NF-kappaB-ofhängeg MicroRNA-425 upregulation ënnerstëtzt gastric Kriibs Zell Wuesstem vun PTEN gezielt op IL-1β Aféierungs-

NF-kappaB-ofhängeg MicroRNA-425 upregulation ënnerstëtzt gastric Kriibs Zell Wuesstem vun PTEN op IL-1β Aféierungs- VerfÜgung méiglech VerfÜgung Overexpression vun der proinflammatory cytokine IL-1β verbonnen ass mat ënnerschiddlechen Krankheeten gezielt, dorënner Kriibs. Verfall vun microRNAs huet zu Kriibs Zellen ausgesat proinflammatory cytokines, nach hir Funktioun am inflammation Stress bleift Synch observéiert ginn. Hei, weisen mir dat IL-1β der upregulation vum Mir-425 induces, wat negativ phosphatase an tensin homolog Ausdrock reguléieren duerch seng 3 'UTR gezielt. Eng Erhéijung vun Mir-425 hänkt op IL-1β-entschlof NF-kappaB Aktivéierung, déi op IL-1β Aféierungs- Mir-425 Gentherapie Transkriptiouns verbessert. Demno, ënnerstëtzt Prolifératioun gastric Kriibs Zell Repressioun vun phosphatase an tensin homolog vum Mir-425, déi néideg ass Zellen aus cisplatin-entschlof apoptosis ze schützen. Geholl zesummen, eis Daten Ënnerstëtzung enger kritescher Roll fir NF-kappaB-ofhängeg upregulation vum Mir-425, déi fir d'Repressioun vun phosphatase an tensin homolog Aktivéierung an der Promotioun vun Zell Iwwerliewe op IL-1β Aféierungs- eng nei Passerelle duerstellt. VerfÜgung Schlësselwieder VerfÜgung IL-1β NF-kappaB Mir-425 PTEN Gastric Kriibs Background VerfÜgung Gastric adenocarcinoma ass de véierten a fënneftmeeschten gemeinsam Kriibs ënnert Männercher a Weibercher, respektiv, weltwäit an ass staark zu chronescher inflammation Hausnummeren [1]. Et ass elo och déi Krankheet mat Helicobacter akzeptéiert pylori VerfÜgung (H. pylori VerfÜgung) spillt eng grouss Roll flénke malignancy chronescher inflammation zu ausléisen, [2]. Chronescher inflammation vun de Mo. Initiaten den histopathological Werdegang vun chronescher gastritis zu gastric atrophy, intestinal metaplasia an endlech gastric Kriibs [3]. Iwwerdeems H. pylori VerfÜgung Wonn extrem verwandelt ass, just eng kleng Minoritéit (ongeféier 1%) vun Krankheet Persounen gëtt gastric Kriibs no ville Joeren entwéckelt. Verännerleche Äntwert op dës gemeinsam pathogen schéngt duerch eng genetesch predisposition ze héich Ausdrock Niveau vun proinflammatory cytokines [4] regéiert gin. VerfÜgung der Nuklearenergie Faktor Kappa B (NF-kappaB) Passerelle gouf laang eng grouss proinflammatory sécher Passerelle considéréiert, haaptsächlech baséiert op der Aktivatioun vun NF-kappaB vun proinflammatory cytokines an der Roll vun NF-kappaB an der transcriptional Aktivatioun vun responsiven Genen och cytokines an chemokines [5]. De "kanonesche" Passerelle fir NF-kappaB Aktivéierung ass vun proinflammatory cytokines wéi IL-1β ausgeléist an normalerweis féiert zu der Aktivatioun vun am oder cRel-haltege investéiert [6]. NF-kappaB existéiert an der Zytoplasma an eng Aarbechtslosegkeet Form verbonne mat reglementaresche Proteinen bezeechent als inhibitors vun κB (IκB), vun deenen déi wichtegst IκBα, IκBβ, an IκBε kann. IκBα ass mat flüchteg NF-kappaB Aktivéierung verbonne hierkommen IκBβ an nohalteg Aktivéierung Équipe gëtt [7]. Allerdéngs ass chronescher inflammation eng