NF-kappaB-зависимой микроРНК-425 способствует усиление активности желудка рост раковых клеток путем охвата PTEN на IL-1 induction

NF-kappaB-зависимой микроРНК-425 способствует усиление активности желудка рост раковых клеток путем охвата PTEN на IL-1 индукции
Аннотация <бр> Избыточная экспрессия провоспалительного цитокина IL-1 связан с различными заболеваниями, в том числе рака. Переделка микроРНК наблюдается в раковых клетках, подвергнутых провоспалительных цитокинов, но их функции в воспаление стресса остается недостижимым. Здесь мы покажем, что IL-1β индуцирует повышающую регуляцию MIR-425, что негативно регулирует экспрессию гомологов фосфатазы и Тенсин путем пристреливать его 3 'UTR. Увеличение MIR-425 зависит от IL-1β-индуцированной активации NF-kappaB, который усиливает микроРНК-425 транскрипции генов при индукции IL-1. Следовательно, подавление фосфатазы и Тенсин гомолога по микроРНК-425 способствует пролиферации раковых клеток желудка, который необходим для защиты клеток от цисплатин-индуцированного апоптоза. Взятые вместе, наши данные подтверждают важную роль для NF-kappaB-зависимой повышающей регуляции MIR-425, который представляет собой новый путь для подавления фосфатазы и ангиотензина гомологов активации и содействия выживаемости клеток при IL-1 индукции.
Ключевые слова
IL-1β NF-kappaB микроРНК-425 PTEN Желудочный фон рак
аденокарциномы желудка является четвертым и пятым наиболее распространенным видом рака среди мужчин и женщин, соответственно, во всем мире и тесно связан с хроническим воспалением [1]. В настоящее время хорошо принят, что инфицирование Helicobacter Pylori
(H. Pylori
) играет главную роль в инициировании хроническое воспаление, ведущие к злокачественной опухоли [2]. Хроническое воспаление желудка инициирует Гистопатологические прогрессирование хронического гастрита к желудочной атрофии, кишечной метаплазией и раком желудка, наконец, [3]. В то время как H. Pylori
инфекция чрезвычайно широко, лишь незначительное меньшинство (около 1%) инфицированных лиц развивается рак желудка после многих лет. Переменная ответ на этот общий патогена, как представляется, определяется генетической предрасположенностью к высоким уровнем экспрессии провоспалительных цитокинов [4].
Ядерный фактор каппа-В (NF-kappaB) путь уже давно считается одним из основных провоспалительных сигнального пути, в значительной степени основаны на активации NF-kappaB с помощью провоспалительных цитокинов и роль NF-kappaB в активации транскрипции генов, в том числе чувствительных цитокинов и хемокинов [5]. «Канонической» путь для активации NF-kappaB инициируется провоспалительных цитокинов, таких как IL-1, и, как правило, приводит к активации или сравни- CREL-содержащих комплексов [6]. NF-kappaB существует в цитоплазме в неактивной форме, связанной с регуляторными белками, упомянутых в качестве ингибиторов (IκB кВ), из которых наиболее важными могут быть IκBα, IκBβ и IκBε. IκBα связано с транзиторной активации NF-kappaB, в то время как IκBβ участвует в длительной активации [7]. Тем не менее, хроническое воспаление представляет собой сложный физиологический процесс, и роль NF-kappaB в воспалительной реакции до сих пор не полностью изучены.
Помимо влияния на экспрессию генов белоккодирующей, воспаление стресс также изменяет уровень экспрессии микроРНК (микроРНК) [8]. MicroRNAs являются классом эндогенные, мал, некодирующие РНК, которые отрицательно регулируют экспрессию генов на пост-транскрипционном уровне, главным образом, путем связывания с нетранслируемой области 3'-мРНК-мишени, и они имеют важные регулирующие функции в контроле разнообразных физиологических и патологические процессы [9, 10]. Эти РНК, как было показано, участвуют в регуляции многих клеточных процессов, включая пролиферацию, дифференцировку и апоптоз [11-13]. Тем не менее, является ли хроническое воспаление регулирует экспрессию микроРНК путем модуляции транскрипции генов или изменения посттранскрипционных созревания не была определена.
В этой работе, мы обнаружили, что микроРНК-425 индукции на IL-1β-индуцированного воспаления зависит от активации NF-kappaB, которая расширяет возможности транскрипции генов микроРНК-425. Кроме того, позитивно регулируется микроРНК-425 непосредственно целевой фосфатазы и Тенсин гомолог (PTEN) и отрицательно регулируется его выражение, которое способствовало выживанию клеток на IL-1 индукции.
