NF-kappaB avhengig mikroRNA-425 oppregulering fremmer magekreft cellevekst ved å målrette PTEN på IL-1β induction

NF-kappaB avhengig mikroRNA-425 oppregulering fremmer magekreft cellevekst ved å målrette PTEN på IL-1β induksjon
Abstract
Overekspresjon av den proinflammatoriske cytokin IL-1β er assosiert med forskjellige sykdommer, inkludert kreft. Endring av microRNAs er blitt observert i kreftceller eksponert for proinflammatoriske cytokiner, men deres funksjon i betennelse spenning fortsatt ukjent. Her viser vi at IL-1β induserer oppregulering av MIR-425, noe som negativt regulerer fosfatase og tensin homolog uttrykk ved å målrette sin 3 'UTR. En økning i MIR-425 er avhengig av IL-1β-indusert NF-kappaB aktivering, noe som forbedrer MIR-425 gentranskripsjon på IL-1β induksjon. Følgelig undertrykkelse av fosfatase og tensin homolog av MIR-425 fremmer gastrisk cancer celleproliferasjon, som er nødvendig for å beskytte celler fra cisplatin-indusert apoptose. Til sammen våre data støtter en avgjørende rolle for NF-kappaB-avhengig oppregulering av MIR-425, som representerer en ny vei for undertrykkelse av fosfatase og tensin homolog aktivering og fremme celleoverlevelse på IL-1β induksjon.
nøkkelord
IL-1β NF-kappaB MIR-425 PTEN Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP Bakgrunn
Gastric adenokarsinom er den fjerde og femte vanligste kreftformen blant menn og kvinner, henholdsvis over hele verden og er sterkt knyttet til kronisk betennelse [1]. Det er nå vel akseptert at infeksjon med Helicobacter pylori plakater (H. pylori
) spiller en viktig rolle i å utløse kronisk betennelse fører til malignitet [2]. Kronisk betennelse i magen starter histopatologiske progresjon av kronisk gastritt til gastrisk atrofi, intestinal metaplasi og til slutt magekreft [3]. Mens H. pylori
infeksjon er svært utbredt, er det bare et lite mindretall (ca. 1%) av infiserte individer utvikle magekreft etter mange år. Den variable respons på denne felles patogen ser ut til å bli styrt av en genetisk predisposisjon for høy uttrykk nivåer av proinflammatoriske cytokiner [4].
Nukleær faktor kappa B (NF-kappaB) veien har lenge vært ansett som en stor proinflammatoriske signalveien, i stor grad basert på aktivering av NF-kappaB av proinflammatoriske cytokiner og rollen til NF-kappaB i den transkripsjonelle aktivering av responsive gener inkludert cytokiner og kjemokiner [5]. Den "kanoniske" -veien for NF-kappaB aktivering er utløst av proinflammatoriske cytokiner slik som IL-1β og vanligvis fører til aktivering av rela- eller Crel-inneholdende komplekser [6]. NF-kappaB finnes i cytoplasma i en inaktiv form i forbindelse med regulatoriske proteiner referert til som inhibitorer av kB (IkB), hvorav de viktigste kan være IκBα, IκBβ, og IκBε. IκBα er forbundet med forbigående NF-kappaB aktivering, mens IκBβ er involvert i vedvarende aktivering [7]. Imidlertid er kronisk betennelse en kompleks fysiologisk prosess, og rollen til NF-kappaB i den inflammatoriske responsen har ennå ikke blitt fullt ut undersøkt.
I tillegg til å påvirke protein-kodende gen ekspresjon, betennelse spenning endres også ekspresjonsnivået av microRNAs (mirnas) [8]. MicroRNAs er en klasse av endogent, små, ikke-kodende RNA som negativt regulerer genekspresjon ved post-transkripsjonelle nivå hovedsakelig via binding til den 3'-utranslaterte region av et mål-mRNA, og de har viktige regulatoriske funksjoner i kontrollen av diverse fysiologiske og patologiske prosesser [9, 10]. Disse RNA-er er blitt vist å være involvert i reguleringen av mange cellulære prosesser som proliferasjon, differensiering og apoptose [11-13]. Men regulerer om kronisk betennelse miRNA uttrykket ved å modulere gentranskripsjon eller endre post-transcriptional modning er ikke fastslått.
I dette arbeidet har vi funnet at MIR-425 induksjon på IL-1β-indusert betennelser var avhengig av aktivering av NF-kappaB, som forbedret MIR-425 gentranskripsjon. Videre er oppregulert MIR-425 direkte rettet fosfatase og tensin homolog (PTEN) og negativt regulert sitt uttrykk, som fremmet celleoverlevelse på IL-1β induksjon.
