10 m, 1 ciclo; 95 ° C 10 s, 55 ° C 34 s, 40 ciclos. Compra de todos os resultados obtidos por métodos de PCR em tempo real, foi utilizado o método de delta CT delta para calcular a variação vezes na expressão de genes entre diferentes grupos. A quantidade de alvo (PTEN /miR-425), normalizados para o gene GAPDH de limpeza endógena e em relação a uma amostra de referência, é determinado pela equação seguinte:. = Quantidade de alvo 2 - △△ CT
imunotransferência
As proteínas foram separadas num gel de SDS-PAGE a 10% e posteriormente transferidas para uma membrana de PVDF. Após o bloqueio com leite magro a 5%, a membrana foi incubada com um anticorpo monoclonal de ratinho anti-PTEN (1: 500, Santa Cruz, sc-7974) e um anticorpo de NF-kappaB p65 Phospho (pS536) (RELA) (1: 10000 ., EPITOMICS, Cat #: 2220-1). IRdye-anticorpos secundários marcados foram usados ​​para quantificação do sinal de imunotransferência, e os sinais foram analisados ​​por meio de um scanner Odyssey (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, EUA).
Ensaio de luciferase
células HEK293 e as células foram AGS transfectadas com miR-425 e pGL3 construções repórter da luciferase que alberga a sequência alvo de miR-425. Após 24 h, as actividades de luciferase de pirilampo e da luciferase da Renilla nos lisados ​​celulares foram medidos com o Dual-Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI, EUA). Para o ensaio de repórter de luciferase da transcrição, sequências de miR-425 (promotor do gene WT ou deleção local) foram clonados na região de promotor do vector pGL3-Basic, e a actividade da luciferase foi medida como descrito acima.
Imunoprecipitação da cromatina (ChIP)
Resumidamente, as células foram tratadas de ligação cruzada com 1% de formaldeído, cortada até um tamanho médio de 400 pb, e subsequentemente imunoprecipitadas com anticorpos contra NF-kappaB (Santa cruz, SC-166588). Os iniciadores de PCR-ChIP foram concebidos para amplificar as regiões promotoras contendo locais de ligação de NF-kappaB putativos dentro de miR-425, tal como ilustrado. Um anticorpo de controlo positivo (ARN polimerase II) e um controlo negativo de IgG não imune foram usadas para demonstrar a eficácia dos reagentes do kit (Epigentek Group Inc, P-2025-48). ADN imunoprecipitado é então limpo, liberado e fluido. ADN eluído pode ser utilizado para aplicações a jusante ChIP-PCR. enriquecimento de dobragem (FE) foi calculada usando uma proporção de eficiência de amplificação da amostra de chips ao longo de IgG não imune. a eficiência de amplificação de ARN polimerase II foi utilizado como um controlo positivo. FE = 2% (IgG CT - CT da amostra). × 100% ensaio de proliferação celular

um ensaio de proliferação celular foi realizado utilizando a contagem celular Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japão) de acordo com a as instruções do fabricante. Antes da adição de CCQ-8, as células foram lavadas com meio de cultura quente girando a placa a 500 rpm durante 3 M e, em seguida, descartando o sobrenadante. Ensaio celular apoptose
As células cancerosas foram colhidas e ressuspensas em 500 ul de um tampão de ligação. A suspensão de células (100 ul) foi incubado com 5 jil de anexina-V e iodeto de propídio, à temperatura ambiente durante 20 minutos. As células coradas foram analisadas com células fluorescentes activadas (FACS) usando o fluxo BD LSR II citometria.
Análise do ciclo celular
Para a análise de citometria de fluxo, as células foram tripsinizadas e fixadas em etanol a 70% durante a noite. As células foram então incubadas em 0,5 ml de solução de iodeto de propídio contendo 25 ug ml -1 ARNase durante 15 minutos a 37 ° C e medido.