Экспериментальные процедуры
заявления по вопросам этики
Все образцы были получены из пациентов, перенесших операцию в университете Фудань в Шанхае онкологического центра. Протокол был утвержден клинический исследовательский комитет по этике университета Фудань Побочный и исследование было проведено в соответствии с положениями Хельсинкской декларации 1975 г. прилегающих нормальных тканей были вырезаны от желудочного рака поражения макроскопически, и их гистологический диагноз был подтвержден микроскопически. Письменное информированное согласие было получено от всех участников, участвующих в исследовании.
Культуры клеток и реактивы
В эмбриональной почки человека клеточной линии HEK293 (ATCC® CRL-1573 ™), на линии клеток рака молочной железы человека MDA-MB361 (АТСС ® HTB-27 ™), человеческий аденокарциномы желудка клеточная линия AGS (ATCC® CRL-1739 ™), СНУ-1 (ATCC® CRL-5971 ™), СНУ-5 (ATCC® CRL-5973 ™), СНУ-16 (ATCC® CRL- 5974 ™), Hs746T (ATCC® HTB-135 ™), NCI-N87 (ATCC® CRL-5822 ™), и КАТО III (ATCC®HTB-103 ™) поддерживали в среде DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки. Все клеточные линии поддерживали в среде, содержащей пенициллин (100 МЕ /мл) и стрептомицин (100 мг /мл) при 37 ° С с 5% CO <югу> 2. Мимика микроРНК и анти-микроРНК были приобретены у Ambion (Остин, штат Техас, США). Ингибитор ИКК TPCA-1 (Кат. No. S2824), ингибитор p38 МАРК BIX02188 (Cat. No. S1574) и ингибитор JNK SP600125 (Cat. No. S1460) были приобретены у Selleckchem (Хьюстон, штат Техас, США). Рекомбинантные человеческие IL-1β были приобретены у компании Sigma-Aldrich (Кат. No. H6291, Шанхай, Китай).
Выделение РНК и ПЦР в реальном времени
Суммарную РНК экстрагировали из клеток с использованием TRIzol (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния ). Для анализа микроРНК, поли (А) хвосты были добавлены к общей РНК с использованием поли (А) полимеразы (Амбион, Карлсбад, Калифорния) до обратной транскрипции. Комплект обнаружения MiRcute микроРНК КПЦР (TIANGEN, Пекин, Китай) использовали для количественной оценки уровней экспрессии зрелого микроРНК-425 в соответствии с предоставленным протоколом, и GAPDH был использован в качестве внутреннего контроля. ПЦР в реальном времени проводили при следующих условиях: 95 ° C 10 м, 1 цикл; 95 ° С 10 сек, 55 ° C 34 сек, 40 циклов.
Для всех результатов, полученных в режиме реального времени методами ПЦР, мы использовали дельта-дельта метода КТ для расчета кратное изменение в экспрессии генов между различными группами. Сумма целевого (PTEN /микроРНК-425), нормированы на эндогенного гена домашнего хозяйства GAPDH и по отношению к эталонному образцу, задается следующим уравнением:. Количество целевых = 2 - △△ КТ
иммуноблоттинг
Белки разделяли на 10% геле SDS-PAGE, а затем переносили на PVDF мембрану. После блокирования с помощью 5% обезжиренного молока, мембрану инкубировали с мышиными моноклональными анти-PTEN антителом (1: 500, Santa Cruz, SC-7974) и Phospho (pS536) (RELA) антитела NF-kappaB p65 (1: 10000 ., EPITOMICS, Cat #: 2220-1). IRdye-меченых вторичных антител были использованы для количественного определения сигнала иммуноблоттинга, а сигналы были проанализированы с помощью сканера Odyssey (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA).
Люциферазы
клеток НЕК293 и AGS клетки были трансфицировали микроРНК-425 и pGL3 люциферазы репортер конструкций, несущие целевую последовательность микроРНК-425. Через 24 ч деятельность люциферазы светлячка и Renilla люциферазы в клеточных лизатов были измерены с помощью двойного люциферазы системы анализа (Promega, Madison, WI, USA). Для люциферазы транскрипции репортера анализа, MIR-425 гена последовательности промотора (WT или удаления сайта) были клонированы в промоторной области pGL3-Basic вектора, и активность люциферазы измеряли, как описано выше.