Eksperimentelle prosedyrer
Etikk uttalelse
Alle prøver ble innhentet fra pasienter som gjennomgikk kirurgi ved Fudan University i Shanghai Cancer Center. Protokollen ble godkjent av Klinisk forskningsetiske komité for Fudan University, og forskningen ble utført i henhold til bestemmelsene i Helsinki-deklarasjonen av 1975. tilstøtende normalt vev ble skåret vekk fra magekreft lesjon makroskopisk, og deres histologiske diagnosen ble bekreftet mikroskopisk. Skriftlig informert samtykke ble oppnådd fra alle deltakere er involvert i studiet.
Cellekultur og reagenser
humane embryonale nyrecellelinje HEK293 (ATCC® CRL-1573 ™), den humane brystkreftcellelinjen MDA-MB361 (ATCC ® HTB-27 ™), den menneskelige mage adenokarsinom cellelinje AGS (ATCC® CRL-1739 ™), SNU-en (ATCC® CRL-5971 ™), SNU-5 (ATCC® CRL-5973 ™), SNU-16 (ATCC® CRL- 5974 ™), Hs746T (ATCC® HTB-135 ™), ble NCI-N87 (ATCC® CRL-5822 ™), og KATO III (ATCC®HTB-103 ™) opprettholdt i DMEM inneholder 10% føtalt bovint serum. Alle cellelinjer ble opprettholdt i media inneholdende penicillin (100 IU /ml) og streptomycin (100 mg /ml) ved 37 ° C med 5% CO 2. Mirna ligner og anti-miRNA ble kjøpt fra Ambion (Austin, Texas, USA). Den IKK inhibitor TPCA-en (Cat. No. S2824), p38 MAPK inhibitor BIX02188 (kat. Nr S1574) og JNK inhibitor SP600125 (Cat. No. S1460) ble kjøpt fra Selleckchem (Houston, Texas, USA). Rekombinant humant IL-1β ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (kat. Nr H6291, Shanghai, Kina).
RNA ekstraksjon og real-time PCR
Total RNA ble ekstrahert fra celler ved hjelp TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA ). For mikroRNA analyse, ble poly (A) haler tilsatt til totalt RNA ved bruk av poly (A) polymerase (Ambion, Carlsbad, CA) før revers transkripsjon. Den MiRcute miRNA qPCR deteksjon kit (TIANGEN, Beijing, Kina) ble anvendt for å kvantifisere uttrykket nivåer moden MIR-425 i henhold til den vedlagte protokoll, og GAPDH ble anvendt som en intern kontroll. Real-time PCR ble utført under følgende betingelser: 95 ° C 10 m, en syklus; 95 ° C 10 s, 55 ° C 34 s, 40 sykluser.
For alle resultatene som oppnås ved real-time PCR-metoder, brukte vi Delta CT metode for å beregne ganger endring i genuttrykk mellom ulike grupper. Mengden av målet (PTEN /MIR-425), normalisert til den endogene husholdningsgenet GAPDH og i forhold til en referanseprøve, er gitt ved den følgende ligning:. Mengden av target = 2 - △△ CT
Immunoblotting
Proteinene ble separert på en 10% SDS-PAGE-gel og deretter overført til en PVDF-membran. Etter blokkering med 5% fettfri melk, ble membranen inkubert med et muse-monoklonalt anti-PTEN-antistoff (1: 500, Santa Cruz, sc-7974) og et NF-kappaB p65 Phospho (pS536) (RELA) antistoff (1: 10000 ., EPITOMICS, Cat #: 2220-1). IRdye merkede sekundære antistoffer ble brukt for kvantifisering av immunblot signal, og signalene ble analysert ved hjelp av en Odyssey scanner (LI-COR biovitenskap, Lincoln, NE, USA).
Luciferase assay
HEK293 celler og AGS cellene transfektert med MIR-425 og pGL3 luciferase reporter konstruerer husing Mir-425 mål sekvens. Etter 24 timer, ble virksomheten til ildflue luciferase og Renilla luciferase i cellelysatene målt med Dual-Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI, USA). For luciferase reporter transkripsjon analysen, MIR-425-genet promotersekvenser (WT eller reiser sletting) ble klonet inn i promoter-regionen til pGL3-Basic vektor, og luciferaseaktiviteten ble målt som beskrevet ovenfor.