Experiências com ratos
As células NCI-N87 (3 × 10 6) foram injectadas no flanco direito de ratinhos nu /nu atímicos. Uma semana após as injecções, os ratinhos com tumores de tamanho comparável foram tratados durante 4 semanas com anti-miR-425. O anti-miR-425 (2 nmol) foram injectadas directamente nos tumores duas vezes por semana durante 4 semanas. A análise estatística

Os resultados são apresentados como médias ± SEM e os dados foram analisados ​​com o teste t de Student. Um valor de p Art < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Resultados
tratamento IL-1β induz miR-425 expressão
Para caracterizar os miRNAs responsáveis ​​pela IL-1β de indução, que perfilado expressão miRNA em células AGS tratados com PBS e IL-1β células AGS induzidas usando o Sistema de Disposição Exiqon miRCURY ™ LNA (v.14.0). Os níveis de miARN diferiu significativamente entre o grupo tratado com PBS e o grupo induzida por IL-1β, tal como ilustrado no mapa de calor mostrado na Figura 1A. Entre as sondas de captura 1,891, 46 miARNs foram diferencialmente expressos em células de AGS de IL-1p-induzida em comparação com células AGS-emparelhados tratados com PBS; miARNs destes, 29 foram aumentadas e 17 foram diminuídas nas células AGS induzida de IL-1p-(Tabela 1), indicando que um padrão de miARN específico está associado com a indução de IL-1β. Figura 1 A desregulação de miARNs em células AGS humanos tratados com IL-1β. células AGS Humano (A) foram tratados com IL-1β (10 ng /ml) [14], e 24 h mais tarde, o perfil miARNs expressão foi analisada com tecnologia de microarrays. diagrama de mapa de calor gerado pela análise de agrupamento não supervisionado com 46 miRNAs significativamente desregulados. O vermelho indica a regulação positiva; verde indica downregulation. (B) Aumento dos níveis de miR-425 em 36 amostras de tumores em relação aos seus níveis em tecidos normais adjacentes emparelhados como medidos por PCR em tempo real. Normal: tecidos normais adjacentes. (C) O nível de expressão de miR-425 foi analisada por PCR em tempo real em várias linhas celulares de cancro gástrico e seis células normais da mucosa gástrica.
Tabela 1 desregulação significativo de miARNs
sobre-expresso em células de IL-1 induzida por AGS
miRNA
Dobre mudança
valor
p
hsa-miR-425
12,36
0.00
hsa-miR-584
11.03
0.01
hsa-miR-31
8.12
0.00
hsa-miR-155
6.22
0.00
hsa-let-7i
5.55
0.00
hsa-miR-21
5.11
0.00
hsa-miR-335
4.89
0.01
hsa-miR-191
4.73
0.03
hsa-miR-519d
4.37
0.02
hsa-miR-520d-5p
3,95
0.00
hsa-miR-331
3.67
0.01
hsa-miR-142
3.45
0.01
hsa-miR-518a-5p
3.28
0.01
hsa-miRPlus-F1231
3.11
0.01
hsa-miR-2113
2.94
0.02
hsa-miR-196a*
2.88
0.02
hsa-miR-1304
2.78
0.02
hsa-miR-185
2.65
0.01
hsa-let-7a
2.61
0.00
hsa-miR-130
2.52
0.02
hsa-miR-1280
2.50
0.01
hsa-miR-222
2.47
0.01
hsa-let-7c
2.43
0.00
hsa-miR-602
2.31
0.00
hsa-miR-548e
2.31
0.03
hsa-miR-32
2.27
0.04
hsa-miR-181a
2.24
0.02
hsa-miR-7
2.13
0.00
hsa-miR-21*
2.06
0.00
Underexpressed em IL-1 células induzida por AGS
miRNA
Fold valor p mudança

hsa-miR-143
0.06
0.02
hsa-miR-200
0.08
0.01
hsa-miR-451
0.13
0.01
hsa-miR-144
0.17
0.00
hsa-miR-363
0.20
0.01
hsa-miR-637
0.25
0.03
hsa-miR-153
0.39
0.01
hsa-miR-139
0.39
0.00
hsa-miR-617
0.42
0.01
hsa-miR-1915
0.43
0.00
hsa-miRPlus-F1153
0.45
0.00
hsa-miR-381
0.46
0.00
hsa-miR-145
0.47
0.02
hsa-miR-659
0.47
0.03
hsa-miR-125b
0.48
0.00
hsa-miR-183*
0.49
0.00
hsa-miR-638
0.49
0.01
*: Quando dois miARNs maduros são originários a partir de braços opostos do mesmo pré-miARN, um asterisco após o nome indica um miARN expresso em níveis baixos relativamente ao miARN no braço oposto de um grampo