Иммунопреципитации хроматина (CHIP)
Вкратце, обработанные клетки были сшиты с 1% формальдегида, стриженый к средним размером 400 п.о., а впоследствии иммунопреципитации с антителами против NF-kappaB (Santa Cruz, SC-166588). Праймеры ЧИП-PCR были разработаны для амплификации промоторной области, содержащие мнимые NF-kappaB сайты связывания в пределах микроРНК-425, как показано на рисунке. Положительное контрольное антитело (РНК-полимеразы II), и отрицательный контроль неиммунная IgG были использованы для демонстрации эффективности этого набора реагентов (Epigentek Group Inc, P-2025-48). Иммуноосажденного ДНК затем очищают, выпустили, и элюируют. Элюированный ДНК могут быть использованы для последующих применений Обломок-PCR. Fold обогащение (FE) рассчитывали с использованием коэффициента эффективности амплификации образца микрочип, что неиммунных IgG. эффективность амплификации полимеразной РНК II использовали в качестве положительного контроля. FE% = 2 (IgG, КТ - Образец КТ). × 100% обогащением
пролиферации клеток
анализе пролиферации клеток проводили с использованием Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Кумамото, Япония) в соответствии с инструкции изготовителя. Перед добавлением CCK-8, клетки промывают теплой культуральной среды путем прядения планшет при 500 оборотах в минуту в течение 3 м, а затем отбрасывая супернатант.
Апоптозом клеток анализ
Раковые клетки собирали и ресуспендировали в 500 мкл буфера для связывания. Суспензию клеток (100 мкл) инкубировали с 5 мкл аннексина-V и пропидийиодидом при комнатной температуре в течение 20 минут. Окрашенные клетки анализировали с помощью сортировки флуоресцентно активированных клеток (FACS) с использованием потока BD LSR II цитометрии.
Клеточного цикла анализа
Для анализа потока цитометрии, клетки обрабатывали трипсином и фиксировали в 70% этаноле в течение ночи. Затем клетки инкубировали в 0,5 мл пропидиума раствора иодида, содержащего 25 мкг мл -1 РНКазы в течение 15 минут при 37 ° С и измеряли.
Эксперименты мыши
Клетки NCI-N87 (3 × 10 6) вводили в правые бока бестимусных мышей Nu /Nu. Через неделю после инъекции мышей с опухолями сравнительно размера обрабатывали в течение 4-х недель с анти-MIR-425. Анти-микроРНК-425 (2 нмоль) вводили непосредственно в опухоли дважды в неделю в течение 4-х недель.
Статистический анализ
Результаты представлены в виде средних значений ± SEM, и данные были проанализированы с помощью критерия Стьюдента. Значение р
&ЛТ; 0,05 считали статистически значимыми.
Результаты
IL-1 индуцирует лечение микроРНК-425 выражение
Чтобы охарактеризовать микроРНК, ответственные за IL-1 индукции, мы профилированные выражение микроРНК в PBS-обработанных клетках AGS и IL-1 индуцированный AGS клетки с использованием системы массива Exiqon miRCURY ™ LNA (v.14.0). Уровни микроРНК сильно отличались между ПБС-обработанной группой и IL-1β-индуцированной группы, как показано на карте тепла, показанной на рисунке 1А. Среди зондов захвата 1891, 46 микроРНК были дифференцированно выражены в IL-1-индуцированное AGS клеток по сравнению с парными PBS-обработанных клетках AGS; из этих микроРНК, 29 были увеличены, и 17 были снижены на ИЛ-1 β индуцированных клеток AGS (таблица 1), что указывает, что конкретный шаблон микроРНК связывается с IL-1 β индукции. Рисунок 1 Дисрегуляция микроРНК в AGS клетках человека, обработанных IL-1. (A) клетки человека, AGS обрабатывали IL-1 (10 нг /мл) [14], а через 24 ч, профиль экспрессии микроРНК анализировали с помощью микрочипов технологии. Тепловая карта-схема генерируется неконтролируемого кластерный анализ с 46 значительно дизрегуляции микроРНК. Красный цвет указывает на активацию; зеленый указывает на понижающей регуляции. (B) Повышенные уровни микроРНК-425 в 36 образцах опухолей по сравнению с их уровнем в согласованных соседних нормальных тканях, измеренные с помощью ПЦР в реальном времени. Нормальные: соседние нормальные ткани. (C) уровень экспрессии микроРНК-425 был рассмотрен ПЦР в реальном времени в множественных желудочных линий раковых клеток и шесть нормальных клеток слизистой оболочки желудка.