Chromatin immunoutfelling (chip)
i korthet behandlede celler ble kryssbundet med 1% formaldehyd, skåret til en gjennomsnittlig størrelse på 400 bp, og deretter immunopresipitert med antistoffer mot NF-kappaB (Santa Cruz, sc-166 588). Chip-PCR primere ble designet for å forsterke promotorområdene inneholder antatte NF-kappaB bindingssteder innenfor MIR-425 som vist på bildet. En positiv kontrollantistoff (RNA-polymerase II) og en negativ kontroll, ikke-immun IgG ble benyttet for å demonstrere effektiviteten av reagenser (Epigentek Group Inc, P-2025-48). Immunopresipitert DNA blir så renset, frigjort, og eluert. Eluerte DNA som kan brukes til nedstrøms applikasjoner spon PCR. Fold anrikning (FE) ble beregnet ved å benytte et forhold på forsterkningsvirkningsgrad av brikken prøven over den ikke-immun IgG. Utvidelseseffektiviteten av polymerase RNA II ble anvendt som en positiv kontroll. FE% = 2 (IgG CT - Prøve CT). X 100%
celleproliferasjonsanalyse
En celle proliferasjonsanalyse ble utført ved å anvende Celletelling leder-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) ifølge produsentens instruksjoner. Før tilsetningen av CCK-8, ble cellene vasket med varmt kulturmedium ved å spinne platen ved 500 rpm i 3 minutter og deretter kaste supernatanten.
Celle apoptose assay
Kreftcellene ble høstet og resuspendert i 500 ul av en bindingsbuffer. Cellesuspensjonen (100 pl) ble inkubert med 5 pl annexin-V og propidiumjodid ved romtemperatur i 20 minutter. De fargede celler ble analysert med fluorescent-aktivert cellesortering (FACS) under anvendelse av BD LSR II strømningscytometri.
Cellesyklusanalyse
For strømningscytometri-analyse, ble cellene trypsinert og fiksert i 70% etanol over natten. Cellene ble deretter inkubert i 0,5 ml propidiumjodid oppløsning inneholdende 25 ug ml -1 RNase i 15 minutter ved 37 ° C og målt.
Muse eksperimenter
Den NCI-N87-celler (3 x 10 6) ble injisert inn i de riktige flankene av athymiske nu /nu mus. En uke etter injeksjonene, ble mus med svulster med tilsvarende dimensjoner ble behandlet i 4 uker med anti-MIR-425. Den anti-MIR-425 (2 nmol) ble injisert direkte inn i svulstene to ganger ukentlig i 4 uker.
Statistisk analyse
Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SEM, og dataene ble analysert med Student t-test. En verdi på p
< 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
IL-1β behandling induserer Mir-425 uttrykk
å karakterisere mirnas ansvarlige for IL-1β induksjon, profilert vi miRNA uttrykket i PBS-behandlede AGS celler og IL-1β indusert AGS celler ved hjelp av Exiqon miRCURY ™ LNA Array System (v.14.0). De miRNA nivåene varierte betydelig mellom de PBS-behandlede gruppen og den IL-1β-indusert gruppe, som illustrert i varmen kart er vist i Figur 1A. Blant de 1,891 oppfangingsprober, ble 46 mirnas forskjellig uttrykt i IL-1B-indusert AGS celler sammenlignet med sammenkoblede PBS-behandlede AGS celler; av disse mirnas, 29 ble økt og 17 ble redusert i IL-1 p-indusert AGS-celler (tabell 1), som indikerer at en spesifikk miRNA mønster er assosiert med IL-1β induksjon. Figur 1 feilregulering av miRNAs i humane AGS celler behandlet med IL-1β. (A) human AGS-celler ble behandlet med IL-1β (10 ng /ml) [14], og 24 timer senere, mirnas ekspresjonsprofilen ble analysert med mikromatriser. Heat kartet diagram generert av unsupervised clustering analyse med 46 vesentlig feilregulert miRNAs. Rødt indikerer oppregulering; grønn indikerer downregulation. (B) Økte nivåer av MIR-425 i 36 tumorprøver i forhold til deres nivå i passet tilstøtende normalt vev målt ved real-time PCR. Normal: tilstøtende normalt vev. (C) Expression nivå av MIR-425 ble undersøkt ved real-time PCR i flere magekreft cellelinjer og seks normale mageslimhinnen celler.