Entre estes miARNs, miR-. 425 foi o mais altamente regulada por indução de IL-1β. Usando em tempo real A análise de PCR, analisou-se a expressão de miR-425 em 36 amostras emparelhadas (de tumor e tecidos normais adjacentes do mesmo doente). Nós achamos um nível significativamente mais elevado de expressão de miR-425 em amostras de tumor em relação aos níveis nos tecidos normais adjacentes (p
< 0,0001) (Figura 1B). Foi examinada a nível de miR-425 na expressão de um conjunto de linhas celulares de cancro gástrico e seis células normais da mucosa gástrica. Como mostrado na Figura 1C, que se obter as células com AGS regulada negativamente as células NCI-N87 com sobre-regulada de miR-425 para um estudo mais aprofundado o miR-425 e. Embora a activação de miR-425 foi reportado ter um impacto fundamental na iniciação e progressão de células do cancro do cancro, reduzindo a expressão de uma extensa rede de genes [15], o papel de miR-425 em cancros humanos não foi elucidada . . Assim, optamos por miR-425 para uma investigação mais aprofundada
expressão de PTEN é regulado negativamente por miR-425
Para identificar os alvos de miR-425, empregamos um algoritmo comumente usado, miRecords (http: //mirecords . biolead. org /), que é um recurso integrado para animais interações miRNA-alvo. Para aumentar a precisão desta previsão, os genes que foram previstos por pelo menos cinco dos bancos de dados de onze (Diana, microinspector, miranda, mirtarget2, mitarget, nbmirtar, PicTar, pita, rna22, RNAhybrid e TargetScan) foram selecionados como possíveis alvos. Entre estes alvos putativos de miR-425, a análise do gene ontologia revelaram que os níveis de 9 genes candidatos de expressão foram alterados; Assim, esta alteração pode contribuir para o fenótipo maligno. Usando 3 'UTR ensaios de repórter de luciferase, verificou-se que a sobre-expressão da actividade da luciferase inibida significativamente o miR-425 em células HEK293 que expressam AGS e células do tipo selvagem de PTEN 3' UTR repórter (figura 2A). Nós confirmou que PTEN é um alvo direto putativa de miR-425. Para ilustrar a especificidade de miR-425, que mostrou que o anti-miR-425 especificamente aboliu a inibição da actividade de luciferase induzida por miR-425 em células HEK293 e células NCI-N87 (Figura 2B). As mutações nos locais de ligação de miARN (Figura 2C) rendeu as construções que não respondem à indução de miR-425 (Figura 2D), ainda confirmando que o gene PTEN é um alvo directo de miR-425. Figura 2 o miR-425 tem como alvo directamente de PTEN. (A) ensaio de repórter em células HEK293 transfectadas e células AGS com miR-425 e construções de ADNc que transportam a luciferase fundida com os UTRs 3 'de alvos candidatos preditos (média ± SEM). (B) Efeitos de anti-miR-425 sobre a actividade da luciferase de construções de luciferase fundido com o 'UTRs de PTEN 3 em células HEK293 e células NCI-N87 (média ± SEM). (C, D) ensaio de repórter em células HEK293 transfectadas e células AGS com construções de luciferase que transportam 'UTRs 3 PTEN com mutações nos sítios de miR-425 de ligação (média ± SEM). (E) células HEK293 e células AGS foram transfectadas com um constructo de luciferase, carregando o tipo selvagem de PTEN 3 'UTR (Luc-WT) ou uma construção que leva uma mutado PTEN 3' UTR (Luc-Mut). Após 24 h, as células foram tratadas com IL-1β, e a actividade da luciferase foi quantificada 24 horas após o tratamento. (F) Western blot e RT-PCR que mostra os níveis de proteína PTEN e níveis de ARNm em células AGS após 48 h de miR-425 transfecção. (G) As células foram transfectadas com AGS anti-miR-425, e 24 h mais tarde, as células foram ou não tratados esquerda ou tratadas