Таблица 1 Значительные дисрегуляция микроРНК
суперэкспрессированный в IL-1 индуцируется-AGS клеток

микроРНК

Fold изменить

значение р

HSA-микроРНК-425
12,36
0,00
hsa-miR-584
11.03
0.01
hsa-miR-31
8.12
0.00
hsa-miR-155
6.22
0.00
hsa-let-7i
5.55
0.00
hsa-miR-21
5.11
0.00
hsa-miR-335
4.89
0.01
hsa-miR-191
4.73
0.03
hsa-miR-519d
4.37
0.02
hsa-miR-520d-5p
3,95
0.00
hsa-miR-331
3.67
0.01
hsa-miR-142
3.45
0.01
hsa-miR-518a-5p
3.28
0.01
hsa-miRPlus-F1231
3.11
0.01
hsa-miR-2113
2.94
0.02
hsa-miR-196a*
2.88
0.02
hsa-miR-1304
2.78
0.02
hsa-miR-185
2.65
0.01
hsa-let-7a
2.61
0.00
hsa-miR-130
2.52
0.02
hsa-miR-1280
2.50
0.01
hsa-miR-222
2.47
0.01
hsa-let-7c
2.43
0.00
hsa-miR-602
2.31
0.00
hsa-miR-548e
2.31
0.03
hsa-miR-32
2.27
0.04
hsa-miR-181a
2.24
0.02
hsa-miR-7
2.13
0.00
hsa-miR-21*
2.06
0.00
Underexpressed в IL-1 индуцируется-AGS клетки
микроРНК
вислоухая изменение
значение р
hsa-miR-143
0.06
0.02
hsa-miR-200
0.08
0.01
hsa-miR-451
0.13
0.01
hsa-miR-144
0.17
0.00
hsa-miR-363
0.20
0.01
hsa-miR-637
0.25
0.03
hsa-miR-153
0.39
0.01
hsa-miR-139
0.39
0.00
hsa-miR-617
0.42
0.01
hsa-miR-1915
0.43
0.00
hsa-miRPlus-F1153
0.45
0.00
hsa-miR-381
0.46
0.00
hsa-miR-145
0.47
0.02
hsa-miR-659
0.47
0.03
hsa-miR-125b
0.48
0.00
hsa-miR-183*
0.49
0.00
hsa-miR-638
0.49
0.01
*: Когда два зрелых микроРНК происходят из противоположных рук одного и того же предварительно микроРНК, звездочкой после имени указывает микроРНК экспрессируется на низких уровнях по отношению к микроРНК в противоположном плече шпильке
Среди этих микроРНК, зер-. 425 был наиболее высоко повышающей регуляции при индукции IL-1. Использование в режиме реального времени ПЦР-анализа, мы проанализировали экспрессию микроРНК-425 в 36 парных образцах (опухоли и прилегающих к ним нормальных тканей от того же самого пациента). Мы обнаружили значительно более высокий уровень экспрессии микроРНК-425 в образцах опухолей по сравнению с уровнями в соседних нормальных тканях (р
&л; 0,0001) (рис 1B). Мы исследовали уровень экспрессии микроРНК-425 в наборе желудочных линий раковых клеток и шести нормальных желудочных клеток слизистой оболочки. Как показано на рисунке 1С, мы подобрали клетки AGS с понижением регулируемой микроРНК-425 и клетки NCI-N87 с повышающей регуляции MIR-425 для дальнейшего изучения. Хотя активация MIR-425 было сообщено, чтобы иметь существенное влияние на инициации рака и прогрессирование раковых клеток путем снижения экспрессии разветвленной сети генов [15], роль микроРНК-425 в злокачественных опухолях человека не выяснен , . Поэтому мы выбрали MIR-425 для дальнейшего расследования
Экспрессия PTEN негативно регулируется с помощью микроРНК-425
Для определения целей MIR-425, мы использовали обычно используемый алгоритм, miRecords (HTTP: //mirecords . biolead. орг /), которая представляет собой интегрированный ресурс для животных микроРНК-мишеней взаимодействий. Для повышения точности этого прогноза, генов, которые были предсказаны по крайней мере пяти из одиннадцати баз данных (Diana, microinspector, Miranda, mirtarget2, mitarget, nbmirtar, pictar, лаваша, rna22, rnahybrid и TargetScan) были выбраны в качестве предполагаемых целей. Среди этих предполагаемых мишеней микроРНК-425, анализ генов Онтология показал, что уровни экспрессии 9 генов-кандидатов были изменены; Таким образом, это изменение может внести свой вклад в злокачественный