Tabell 1 Betydelig feilregulering av miRNAs
overexpressed i IL-1B indusert-AGS celler
miRNA
Brett endring
p-verdi
HSA-MIR-425
12.36
0,00
hsa-miR-584
11.03
0.01
hsa-miR-31
8.12
0.00
hsa-miR-155
6.22
0.00
hsa-let-7i
5.55
0.00
hsa-miR-21
5.11
0.00
hsa-miR-335
4.89
0.01
hsa-miR-191
4.73
0.03
hsa-miR-519d
4.37
0.02
hsa-miR-520d-5p
3,95
0.00
hsa-miR-331
3.67
0.01
hsa-miR-142
3.45
0.01
hsa-miR-518a-5p
3.28
0.01
hsa-miRPlus-F1231
3.11
0.01
hsa-miR-2113
2.94
0.02
hsa-miR-196a*
2.88
0.02
hsa-miR-1304
2.78
0.02
hsa-miR-185
2.65
0.01
hsa-let-7a
2.61
0.00
hsa-miR-130
2.52
0.02
hsa-miR-1280
2.50
0.01
hsa-miR-222
2.47
0.01
hsa-let-7c
2.43
0.00
hsa-miR-602
2.31
0.00
hsa-miR-548e
2.31
0.03
hsa-miR-32
2.27
0.04
hsa-miR-181a
2.24
0.02
hsa-miR-7
2.13
0.00
hsa-miR-21*
2.06
0.00
Underexpressed i IL-1B indusert-AGS celler
miRNA
Fold endring
p-verdi
hsa-miR-143
0.06
0.02
hsa-miR-200
0.08
0.01
hsa-miR-451
0.13
0.01
hsa-miR-144
0.17
0.00
hsa-miR-363
0.20
0.01
hsa-miR-637
0.25
0.03
hsa-miR-153
0.39
0.01
hsa-miR-139
0.39
0.00
hsa-miR-617
0.42
0.01
hsa-miR-1915
0.43
0.00
hsa-miRPlus-F1153
0.45
0.00
hsa-miR-381
0.46
0.00
hsa-miR-145
0.47
0.02
hsa-miR-659
0.47
0.03
hsa-miR-125b
0.48
0.00
hsa-miR-183*
0.49
0.00
hsa-miR-638
0.49
0.01
*: Når to modne mirnas stammer fra motsatte armer av samme pre-miRNA, en stjerne etter navnet indikerer en miRNA uttrykt ved lave nivåer i forhold til den miRNA i den motsatte arm av en hårnål
Blant disse mirnas, speil. 425 er den mest oppregulert på IL-1β induksjon. Ved hjelp av real-time PCR-analyse, analyserte vi Mir-425 uttrykk i 36 parvise prøver (svulst og nærliggende normalt vev fra samme pasient). Vi har funnet et signifikant høyere nivå av MIR-425-ekspresjon i tumorprøvene i forhold til nivåene i de tilstøtende normale vev (p
< 0,0001) (figur 1B). Vi undersøkte ekspresjonsnivået av MIR-425 i et sett av magecancercellelinjer og seks normal gastrisk mucosa-celler. Som vist i figur 1C, vi plukket opp AGS celler med nedregulert MIR-425 og NCI-N87 celler med oppregulert MIR-425 for videre studier. Selv om aktivering av MIR-425 er blitt rapportert å ha en fundamental virkning på kreft initiering og progresjon av kreft celler ved å redusere ekspresjonen av et omfattende nettverk av gener [15], rollen til mir-425 i humane kreftformer er ikke utredet . . Vi valgte derfor MIR-425 for videre undersøkelser
Uttrykk av PTEN er negativt regulert av MIR-425
å identifisere målene MIR-425, ansatt vi brukte algoritmen, miRecords (http: //mirecords . biolead. org /), som er en integrert ressurs for dyre miRNA-målet interaksjoner. For å øke nøyaktigheten av denne spådommen, gener som ble spådd av minst fem av elleve databaser (Diana, microinspector, miranda, mirtarget2, mitarget, nbmirtar, pictar, pita, rna22, rnahybrid og targetscan) ble valgt som mulige mål. Blant disse antatte målene for MIR-425, genet ontologi analyse viste at uttrykket nivåer av 9 kandidat gener ble endret; således, kan denne endring bidrar til ondartet fenotype. Ved hjelp av 3 'UTR luciferase reporter analyser, fant vi at overekspresjon av MIR-425 signifikant hemmet luciferase