komplex gestallt Prozess, an der Roll vun NF-kappaB an der demagogesch Äntwert ass nach net ganz lant. VerfÜgung Nieft FAQ-coding Gentherapie Ausdrock betrëfft, inflammation Stress Ännerungen och d'Expressioun Niveau vun microRNAs (miRNAs) [8]. MicroRNAs sinn eng Klass vu endogenous, kleng, Net-coding RNAs déi negatif Gentherapie Ausdrock am Post-transcriptional Niveau regléieren haaptsächlech fir d'3 'untranslated Regioun vun engem Zil- mRNA via bindend, an si hunn wichteg reglementaresche Funktiounen an der Kontroll vun verschiddenste gestallt an agebousst Prozesser [9, 10]. Dës RNAs goufen zu der Regelung vun villen bewosst Prozesser dorënner Prolifératioun, dat, an apoptosis [11-13] gin Équipe gewisen. Mä, ob chronescher inflammation miRNA Ausdrock maturation vun modulating Gentherapie Transkriptiouns oder Wou muss ech post-transcriptional reguléieren ass net festgeluecht ginn. An dëser Aarbecht VerfÜgung, hunn mer dat Mir-425 Aféierungs- op IL-1β-entschlof inflammation op der Aktivatioun ofhängeg ass vun NF-kappaB, wat Mir-425 Gentherapie Transkriptiouns gestäerkt. Desweideren, cibléiert der upregulated Mir-425 direkt phosphatase an tensin homolog (PTEN) an negativ hiren Ausdrock reegelen, déi Zell Iwwerliewe op IL-1β Aféierungs- gefördert. VerfÜgung hun Prozeduren VerfÜgung Ausso IFLA- VerfÜgung All uplanzen aus kritt huet Patienten déi Agrëff bei Fudan University Shanghai Cancer Center mécht. De Protokoll war vun der Fuerschung IFLA- Comité vun Fudan Universitéit ugeholl, an der Recherche huet laut vun der Helsinki Deklaratioun vu 1975 sollt daueren bascht normal Stoffer zu den Dispositioune duerchgefouert ewech macroscopically vum gastric Kriibs lesion excised waren, an hir histological Diagnos ass confirméiert microscopically. Schrëftlech informéiert Averständnes war vun all Participanten an der Etude. VerfÜgung Zell Kultur an reagents VerfÜgung Déi mënschlech embryonal Nier Zell Linn HEK293 (ATCC® loosen-1573 ™), de Mënsch Broscht Kriibs Zell Linn MDA-MB361 (ATCC Équipe kritt ® HTB-27 ™), de Mënsch gastric adenocarcinoma Zell Linn AGS (ATCC® loosen-1739 ™), SNU-1 (ATCC® loosen-5971 ™), SNU-5 (ATCC® loosen-5973 ™), SNU-16 (ATCC® CRL- 5974 ™), Hs746T (ATCC® HTB-135 ™), NCI-N87 (ATCC® loosen-5822 ™), a Kato III (ATCC®HTB-103 ™) waren an DMEM haten wouvun 10% an et Bovine serum. All Zell Strecken zu Medien wouvun penicillin (100 IU /ml) an streptomycin (100 mg /ml) bei 37 ° C mat 5% CO haten 2. D'miRNA mimics an Anti-miRNA sech aus Ambion (Austin, Suerge, USA) kaaft. D'IKK inhibitor TPCA-1 (Cat. Nr S2824), de p38 MAPK inhibitor BIX02188 (Cat. Nr S1574) an der JNK inhibitor SP600125 (Cat. Nr S1460) sech aus Selleckchem (Houston, Suerge, USA) kaaft. Recombinant Mënsch IL-1β sech aus Fläch-Aldrich kaaft (Cat. Nr H6291, Shanghai, China). VerfÜgung RNS erauszéien a real-Zäit Hinnen alleguer VerfÜgung Total RNS war vun Zellen ofgebaut benotzt TRIzol (Invitrogen, Karlsbad CA ). Fir microRNA Analyse, puer dovun (A) Schwänz sech ze total RNS benotzt puer dovun (A) polymerase (Ambion, Karlsbad CA) virewech dobäi Transkriptiouns zu ëmgedréint. D'MiRcute miRNA qPCR erkennen Kit (TIANGEN, Peking, China) war benotzt dem Wëllen