фенотип. Используя 3 'UTR люциферазы анализы, мы обнаружили, что избыточная экспрессия микроРНК-425 значительно ингибирует активность люциферазы в клетках HEK293 и клетках AGS, экспрессирующих дикого типа PTEN 3' UTR репортер (рис 2A). Мы подтвердили, что PTEN является предполагаемым непосредственным объектом MIR-425. Чтобы проиллюстрировать специфичность MIR-425, мы показали, что анти-микроРНК-425 специально отменили ингибирование активности люциферазы, вызванной микроРНК-425 в клетках HEK293 и клетках NCI-N87 (рис 2В). Мутации в сайтах связывания микроРНК (рис 2С) оказали конструкции, не реагирующей на микроРНК-425 индукции (рис 2D), дополнительно подтверждая, что ген PTEN является прямой мишенью MIR-425. Рисунок 2 микроРНК-425 непосредственно цели PTEN. (А) Анализ репортер в клетках НЕК293, и клетки AGS, трансфицированных MIR-425 и конструкций, несущих люциферазы кДНК, слитый с 3'-НТО прогнозируемых целевых кандидатов (среднее ± SEM). (Б) Эффекты анти-MIR-425 на активность люциферазы люциферазы конструктов слит с 3'-НТО из PTEN в НЕК293 клетках и клетках NCI-N87 (среднее ± SEM). (C, D) Репортер анализа в клетках HEK293 и клетки AGS, трансфицированных люциферазы конструкций, несущих PTEN 3 'НТО с мутациями в микроРНК-425-связывающих сайтов (среднее ± SEM). (E) HEK293 клетки и клетки AGS трансфицировали люциферазы конструкцией, несущей дикого типа PTEN 3 'UTR (LUC-WT), или конструкции с наследственными мутациями PTEN 3' UTR (LUC-Мут). Через 24 ч клетки обрабатывали IL-1, и активность люциферазы количественно оценивали через 24 ч после обработки. (F), Вестерн-блот и RT-PCR, показывающий уровни белка PTEN и уровни мРНК в клетках AGS после 48 ч микроРНК-425 трансфекцией. (G) AGS клетки трансфицировали анти-MIR-425, и через 24 часа, клетки либо его не лечить или лечить с IL-1, а затем собирают через 24 ч после обработки. Цельные клеточные лизаты иммуноблоттинг с антителами PTEN. Клетки (Н) NCI-N87 трансфицировали с анти-MIR-425 и собирают через 24 ч после обработки. Цельные клеточные лизаты иммуноблоттинг с антителами PTEN. (I) AGS клетки трансфицировали плазмидой, несущей только открытую последовательность рамки считывания (PTEN PTEN-CDS). Через 24 ч клетки обрабатывали IL-1 или MIR-425. Цельные клеточные лизаты подвергали иммуноблоттинга после 24 часов лечения. (* Р &л; 0,05; ** р &л; 0,01; *** р &л; 0,001)
Кроме того, мутация микроРНК-425 последовательности-мишени также значительно ослабляется IL-1β-индуцированной репрессии против УТР PTEN 3 '. репортер активности люциферазы в клетках HEK293 и клетках AGS (рис 2E). Сверхэкспрессия MIR-425 было достаточно для экспрессии PTEN подавляют на обоих белков и уровней мРНК в клетках AGS (рис 2F). Соответственно, IL-1β-индуцированной PTEN репрессии спасли выражения анти-MIR-425 в AGS клетках (рис 2G). Анти-микроРНК-425 был в состоянии до регулировать экспрессию PTEN в клетках NCI-N87 без IL-1 стимуляции (рис 2H).
Наши данные также показали, что 3 'UTR необходима для микроРНК-425-опосредованной PTEN понижающей потому что экспрессия PTEN кодирующей области конструкции (PTEN-СДУ) был нечувствителен к микроРНК-425 и избыточной экспрессии IL-1 индукции в клетках AGS (рис 2i). Взятые вместе, эти результаты указывают на то, что микроРНК-425 играет решающую роль в подавлении экспрессии PTEN путем пристреливать его 3'-UTR на IL-1 индукции.