aktivitet i HEK293 celler og AGS celler som uttrykker villtype PTEN 3' UTR reporter (figur 2A). Vi bekreftet at PTEN er en antatt direkte mål på MIR-425. For å illustrere spesifisitet av MIR-425, viste vi at anti-MIR-425 spesielt avskaffet hemming av luciferase aktivitet indusert av MIR-425 i HEK293 celler og NCI-N87 celler (figur 2B). Mutasjoner i miRNA bindingssteder (figur 2C) gjengis konstruksjonene som ikke reagerer på MIR-425 induksjon (figur 2D), ytterligere bekrefter at PTEN genet er et direkte mål på MIR-425. Figur 2 MIR-425 direkte rettet mot PTEN. (A) Reporter assay i HEK293-celler og AGS-celler transfektert med MIR-425 og konstruksjoner som bærer luciferase cDNA fusjonert til 3'-UTR av predikerte kandidat mål (gjennomsnitt ± SEM). (B) Effekt av anti-MIR-425 på luciferaseaktiviteten av luciferase konstruksjoner smeltet sammen med de 3 'UTR av PTEN i HEK293-celler og NCI-N87-celler (gjennomsnitt ± SEM). (C, D) Reporter assay i HEK293-celler og AGS-celler transfektert med luciferase-konstruksjoner som bærer PTEN 3 'UTR med mutasjoner i MIR-425-bindingsseter (gjennomsnitt ± SEM). (E) HEK293 celler og AGS celler ble transfektert med en luciferase konstruksjon bærer villtype PTEN 3 'UTR (LUC-WT) eller en konstruksjon som bærer et mutert PTEN 3' UTR (LUC-Mut). Etter 24 timer ble cellene behandlet med IL-1β, og luciferaseaktiviteten ble kvantifisert 24 timer etter behandling. (F) Western blot og RT-PCR viser PTEN protein nivåer og mRNA nivåer i AGS celler etter 48 h av MIR-425 transfeksjon. (G) AGS-celler ble transfektert med anti-MIR-425, og 24 timer senere ble cellene var enten ubehandlet eller behandlet med IL-1β og deretter høstet 24 timer etter behandling. Helcellelysater ble immunoblottet med PTEN antistoffer. (H) NCI-N87-celler ble transfektert med anti-MIR-425 og høstet 24 timer etter behandling. Helcellelysater ble immunoblottet med PTEN antistoffer. (I) AGS-celler ble transfektert med et plasmid som bærer bare den åpne leseramme sekvens av PTEN (PTEN-CDS). Etter 24 timer ble cellene behandlet med IL-1β eller MIR-425. Helcellelysater ble utsatt for immunblotting etter 24 timers behandling. (* P < 0,05, ** p < 0,01; *** p < 0,001)
Videre mutasjon av MIR-425 målsekvens også betydelig svekket IL-1β-indusert undertrykkelse av PTEN 3 'UTR. luciferase reporter aktivitet i HEK293 celler og AGS celler (figur 2E). Overekspresjon av MIR-425 var tilstrekkelig til å nedregulere PTEN uttrykk på både protein og mRNA nivåer i AGS celler (figur 2F). Følgelig ble IL-1β-indusert PTEN undertrykkelse reddet ved å uttrykke anti-MIR-425 i AGS celler (figur 2G). Anti-MIR-425 var i stand til å opp-regulere PTEN uttrykk i NCI-N87 celler uten IL-1β stimulering (figur 2 H).
Våre data viste også at 3 'UTR er nødvendig for MIR-425-mediert PTEN downregulation fordi uttrykk for en PTEN kodende region konstruksjon (PTEN-CDS) var ufølsom for MIR-425 overekspresjon og IL-1β induksjon i AGS celler (Figur 2i). Samlet utgjør disse resultatene indikerer at MIR-425 spiller en avgjørende rolle i å undertrykke PTEN uttrykk ved å målrette sin 3 'UTR på IL-1β induksjon.