Niveau vun alen Mir-425 laut de gëtt Protokoll ze quantitate, an GAPDH war wéi eng intern Kontroll benotzt. Real-Zäit Hinnen alleguer war ënner dëse Konditiounen gesuergt: 95 ° C 10 m, 1 Zyklus; 95 Grad 10 ass, 55 ° C 34 ass, 40 zouféieren. VerfÜgung Fir all déi real-Zäit Hinnen alleguer Methoden kritt Resultater, déi mer den Delta Delta CT Method déi fantastesch Ännerung vun der Gentherapie Ausdrock tëscht verschiddene Gruppen ze berechnen. De Montant vun der Zil- (PTEN /Mir-425), normalized dem endogenous housekeeping Gentherapie GAPDH a relativ zu engem Referenzmaterial Echantillonen, déi folgend Equatioun uginn ass:. Montant vun Zil- = 2 - △△ CT VerfÜgung Immunoblotting VerfÜgung Proteinen sech op eng 10% SDS-PAGE gelies getrennt an duerno zu engem PVDF Membran transferéiert. (: 500, Santa Cruz, sc-7974 1) an eng NF-kappaB p65 Phospho (pS536) (RELA) antibody (1: 10000 No mat 5% nonfat Mëllech erauszesichen, war d'Membran mat enger Maus monoclonal anti-PTEN antibody incubated ., EPITOMICS, Cat #: 2220-1). IRdye-Label Secondaire antibodies sech fir quantitation vun der immunoblotting Signal ginn, an d'Signaler sech mat enger Odyssee Scanner (LI-Cor Biosciences, Lincoln, héich, USA) analyséiert. VerfÜgung Luciferase assay VerfÜgung HEK293 Zellen an AGS Zellen sech transfected mat Mir-425 an pGL3 luciferase reporter gesond Situatioun Mir-425 Zil- Haaptrei ausser. No 24 h, goufen d'Aktivitéite vun Liichtkäfer luciferase an renilla luciferase an der Zell lysates mat der Dual-Luciferase Assay System (Promega, Madison, allem, USA) gemooss. Fir d'luciferase Transkriptiouns reporter assay, Mir-425 Gentherapie Promoteur Message (virstellen oder Site Läschen) waren an der Promoteur Regioun vun der pGL3-Grondakommes Vecteure gekloonten, an luciferase Aktivitéit war gemooss, wéi uewe beschriwwen. VerfÜgung Chromatin immunoprecipitation (Chip)
Kuerz, behandelt Zellen sech Kräiz-verbonne mat 1% formaldehyde, fir eng Duerchschnëttsgréisst vu 400 BP sheared, an dono mat antibodies géint NF-kappaB (Santa Cruz, sc-166588) immunoprecipitated. Den Chip-Hinnen alleguer primers sech entworf Promoteur Regioune mat putative NF-kappaB bindend Siten bannent Mir-425 zu Meenungsfreiheet nennt als illustréiert. Eng positiv Kontroll antibody (RNS polymerase II) an engem negative Kontroll Net-immun IgG sech benotzt d'Efficacitéit vun de Kit reagents (Epigentek Group INC, P-2025-48) beweisen. Immunoprecipitated DNA ass dann gebotzt, verëffentlecht, an eluted. Eluted DNA kann fir matgeholl Uwendungen Chip-Hinnen alleguer benotzt ginn. Fantastesch Beräicherung (virgezunnen) war mat engem Verhältnis vun amplification Effizienz vun den Chip Prouf iwwer déi vun Net-immun IgG berechent. Amplification Effizienz vun Polymerase RNS II gouf als eng positiv Kontroll benotzt. Virgezunnen% = 2 (IgG CT - Sample CT). × 100% VerfÜgung Zell Prolifératioun assay VerfÜgung Eng Zell Prolifératioun assay Leeschtung war mat der Zell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) laut der Fabrikant d'Uweisungen. Virun der Aféierung vun CCK-8, huet sech den Zellen mat waarme Kultur Medien Katakombe vun der Plack um 500 Ziichter Anlag fir 3 m an duerno de supernatant