IL-1β-индуцированной активации NF-kappaB необходима для микроРНК-425 индукции
Для того, чтобы определить механизм, участвующих в микроРНК-425 трансактивацией при IL-1 индукции, мы исследовали влияние различных ингибиторов киназ на микроРНК-425 в индукции IL-1β-обработанных клетках AGS. IL-1β-индуцированных микроРНК-425 был значительно повышающей регуляцией ингибируется ингибитором IKK TPCA-1, но не по р38 МАРК ингибитором BIX02188 или ингибитором JNK SP600125 (рис 3A). Предыдущие исследования показали, что ИКК является существенной киназа необходима для передачи сигналов NF-kappaB; Таким образом, этот результат указывает на критическую роль передачи сигналов NF-kappaB в регулировании микроРНК-425 транскрипции при индукции IL-1. Рисунок 3 активации IKK необходим для индукции MIR-425 в ответ на индукцию IL-1. (A) AGS клетки обрабатывали IL-1 в присутствии ингибитора IKK TPCA-1, р38 МАРК ингибитор BIX02188 и ингибитор JNK SP600125. выражение Зрелые микроРНК-425 в течение 12 ч после обработки определяли количественно с помощью ПЦР в реальном времени. Складка изменение относительной экспрессии микроРНК-425 (MIR-425 /U6) нормализовалось, наблюдаемому в PBS-обработанных клетках. (В) Выражение первичного MIR-425 (ИРП-микроРНК-425) анализировали с помощью ПЦР в реальном времени, как в A. (C) уровни экспрессии белка NF-kappaB и-425-ИРП микроРНК были проанализированы в реальном масштабе время ПЦР в AGS клетках, обработанных миРНК для NF-kappaB. (D) AGS клетки обрабатывали ингибиторами химии или киРНК для NF-kappaB. Клеточные лизаты были получены через 24 ч после того, как IL-1 и лечения иммуноблоттинг с антителами PTEN. (Е) Вестерн-блот-анализ фосфорилированного NF-kappaB p65 (серин-536). (F) Уровни экспрессии белка NF-kappaB и ИРП-микроРНК-425 анализировали с помощью ПЦР в реальном времени в клетках NCI-N87, обработанных киРНК для NF-kappaB. (* Р ≪ 0,05; ** р ≪ 0,01; *** р &л; 0,001).
Последовательно, индукция Pri-MIR-425 на ИЛ-1 β лечение было заметно ингибируется в присутствии ингибитора IKK или миРНК для NF-kappaB (рис 3B и C). Мы также отметили, что ИЛ-1β-индуцированной PTEN репрессии затухает в присутствии ингибитора IKK или киРНК для NF-kappaB (рис 3D). Для того, чтобы определить, была ли активность NF-kappaB присутствует в AGS клетках, обработанных IL-1, мы использовали вестерн-блот для определения уровня фосфорилированного NF-kappaB p65 (серин-536). Уровень фосфорилированного NF-kappaB p65 (серин-536) была высокой в ​​AGS клетках, обработанных IL-1 (10 нг /мл; 24 ч) (рис 3Е). Кроме того, глушение NF-kappaB ингибирует экспрессию микроРНК-425 в клетках NCI-N87 без IL-1 обработки (рис 3F). Эти результаты предполагая, что IKK-зависимой активации NF-kappaB при обработке IL-1 необходим для PTEN понижающей, скорее всего, через его усиления микроРНК-425 транскрипции.
Чтобы определить непосредственно регулирует ли NF-kappaB микроРНК-425 транскрипции, мы Проанализировав вверх по течению последовательности микроРНК-425, используя библиотеку WeightMatrix (matrixTFP60.lib) и определили три потенциальных сайтов связывания NF-kappaB в промоторной области микроРНК-425 (отсекателей: матрица подобия = 0,9 и ядро ​​подобия = 0,95) ( Рисунок 4A). Мы провели иммунопреципитации хроматина (CHIP) анализы с AGS раковых клеток с использованием моноклональных антител анти-NF-kappaB. Как показано на фиг.4В, только праймер-В MIR-425 производства сильных продуктов ПЦР, которые предположили, что белок NF-kappaB образование комплексов с сайтом связывания B в промоторе микроРНК-425. Результаты анализов люциферазы предположил, что сайт связывания потенциал Б в промоторе микроРНК-425 необходим для трансактивации гена вниз по течению при IL-1 β индукции (рис 4A и C). Рисунок 4 NF-kappaB сайты связывания в промоторе микроРНК-425. (А) Особенности микроРНК-425 5 'фланкирующей ДНК. Человеческие регионы промоутер MIR-425 содержит три предполагаемых сайтов связывания NF-kappaB. (B) Древесностружечные анализы с анти-NF-kappaB антител показали связывание NF-kappaB с промотором MIR-425 в AGS клетках. Относительные заселенности NF-kappaB обозначены как вертикальными черточками. Гистограммы показывают средние значения трех независимых экспериментов микросхеме. (C) промотор микроРНК-425 был активирован NF-kappaB. AGS клетки обрабатывали NF-kappaB и трансфицировали с указанными векторами LUC.