IL-1β-indusert NF-kappaB aktivering er nødvendig for MIR-425 induksjon
for å bestemme mekanismen involvert i MIR-425 trans på IL-1β induksjon, undersøkte vi effekten av ulike kinase hemmere på MIR-425 induksjon i IL-1β-behandlede AGS celler. IL-1β-indusert MIR-425 oppregulering ble betydelig hemmet av IKK inhibitor TPCA-1, men ikke med p38 MAPK inhibitoren BIX02188 eller JNK-inhibitor SP600125 (figur 3A). Tidligere studier har vist at IKK er en viktig kinase som kreves for NF-kappaB signalering; Derfor, dette resultatet indikerte den viktige rollen av NF-kappaB signalering i reguleringen av MIR-425 transkripsjon ved IL-1β induksjon. Figur 3 ikk aktivering er nødvendig for induksjon av MIR-425 i respons til IL-1β induksjon. (A) AGS-celler ble behandlet med IL-1β i nærvær av IKK inhibitor TPCA-1, p38 MAPK-inhibitor BIX02188 og JNK-inhibitor SP600125. Moden MIR-425 uttrykk på 12 timer etter behandling ble kvantifisert ved real-time PCR. Fold endring av relative Mir-425 uttrykk (MIR-425 /U6) ble normalisert til den som ble observert i PBS-behandlede celler. (B) Ekspresjon av primære MIR-425 (pri-MIR-425) ble analysert ved hjelp av sanntids-PCR som i A. (C) Et uttrykk nivåer av NF-kappaB protein og pri-MIR-425 ble analysert ved hjelp av real- time PCR i AGS celler behandlet med sirnas for NF-kappaB. (D) AGS celler ble behandlet med kjemi-hemmere eller siRNAs for NF-kappaB. Cellelysater ble oppnådd 24 timer etter IL-1β behandling og immunoblottet med PTEN antistoffer. (E) Western blot-analyse av fosforylert NF-kappaB p65 (serin 536). (F) Uttrykket nivåer av NF-kappaB protein og pri-MIR-425 ble analysert ved real-time PCR i NCI-N87 celler behandlet med sirnas for NF-kappaB. (* P < 0,05, ** p < 0,01; *** p < 0,001).
Jevnt, induksjon av pri-MIR-425 ved IL-1β behandling var bemerkelsesverdig hemmet i nærvær av IKK-inhibitoren eller sirnas for NF-kappaB (figur 3B og C). Vi observerte også at IL-1β-indusert undertrykkelse PTEN ble svekket i nærvær av IKK-inhibitor eller sirnas for NF-kappaB (figur 3D). For å bestemme hvorvidt NF-kappaB aktivitet var til stede i AGS-celler behandlet med IL-1β det benyttet en western blot for å bestemme nivået av fosforylert NF-kappaB p65 (serin 536). Nivået av fosforylert NF-kappaB p65 (serin 536) var høy i AGS-celler behandlet med IL-1 p (10 ng /ml; 24 timer) (figur 3E). I tillegg stanse av NF-kappaB hemmet Mir-425 uttrykk i NCI-N87 celler uten IL-1β behandling (figur 3F). Disse resultatene tyder på at IKK-avhengig NF-kappaB aktivering på IL-1β behandling er nødvendig for PTEN downregulation, mest sannsynlig via sin forbedring av MIR-425 transkripsjon.
Å avgjøre om NF-kappaB direkte regulerer MIR-425 transkripsjon, vi analysert oppstrøms sekvenser av MIR-425 ved hjelp av WeightMatrix biblioteket (matrixTFP60.lib) og identifisert tre mulige NF-kappaB bindingssteder i promoter-regionen i MIR-425 (avskjær: matrix likheten = 0,9 og kjerne likheten = 0,95) ( Figur 4A). Vi utførte kromatin immunoprecipitation (chip) analyser med AGS kreftceller ved hjelp av monoklonale anti-NF-kappaB antistoffer. Som vist i figur 4B, bare primer-B av MIR-425 produsert sterke PCR-produkter, noe som antydet at NF-kappaB protein dannet komplekser med B-bindingsstedet i det MIR-425-promoteren. Resultatene av luciferase reporter analyser antydet at potensialet B bindingssetet i MIR-425-promoteren er nødvendig for transaktivering av nedstrømsgenet på IL-1β induksjon (figur 4A og C). Figur 4 NF-kappaB bindingssteder i MIR-425 promoter. (A) Funksjoner av MIR-425 5-flankerende DNA. Menneske promoter regioner av MIR-425 inneholder tre mulige bindingssteder for NF-kappaB. (B) Chip analyser med anti-NF-kappaB antistoffer viste binding av NF-kappaB til arrangøren av MIR-425 i AGS celler. De relative occupancies av NF-kappaB er angitt som vertikale streker. Baren kurver viser gjennomsnitt av tre uavhengige chip eksperimenter. (C) Arrangøren av MIR-425 ble aktivert av NF-kappaB. AGS celler ble behandlet med NF-kappaB og transfektert med de indikerte LUC vektorer.