discarding. VerfÜgung Zell apoptosis assay VerfÜgung D'Kriibs Zellen gesammelt goufen an resuspended zu 500 μl vun engem verbindlechen gefiermt. D'Zell Ophiewe (100 μl) gouf fir 20 Minutten mat 5 μl annexin-V an propidium Kaliumiodid bei Raumtemperatur incubated. D'grousst Zellen sech donieft mat unisse-ageschalt Zell (FACS) benotzt BD LSR II Flux cytometry. VerfÜgung Zell Zyklus Analyse VerfÜgung Fir de Flux cytometry Analyse zortéieren, goufen Zellen trypsinized an Iwwernuechtung zu 70% Ethanol fest. D'Zellen sech dann zu 0,5 ml vun propidium Kaliumiodid Léisung incubated mat 25 μg ml -1 RNase fir 15 Minutte bei 37 ° C an gemooss. VerfÜgung Mouse Experimenter VerfÜgung der NCI-N87 Zellen (3 × 10 6) huet an der rietser Säite vun athymic Nu /Nu Mais heijen. Eng Woch no der injections, Mais mat comparably Stad erhéijen sech fir 4 Wochen mat anti-Mir-425 behandelt. D'Anti-Mir-425 (2 nmol) huet fir 4 Wochen direkt nees erhéijen zweemol Wochenzeitung heijen. VerfÜgung statistique Analyse VerfÜgung D'Resultater si presentéiert wéi heescht ± Sem, an d'Donnéeë sech mat Student d't Test analyséiert. A Wäert vun p VerfÜgung &Si besteet; 0,05 war statistesch relevant considéréiert. VerfÜgung Resultater VerfÜgung IL-1β Behandlung induces Mir-425 Ausdrock VerfÜgung der miRNAs fir IL-1β Aféierungs- responsabel Markenzeeche, profiléiert mir miRNA Ausdrock vun PBS-behandelt AGS Zellen an IL-1β -induced AGS Zellen der Exiqon miRCURY ™ LNA Singular System benotzt (v.14.0). D'miRNA Niveauen ënnerscheet daitlech tëscht PBS-behandelt Grupp an der IL-1β-entschlof Grupp, wéi an der Hëtzt Kaart gewisen an Dorënner 1A illustréiert. Ënnert der 1.891 knipsen Ämter, goufen 46 miRNAs differentially ausgedréckt an IL-1β-entschlof AGS Zellen am Verglach mat vläit PBS-behandelt AGS Zellen; vun dësen miRNAs, goufen 29 grouss an 17 waren an der IL-1β-entschlof AGS Zellen (Table 1), wat beweist, dass eng spezifesch miRNA Muster mat IL-1β Aféierungs- assoziéiert ass erofgaangen. Figur 1 Dysregulation vun miRNAs zu Mënsch AGS Zellen mat IL-1β behandelt. (A) Mënscherechter AGS Zellen sech mat IL-1β (10 Dummeldéng /ml) [14] behandelt, an 24 h drop, war d'miRNAs Ausdrock Profil mat microarray Technologie analyséiert. Hëtzt Kaart Diagramm vun unsupervised Käre Analyse entsteet mat 46 bedeitend dysregulated miRNAs. Red beweist upregulation; gréng beweist downregulation. (B) Geklomm Niveau vun Mir-425 zu 36 entholl Echantillon relativ zu hire Niveauen am reagéiert bascht normal Stoffer wéi déi real-Zäit Hinnen alleguer gemooss. Normal: bascht normal Stoffer. (C) Expression Niveau vum Mir-425 war vun real-Zäit Hinnen alleguer zu Multiple gastric Kriibs Zell Linnen a sechs normal gastric mucosa Zellen iwwerpréift. VerfÜgung Table 1 Grouss dysregulation vun VerfÜgung miRNAs Overexpressed zu IL-1β entschlof-AGS Zellen
miRNA
falen änneren
p Wäert
kann awer och sin-Mir-425 VerfÜgung 12,36 VerfÜgung 0.00
hsa-miR-584
11.03
0.01
hsa-miR-31
8.12
0.00
hsa-miR-155
6.22
0.00
hsa-let-7i
5.55
0.00
hsa-miR-21
5.11
0.00
hsa-miR-335
4.89
0.01
hsa-miR-191
4.73
0.03
hsa-miR-519d
4.37
0.02
hsa-miR-520d-5p
3,95
0.00
hsa-miR-331
3.67
0.01
hsa-miR-142
3.45
0.01
hsa-miR-518a-5p
3.28
0.01