com IL-1β e subsequentemente colhidas 24 h após o tratamento. Os lisados ​​celulares totais foram imunotransferidas com anticorpos PTEN. células (H) NCI-N87 foram transfectadas com anti-miR-425 e colhidas 24 h após o tratamento. Os lisados ​​celulares totais foram imunotransferidas com anticorpos PTEN. (I) células AGS foram transfectadas com um plasmídeo transportando apenas a sequência de estrutura de leitura aberta de PTEN (PTEN-CDS). Após 24 h, as células foram tratadas com IL-1β ou miR-425. Os lisados ​​celulares totais foram submetidos a imunotransferência após 24 h de tratamento. (* P < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001)
Além disso, a mutação do miR-425 sequência alvo também significativamente atenuada IL-1β induzida por repressão de PTEN UTR 3 '. actividade repórter da luciferase em células HEK293 e células de AGS (Figura 2E). A sobre-expressão de miR-425 foi suficiente para regular negativamente a expressão de PTEN em ambos a proteína e níveis de ARNm em células de AGS (Figura 2F). Assim, induzida por IL-1β repressão PTEN foi resgatado por expressar anti-miR-425 em células AGS (Figura 2G). Anti-miR-425 foi capaz de sobre-regular a expressão de PTEN em células NCI-N87, sem estimulação de IL-1β (Figura 2H).
Os nossos dados também indicam que a UTR 3 'é necessária para a regulação negativa de PTEN miR-425-mediada porque a expressão de uma construção de região codificadora de PTEN (PTEN-CDS) foi insensível a miR-425 sobre-expressão e a indução de IL-1β em células de AGS (Figura 2I). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que o miR-425 desempenha um papel crítico na reprimindo a expressão de PTEN, visando a sua UTR 3 'no momento da indução de IL-1β. Induzida por IL-1β
activação de NF-kappaB é necessária para a indução de miR-425
Para determinar o mecanismo envolvido na miR-425 transactivação no momento da indução de IL-1β, examinou-se o impacto dos vários inibidores de cinase na indução de miR-425 em células tratadas AGS-IL-1β. miR-425 sobre-regulação de IL-induzido-1β foi significativamente inibida pelo inibidor de IKK-1 TPCA mas não pelo inibidor de BIX02188 MAPK p38 ou o SP600125 inibidor de JNK (Figura 3A). Estudos anteriores demonstraram que a IKK é uma cinase essencial necessária para a sinalização de NF-kappaB; Portanto, este resultado indicou o papel crítico de sinalização de NF-kB na regulação da transcrição de miR-425 na indução de IL-1β. Figura 3 activação IKK é necessária para a indução de miR-425 em resposta à indução de IL-1β. células AGS (A) foram tratados com IL-1β na presença do inibidor de IKK-1 TPCA, o BIX02188 inibidor de p38 MAPK e a SP600125 inibidor de JNK. expressão maduro miR-425 em 12 horas após o tratamento foi quantificada por PCR em tempo real. A mudança de dobra relativo de expressão de miR-425 (miR-425 /U6) foi normalizada para que a observada em células tratadas com PBS. (B) A expressão de primário de miR-425 (pri-miR-425) foi analisada por PCR em tempo real como em A. (C) Os níveis de proteína de NF-kappaB-e miR-425 pri foram analisados ​​por expressão real PCR em tempo em células tratadas com ARNsi AGS para NF-kappaB. (D) As células AGS foram tratados com inibidores de química ou ARNsi para o NF-kappaB. Os lisados ​​celulares foram obtidos 24 horas após a IL-1β tratamento e imunotransferidas com anticorpos PTEN. (E) a análise Western blot de fosforilada p65 NF-kappaB (serina 536). (F) Os níveis de proteína de NF-kappaB e expressão de miR-425-pri foram analisadas por PCR em tempo real em células NCI-N87 tratadas com ARNsi de NF-kappaB. (* P < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001).