Induksjon av MIR-425 fremmer celleoverlevelse på IL-1β induksjon
Det ble vist at PTEN er blant de hyppigst inaktiv tumorsuppressorgener. Overekspresjon av PTEN i forskjellige pattedyr vevskulturceller påvirker ulike prosesser, inkludert celleproliferasjon, celledød og cellevandring [16]. Vi har også funnet at inhibering PTEN redusert aktiveringen av caspase-3-celler behandlet med IL-1β (figur 5A). Det er sannsynlig at MIR-425 induksjon kan hemme apoptose via nedregulering av PTEN i IL-1B-behandlede celler. Faktisk overekspresjon av MIR-425 hemmet caspase-3-aktivering i cisplatin-behandlede AGS celler (figur 5B). Videre, i cisplatin-behandlede AGS-celler, kotransfeksjon av en konstruksjon inneholdende bare PTEN-kodende region (CDS PTEN-), som er ufølsom for MIR-425, forbigått antiapoptotic effekten av MIR-425 overekspresjon (figur 5C). Følgelig transfeksjon av anti-MIR-425 i AGS-celler i betydelig grad forbedret kaspase-3 aktivering og apoptose i respons til IL-1β behandling (figur 5D). I tillegg transfeksjon av anti-MIR-425 i NCI-N87-celler signifikant forbedret kaspase-3 aktivering og apoptose uten IL-1β stimulering (figur 5E). Figur 5 MIR-425 hemmer celle apoptose ved å undertrykke PTEN. (EN). AGS-celler ble behandlet med kontroll (PBS) eller IL-1β. Etter 48 timer ble helcellelysater immunoblottet. (B). AGS celler ble transient transfektert med negativ kontroll (MIR-NC) eller MIR-425 alene. Etter 24 timer ble cellene behandlet med cisplatin og høstet 24 timer etter behandling. Helcellelysater ble immunoblottet. (C). AGS celler ble transfektert med MIR-NC, MIR-425, og PTEN-CDS som angitt. Etter 24 timer ble cellene behandlet med cisplatin og høstet 24 timer etter behandling. Den celle apoptose Hastigheten ble bestemt ved anvendelse av strømningscytometri-metoden. (D). AGS celler ble transfektert med MIR-NC eller anti-MIR-425. Etter 48 timer ble cellene behandlet med IL-1β og høstet 24 timer etter behandling. Totale cellelysater ble immunoblottet med de angitte antistoffer, og celle apoptose hastigheten ble bestemt ved anvendelse av strømningscytometri-metoden. (E) NCI-N87 celler ble transfektert med MIR-NC eller anti-MIR-425. Totale cellelysater ble immunoblottet med de angitte antistoffer, og celle apoptose hastigheten ble bestemt ved anvendelse av strømningscytometri-metoden.
I samsvar med dens rolle ved inhibering av kaspase-aktivering, oppregulering av MIR-425 vesentlig forbedret AGS celleproliferasjon, mens pro- overlevelse effekt ble fullstendig blokkert av co-transfeksjon med eksogen PTEN (PTEN-CDS) (Figur 6A). Anti-MIR-425 reduserte andelen av prolifererende celler for NCI-N87-celler (Figur 6B). Vi fant også at å hemme PTEN hadde en beskyttende effekt som ligner den som ble observert i celler som overuttrykker MIR-425 (figur 6C), noe som tyder på at PTEN undertrykkelse kan spille en viktig rolle i MIR-425-avhengige beskyttelse i celler behandlet med IL-1β. Figur 6 MIR-425 fremmer celle spredning av undertrykke PTEN. (A) AGS celler ble behandlet med PBS, IL-1β, MIR-NC, MIR-425, og PTEN-CDS som angitt. Etter 72 timer ble celleproliferasjon bestemmes ved hjelp av Edu merking kit. (B) NCI-N87 celler ble transfektert med MIR-NC eller anti-MIR-425. Etter 72 timer ble celleformeringshastigheten bestemmes ved hjelp av EDU merkingskit. (C) AGS celler ble behandlet med siRNA-PTEN eller MIR-425. Etter 72 timer ble celleproliferasjon bestemmes ved hjelp av Edu merking kit. (D) Fotografier av PTEN protein uttrykk i tumorvev (øvre paneler) og tumorer (nedre paneler). (E) Grafen viser vekten av de 3 svulster etter 4 uker (n = 3). (F) En signifikant invers korrelasjon observert mellom MIR-425 og PTEN uttrykk nivåer i mage kreft vev (n = 52). (G) Uttrykket nivåer av PTEN bestemmes i seks normale mageslimhinnen celler og mage kreft cellelinjer ved hjelp av real-time PCR. (H) En modell som illustrerer de antatte rolle IL-1β og MIR-425 i kontrollen av PTEN reaksjonsveien i humane mage-karsinomceller.