Индукция микроРНК-425 способствует выживанию клеток при IL-1 индукции
Было показано, что PTEN является одним из наиболее часто инактивированных генов-супрессоров опухолей. Избыточная экспрессия PTEN в различных клетках млекопитающих для тканевой культуры влияет на различные процессы, включая пролиферацию клеток, гибель клеток и миграции клеток [16]. Мы также обнаружили, что ингибирование PTEN, уменьшало активацию каспазы-3 в клетках, обработанных IL-1 (рис 5А). Вполне вероятно, что микроРНК-425 индукция может ингибировать апоптоз посредством понижающей регуляции PTEN в IL-1, обработанных клеток. В самом деле, избыточная экспрессия микроРНК-425 ингибировал активацию каспазы-3 в цисплатин обработанных AGS клеток (рис 5B). К тому же, в цисплатин обработанных клетках AGS, Котрансфекция конструкта, содержащего только кодирующую область PTEN (PTEN-CDS), которая нечувствительна к MIR-425, обошли антиапоптический эффект микроРНК-425 сверхэкспрессии (5С). Соответственно, трансфекция анти-MIR-425 в клетках AGS значительно усиливается активация каспазы-3 и апоптоз в ответ на IL-1 лечения (рис 5D). Кроме того, трансфекция анти-MIR-425 в клетках NCI-N87 значительно усиливается активация каспазы-3 и апоптоз без IL-1 стимуляции (рис 5E). Рисунок 5 микроРНК-425 ингибирует апоптоз клеток, подавляя PTEN. (А). клетки AGS обрабатывали контролем (PBS) или IL-1. Через 48 ч, были иммуноблоттинг лизаты целых клеток. (В). Клетки AGS были трансфицированы с отрицательным контролем (MIR-NC) или MIR-425 в одиночку. Через 24 часа клетки обрабатывали с цисплатином и собирают через 24 ч после обработки. Цельные клеточные лизаты иммуноблоттинг. (С). клетки AGS трансфицировали MIR-NC, микроРНК-425, и PTEN-СДУ, как указано. Через 24 часа клетки обрабатывали с цисплатином и собирают через 24 ч после обработки. Скорость апоптоз клеток определяли с помощью метода проточной цитометрии. (D). клетки AGS трансфицировали MIR-NC или анти-MIR-425. Через 48 ч клетки обрабатывали IL-1 и собирают через 24 ч после обработки. Всего Клеточные лизаты иммуноблоттинг с указанными антителами, и скорость апоптоз клеток определяли с помощью метода проточной цитометрии. клетки (Е) NCI-N87 трансфицировали с MIR-NC или анти-MIR-425. Всего Клеточные лизаты иммуноблоттинг с указанными антителами, и скорость апоптоз клеток определяли с помощью метода проточной цитометрии.
В соответствии с его ролью в ингибировании активации каспазы, повышающая регуляция микроРНК-425, значительно усиленной пролиферации клеток АГС, в то время как про- эффект выживаемости был полностью блокирован котрансфекции с экзогенной PTEN (PTEN-СДУ) (фиг.6а). Анти-микроРНК-425 снизился процент пролиферирующих клеток для клеток NCI-N87 (рис 6б). Мы также обнаружили, что ингибирование PTEN имели защитный эффект, подобный тому, что наблюдается в клетках с гиперэкспрессией MIR-425 (рис 6в), предполагая, что PTEN репрессии могут играть важную роль в микроРНК-425-зависимой защиты в клетках, обработанных IL-1. Рисунок 6 микроРНК-425 способствует пролиферации клеток, подавляя PTEN. (A) AGS клетки обрабатывали PBS, IL-1, MIR-NC, микроРНК-425, и PTEN-СДУ, как указано. Через 72 ч, пролиферации клеток определяли с использованием набора для мечения Edu. клетки (B) NCI-N87 трансфицировали с MIR-NC или анти-MIR-425. Через 72 ч, скорость пролиферации клеток определяли с использованием набора для маркировки EDU. (C) AGS клетки обрабатывали миРНК-PTEN или MIR-425. Через 72 ч, пролиферации клеток определяли с использованием набора для мечения Edu. (D) Фотографии экспрессии белка PTEN в опухолевых тканях (верхние панели) и опухолей (нижние панели). (Е) График показывает массу 3 опухолей после 4-х недель (n = 3). (F), существенная обратная корреляция наблюдается между уровнями экспрессии микроРНК-425 и PTEN в желудочном раковых тканей (n = 52). (G) Уровни экспрессии PTEN определяются в шести нормальных клеток слизистой оболочки желудка и желудочных линий раковых клеток с помощью ПЦР в реальном времени. (H) Модель, иллюстрирующая предполагаемые роли IL-1 и микроРНК-425 в управления PTEN пути в желудочных клетках карциномы человека.