Consistentemente, indução de pri-miR-425 mediante tratamento com IL-1β foi significativamente inibida na presença do inibidor de IKK ou ARNsi para o NF-kappaB (Figura 3B e C). Observou-se também que a induzida por IL-1β repressão PTEN foi atenuada na presença do inibidor de IKK ou ARNsi para o NF-kappaB (Figura 3D). Para determinar se a actividade de NF-kappaB estava presente em células AGS tratados com IL-1β, utilizou-se uma transferência de Western para determinar o nível de p65 fosforilada NF-kappaB (serina 536). O nível de fosforiladas p65 de NF-kappaB (serina 536) foi elevada em células tratadas com AGS IL-1 (10 ng /ml; 24 horas) (Figura 3E). Além disso, o silenciamento de NF-kappaB inibiu a expressão de miR-425 em células NCI-N87 sem tratamento com IL-1β (Figura 3F). Estes resultados sugerem que a activação de NF-kappaB-dependente IKK mediante tratamento com IL-1β é necessária para a regulação negativa de PTEN, provavelmente através da sua melhoria de miR-425 transcrição.
Para determinar se o NF-kappaB regula directamente o miR-425 de transcrição, nós analisou as sequências a montante de miR-425 usando a biblioteca WeightMatrix (matrixTFP60.lib) e identificou três potenciais locais NF-kappaB de ligação na região promotora de miR-425 (cut-offs: matriz de similaridade = 0,9 e similaridade core = 0,95) ( Figura 4A). Foi realizada imunoprecipitação da cromatina (ChIP) ensaios com células de câncer AGS utilizando anticorpos anti-NF-kappaB monoclonais. Como mostrado na Figura 4B, única iniciador-B de miR-425 produzidos produtos de PCR forte, o que sugere que a proteína de NF-kappaB complexos formados com o local de ligação B no promotor de miR-425. Os resultados de ensaios de repórter de luciferase sugeriu que o potencial sítio de ligação B no promotor de miR-425 é necessária para a transactivação do gene a jusante no momento da indução de IL-1β (Figura 4A e C). Figura 4 locais de ligação de NF-kappaB no promotor de miR-425. (A) Características do miR-425 5 'ADN flanqueador. regiões promotoras humanos de miR-425 contém três sítios de ligação putativos para NF-kappaB. Os ensaios (B) chip com anticorpos anti-NF-kappaB mostrou ligação de NF-kB para o promotor de miR-425 em células AGS. As ocupações relativas de NF-kB são indicadas como barras verticais. Os gráficos de barras mostram as médias de três experiências Independent Chip. (C) O promotor de miR-425 foi activado pelo NF-kappaB. AGS células foram tratadas com NF-kappaB e transfectadas com os vectores indicados LUC.