Vi undersøkte virkningen av MIR-425 på tumorgenisitet in vivo. Svulstene behandlet med anti-MIR-425 viste økt nivå av PTEN protein (Figur 6D). Også anti-MIR-425 reduserte tumorvekt av mus sammenlignet med MIR-NC-behandlede gruppen (figur 6E). Bruk av ikke-parametriske tester, fant vi en signifikant invers korrelasjon mellom PTEN mRNA og Mir-425 uttrykk i mage kreftprøver (Figur 6F). Uttrykket nivåer av PTEN ble også bestemt i seks normale mageslimhinnen celler og mage kreft cellelinjer ved hjelp av real-time PCR. Som vist, av cellene med "nedregulert" MIR-425 har høyere mengder av PTEN sammenlignet med cellelinjer med "opp-regulert" MIR-425 nivåer (figur 6G). I konklusjonen, har våre resultater bevist at MIR-425 spiller en kausal rolle gjennom målretting PTEN i mage kreft.
Diskusjon
Interleukin-1 (IL-1) er en stor pro-inflammatorisk cytokin som produseres av ondartet eller microenvironmental celler [17]. IL-en fungerer også som en pleiotropisk cytokin involvert i tumordannelse og tumor invasivitet; Derfor representerer det en mulig kandidat for en moduler cytokin som kan vippe balansen mellom betennelse og immunitet mot induksjon av antitumor responser [18]. IL-1α og IL-1β er de viktigste agonister av IL-1. I deres utskilte former, IL-1 a og IL-1β bindes til de samme reseptorene og induserer de samme biologiske funksjoner [19]. Imidlertid IL-1α og IL-1β varierer i deres oppdeling i seksjoner innenfor cellen eller mikromiljøet [20]. IL-1β er bare aktiv i sin utskilt form og medierer inflammasjon, som fremmer kreftutvikling, tumor invasivitet og immunsuppresjon [21]. Noen nye anti-IL-1B midler har blitt brukt i kliniske studier hos pasienter som viser ulike sykdommer med inflammatoriske manifestasjoner [22]. En bedre forståelse av den integrerende rollen til IL-1β signalveier i den maligne prosess vil muliggjøre påføring av ny IL-1β modulasjon nærmer seg hos kreftpasienter.
PTEN ble oppdaget som en viktig tumor suppressor som ofte er mutert eller går tapt i ulike kreftformer [23]. Flere bevislinjer har markert PTEN som et lipid fosfatase som hydrolyserer 3'-fosfat i phosphoinositides [24]. PTEN kan også regulere aktiviteten til serin /treonin kinase AKT /PKB og kan dermed påvirke celleoverlevelse signalering [25]. UV eksponering kan utløse PTEN interaksjon med villtype melanocortin-1-reseptor-varianter, som beskytter PTEN fra WWP2-mediert degradering, som fører til inaktivering AKT i melanoma [26]. Det er flere mekanismer for regulering av PTEN, inkludert transkripsjon, mRNA stabilitet, mikroRNA målretting, oversettelse og protein stabilitet. PTEN er transcriptionally brakt til taushet av arrangøren metylering i magekreft [27]. PTEN kan også være post-translasjonelt regulert ved acetylering, ubiquitylation, oksidasjon, fosforylering, og subcellulær lokalisering [28]. Til tross for omfattende karakterisering av PTEN mutasjoner i humane kreftformer og en forholdsvis god forståelse av den molekylære roller PTEN i kontroll av cellulære prosesser, er lite kjent om måter PTEN regulering.
PTEN kan inhiberes i kreftceller etter induksjon av pro-inflammatoriske cytokin IL-1β [29]. Stimulering med IL-1β aktiverer NF-kappaB ved fosforylering og nedbrytning av IicB. Denne aktiveringen gjør NF-kappaB til translocate inn i kjernen og transcriptionally aktivere målgener [30]. NF-kappaB er et heterodimert transkripsjonen aktivator som består av den DNA-bindende subenhet p50 og p65 transaktivering-underenheten [31]. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
Forfatternes opprinnelige innsendte filer for Images Nedenfor er linkene til forfatternes originale innsendte filer for bilder . Alle forfattere lese og godkjent den endelige manuskriptet.

• Påvirkning av IL17A polymorfismer på avvikende metylering av DAPK og CDH1 i ikke-kreft mageslimhinnen
• Uvanlig trichobezoar av magesekken og tarmen: en kasuistikk