Мы исследовали влияние MIR-425 на туморогенности в естественных условиях. Опухоли, обработанные анти-MIR-425 показали увеличение уровней белка PTEN (рис 6D). Кроме того, анти-микроРНК-425 снижается вес опухоли у мышей по сравнению с микроРНК-NC-обработанной группе (рис 6е). Используя непараметрические тесты, мы обнаружили значительную обратную корреляцию между мРНК PTEN и экспрессии микроРНК-425 в образцах рака желудка (рис 6f). Уровни экспрессии PTEN были также определены в шести нормальных клеток слизистой оболочки желудка и желудочных линий раковых клеток с помощью ПЦР в реальном времени. Как показала практика, клетки с "вниз регулируется" MIR-425 имеют более высокие количества PTEN по сравнению с клеточными линиями с «вверх-регулируемых" MIR-425 уровней (рис 6G). В заключение, наши результаты показали, что микроРНК-425 играет причинную роль через нацеливание PTEN в желудочном видов рака.
Обсуждение
интерлейкин-1 (ИЛ-1) является одним из основных провоспалительных цитокинов, который вырабатывается злокачественными или микросреды клетки [17]. IL-1 также функционирует как плейотропному цитокин, участвующий в туморогенез и опухолевой инвазии; Поэтому, она представляет собой осуществимый кандидата на модулирующее цитокин, который может наклонить баланс между воспалением и невосприимчивость к индукции ответов противоопухолевых [18]. IL-1α и IL-1β являются основными агонистами IL-1. В своих секретируемых формах, IL-1 α и IL-1β связываются с теми же рецепторами и вызывают одни и те же биологические функции [19]. Тем не менее, IL-1α и IL-1β различаются по компартментализацией внутри клетки или микроокружения [20]. IL-1β активен только в секретируемой форме и опосредует воспаление, которое способствует канцерогенеза, опухолевой инвазивности и иммуносупрессии [21]. Некоторые новые анти-IL-1 β агенты были использованы в клинических исследованиях у пациентов, демонстрирующих различные заболевания с воспалительными проявлениями [22]. Лучшее понимание интегративной роли IL-1β сигнальных путей в злокачественного процесса позволит применение новой модуляции IL-1 приближается у онкологических больных.
PTEN был обнаружен в качестве важного супрессоров опухоли, которая часто мутировал или утраченного в различные виды рака [23]. Несколько линий доказательств выделили PTEN в качестве липидной фосфатазы, который гидролизует фосфат 3 'в фосфоинозитидов [24]. PTEN, может также регулировать активность серин /треонин киназы РКВ /Akt и может, таким образом, влиять на выживаемость клеток сигнализации [25]. Ультрафиолетовое облучение может вызвать PTEN взаимодействие с вариантами рецепторов дикого типа меланокортина-1, который защищает PTEN от WWP2-опосредованной деградации, что приводит к инактивации AKT в меланоме [26]. Есть несколько механизмов для регулирования PTEN, включая транскрипции, стабильность мРНК, микроРНК адресности, перевод и стабильности белка. PTEN транскрипционно подавляются метилирования промоторов в желудочном карциномы [27]. PTEN также может быть посттрансляционно регулируется ацетилирование, убиквитилирования, окисления, фосфорилирования и внутриклеточной локализации [28]. Несмотря на обширные характеристики PTEN мутации в злокачественных опухолях человека и относительно хорошее понимание молекулярных ролей PTEN в контроле клеточных процессов, мало известно о режимах регулирования PTEN.
PTEN, может быть подавлена ​​в раковых клетках при индукции провоспалительных цитокинов IL-1β [29]. Стимуляция IL-1 активирует NF-kappaB с помощью фосфорилирования и деградации IκB. Эта активация позволяет NF-kappaB к транслокации в ядро ​​и транскрипционно активации генов-мишеней [30]. NF-kappaB представляет собой гетеродимер активатора транскрипции, состоящий из ДНК-связывающего субъединицы р50 и р65 трансактивации субъединиц [31]. Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи.
Авторов оригинальные представленные файлы для изображений изображения Ниже приведены ссылки на авторов оригинальных представленных файлов для изображений , Все авторы читали и одобрили окончательный вариант рукописи.

• Влияние IL17A полиморфизмов на аберрантных метилирования DAPK и CDH1 в нераковая слизистую оболочку желудка
• Необычный trichobezoar желудка и кишечника: доклад случай