Indução de miR-425 promove a sobrevivência de células após a indução de IL-1β
Foi demonstrado que PTEN é entre os genes supressores de tumor mais frequentemente inactivado. A sobre-expressão de PTEN em diferentes células de cultura de tecidos de mamíferos afecta vários processos, incluindo a proliferação celular, morte celular e migração das células [16]. Descobrimos também que a inibição de PTEN diminuiu a activação de caspase-3 em células tratadas com IL-1β (Figura 5A). É plausível que a indução de miR-425 pode inibir a apoptose através da regulação negativa de PTEN em células IL-1p-tratada. De facto, a sobre-expressão de miR-425 inibiu a activação de caspase-3 em células AGS tratados com cisplatina (Figura 5B). Além disso, em células AGS tratados com cisplatina, a co-transfecção de uma construção contendo apenas a região codificadora de PTEN (PTEN-CDS), que é insensível a miR-425, o efeito anti-apoptótico contornado de miR-425 sobre-expressão (Figura 5C). Consequentemente, a transfecção de anti-miR-425 em células AGS melhorado significativamente a activação e apoptose da caspase-3 em resposta a tratamento com IL-1β (Figura 5D). Além disso, a transfecção de anti-miR-425 em células NCI-N87 melhorado significativamente a activação de caspase-3 e apoptose, sem estimulação de IL-1β (Figura 5E). Figura 5 o miR-425 inibe a apoptose de células reprimindo PTEN. (UMA). células AGS foram tratados com controlo (PBS) ou IL-1β. Após 48 h, os lisados ​​de células inteiras foram coradas imunologicamente. (B). AGS células foram transfectadas transientemente com o controlo negativo (miR-NC) ou o miR-425 sozinho. Após 24 h, as células foram tratadas com cisplatina e recolhidas 24 h após o tratamento. Os lisados ​​celulares totais foram coradas imunologicamente. (C). células AGS foram transfectadas com miR-NC, miR-425, e PTEN-CDS, como indicado. Após 24 h, as células foram tratadas com cisplatina e recolhidas 24 h após o tratamento. A taxa de apoptose celular foi determinada usando o método de citometria de fluxo. (D). AGS células foram transfectadas com o miR-NC ou anti-miR-425. Após 48 h, as células foram tratadas com IL-1β e colhidas 24 h após o tratamento. Os lisados ​​celulares totais foram coradas imunologicamente com os anticorpos indicados, e a taxa de apoptose das células foi determinada utilizando o método de citometria de fluxo. células (E) NCI-N87 foram transfectadas com miR-NC ou anti-miR-425. Os lisados ​​celulares totais foram coradas imunologicamente com os anticorpos indicados, e a taxa de apoptose das células foi determinada utilizando o método de citometria de fluxo.
Consistente com o seu papel na inibição da activação de caspase, regulação positiva de miR-425 substancialmente melhorada a proliferação de células AGS, enquanto o pro- efeito de sobrevivência foi completamente bloqueada por co-transfecção com PTEN exógeno (PTEN-CDS) (Figura 6A). Anti-miR-425 diminuiu a percentagem de células que proliferam para células NCI-N87 (Figura 6B). Descobrimos também que a inibição de PTEN teve um efeito protector semelhante à observada em células que sobre-expressam o miR-425 (Figura 6C), o que sugere que a repressão PTEN pode desempenhar um papel importante na miR-425-dependente protecção nas células tratadas com IL-1β. Figura 6 o miR-425 promove a proliferação celular através da repressão de PTEN. (A) As células AGS foram tratados com PBS, IL-1β, miR-NC, o miR-425, e PTEN-CDS, como indicado. Após 72 h, a proliferação celular foi determinada utilizando o kit de marcação de EdU. células (B) NCI-N87 foram transfectadas com miR-NC ou anti-miR-425. Após 72 h, a taxa de proliferação de células foi determinada utilizando o kit de marcação de EdU. (C) As células foram tratadas com AGS siRNA-PTEN ou miR-425. Após 72 h, a proliferação celular foi determinada utilizando o kit de marcação de EdU. (D) de fotografias de expressão da proteína de PTEN em tecidos tumorais (painéis superiores) e tumores (painéis inferiores). (E) O gráfico mostra o peso dos 3 tumores após 4 semanas (n = 3). (F) Uma correlação inversa significativa é observada entre os níveis de expressão de miR-425 e PTEN nos tecidos de cancro gástrico (n = 52). (L) Os níveis de expressão de PTEN são determinados em seis células da mucosa gástrica normais e linhas de células de cancro gástrico utilizando PCR em tempo real. (H) Um modelo que ilustra as funções putativas de IL-1β e miR-425 no controlo da via de PTEN em células de carcinoma gástrico humano.
Investigou-se o efeito de miR-425 em tumorigenicidade in vivo. Os tumores tratados com anti-miR-425 apresentaram níveis aumentados da proteína PTEN (Figura 6D). Além disso, anti-miR-425 reduziu o peso do tumor dos ratinhos em comparação com o grupo tratado com o miR-NC (Figura 6E). Usando testes não-paramétricos, encontramos uma significativa correlação inversa entre mRNA PTEN e expressão de miR-425 em amostras de câncer gástrico (Figura 6F). Os níveis de expressão de PTEN foram também determinadas em seis células da mucosa gástrica normais e linhas de células de cancro gástrico utilizando PCR em tempo real. Como se mostra, as células com "sub-regulada" miR-425 têm valores mais elevados de PTEN em comparação com linhas celulares com "regulado para cima" miR-425 níveis (Figura 6G). Em conclusão, os nossos resultados provaram que o miR-425 desempenha um papel causal através da segmentação de PTEN em cancros gástricos.
Discussão
Interleucina-1 (IL-1) é um importante citocina pró-inflamatória, que é produzida por ou maligna células micro-ambientais [17]. IL-1 também funciona como uma citoquina pleiotrópica envolvido na tumorigénese e invasividade tumoral; portanto, representa um candidato viável para uma citocina moduladora que pode inclinar o equilíbrio entre a inflamação e a imunidade para a indução de respostas anti-tumor [18]. IL-1α e IL-1β são os principais agonistas de IL-1. Nas suas formas segregadas, IL-1 e se ligam a IL-1β aos mesmos receptores e induzem as mesmas funções biológicas [19]. No entanto, a IL-1α e IL-1β diferem na sua compartimentalização no interior da célula ou o microambiente [20]. IL-1β só está activa na sua forma segregada e um mediador da inflamação, que promove a carcinogênese, capacidade de invasão do tumor e imunossupressão [21]. Alguns agentes anti-IL-1 novos têm sido utilizadas em ensaios clínicos em pacientes que exibem diversas doenças com manifestações inflamatórias [22]. Uma melhor compreensão do papel integrador de IL-1β vias de sinalização no processo maligno irá permitir a aplicação da modulação de IL-1β novas abordagens em pacientes com cancro.
PTEN foi descoberto como um importante supressor de tumor que é frequentemente mutado ou perdido em vários tipos de câncer [23]. Várias linhas de evidência puseram em evidência como PTEN uma fosfatase lipídica que hidrolisa fosfato 3 'em fosfoinositidos [24]. PTEN pode também regular a actividade da serina /treonina quinase AKT /PKB e podem, assim, influenciar a sobrevivência das células de sinalização [25]. exposição à radiação UV pode provocar interacção PTEN com variantes do receptor de tipo selvagem de melanocortina-1, que protege contra a degradação PTEN WWP2-mediada, conduzindo à inactivação de AKT em melanoma [26]. Existem vários mecanismos de regulação de PTEN, incluindo a transcrição, a estabilidade do mRNA, microRNA segmentação, tradução e estabilidade da proteína. PTEN é transcricionalmente silenciados pela metilação do promotor no carcinoma gástrico [27]. PTEN também pode ser pós-tradução regulada por acetilação, ubiquitinação, oxidação, fosforilação, e localização subcelular [28]. Apesar de extensa caracterização de PTEN mutações em cancros humanos e uma relativamente boa compreensão dos papéis moleculares de PTEN no controle de processos celulares, pouco se sabe sobre os modos de regulação PTEN.
PTEN pode ser inibida em células de câncer por indução do citocina pró-inflamatória IL-1β [29]. A estimulação com IL-1β activa NF-kappaB por fosforilação e degradação de IkB. Isto permite a activação de NF-kappaB de se translocar para o núcleo e activar transcricionalmente genes alvo [30]. NF-kappaB é um activador da transcrição heterodimérica consistindo em subunidade p50 de ligação a DNA e a subunidade p65 de transactivação [31]. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

• Influência de polimorfismos IL17A na metilação aberrante de DAPK e CDH1 na mucosa gástrica não-canceroso
• trichobezoar incomum do estômago e do intestino: relato de caso