hsa-miRPlus-F1231
3.11
0.01
hsa-miR-2113
2.94
0.02
hsa-miR-196a*
2.88
0.02
hsa-miR-1304
2.78
0.02
hsa-miR-185
2.65
0.01
hsa-let-7a
2.61
0.00
hsa-miR-130
2.52
0.02
hsa-miR-1280
2.50
0.01
hsa-miR-222
2.47
0.01
hsa-let-7c
2.43
0.00
hsa-miR-602
2.31
0.00
hsa-miR-548e
2.31
0.03
hsa-miR-32
2.27
0.04
hsa-miR-181a
2.24
0.02
hsa-miR-7
2.13
0.00
hsa-miR-21*
2.06
0.00
Underexpressed zu IL-1β entschlof-AGS Zellen VerfÜgung miRNA VerfÜgung falen änneren VerfÜgung p Wäert
hsa-miR-143
0.06
0.02
hsa-miR-200
0.08
0.01
hsa-miR-451
0.13
0.01
hsa-miR-144
0.17
0.00
hsa-miR-363
0.20
0.01
hsa-miR-637
0.25
0.03
hsa-miR-153
0.39
0.01
hsa-miR-139
0.39
0.00
hsa-miR-617
0.42
0.01
hsa-miR-1915
0.43
0.00
hsa-miRPlus-F1153
0.45
0.00
hsa-miR-381
0.46
0.00
hsa-miR-145
0.47
0.02
hsa-miR-659
0.47
0.03
hsa-miR-125b
0.48
0.00
hsa-miR-183*
0.49
0.00
hsa-miR-638
0.49
0.01
*: Wann zwou eeler miRNAs aus Géigendeel Wope vun der selwechter Pre-miRNA staamt, e Stär folgenden den Numm bedeit bei nidderegen Niveau relativ zu der miRNA am Géigendeel Aarm vun engem hairpin VerfÜgung Dorënner miRNAs eng miRNA ausgedréckt, miR-. 425 gouf de meeschte héichgradeg op IL-1β Aféierungs- upregulated. Benotzt real-Zäit Hinnen alleguer Analyse, mir analyséieren Mir-425 Ausdrock vun 36 vläit Echantillon (entholl an bascht normal Stoffer aus dem selwechten Patient). Mir hunn e bedeitend méi héich Niveau vum Mir-425 Ausdrock vun der entholl Echantillon relativ zu de Niveau vun der bascht normal Stoffer (p VerfÜgung &Si besteet; 0.0001) (Dorënner 1B). Mir iwwerpréift den Ausdrock Niveau vum Mir-425 zu engem Brand vun gastric Kriibs Zell Linnen a sechs normal gastric mucosa Zellen. Als zu Dorënner 1c gewisen, hat mer den AGS Zellen mat verwandelt-reegelen Mir-425 an der NCI-N87 Zellen mat an-reegelen Mir-425 fir weider studéieren. Obwuel den Aktivéierungscode vu Mir-425 gemellt gouf Fetter den Ausdrock vun enger ëmfangräicher Reseau vu Genen [15], der Roll vum Mir-425 zu Mënsch Cancers eng fundamental Impakt op Kriibs Initiatioun an Werdegang vun Kriibs Zellen ze hunn ass net opgekläert ginn . . Mir kucke dofir Mir-425 fir weider Enquête VerfÜgung Expression vun PTEN negatif vum Mir-425 VerfÜgung reglementéiert Fir d'Ziler vum Mir-425, identifizéiere mir geschafft engem Toast benotzt sind miRecords (http: //mirecords . biolead. org /), déi fir Déier miRNA-Zil erëm eng integréiert Ressource ass. Fir d'Richtegkeet vun dëser Cepheid, Genen Erhéijung déi vun op d'mannst fënnef vun eelef Datenbanken (Diana, microinspector, Miranda, mirtarget2, mitarget, nbmirtar, pictar, Pita, rna22, rnahybrid an targetscan) virausgesot huet sech als putative Ziler ausgewielt. Dorënner putative Ziler vum Mir-425, Gentherapie Ontologie Analyse verroden, datt de Begrëff Niveau vun 9 Kandidaten Genen verännert goufen; also, kéint dëst Verfall zu der malignant phenotype bäidroen. Benotzt 3 'UTR luciferase reporter assays, fonnt mir dass overexpression vum Mir-425 bedeitend inhibited luciferase Aktivitéit zu HEK293 Zellen an AGS Zellen der Wëllschwäin Typ PTEN ausdrécken 3' UTR reporter (Dorënner 2A). Mir confirméiert datt PTEN engem putative direkt Zil vum Mir-425 ass. Fir d'Spezifizitéit vum Mir-425 Ganzt, awer mir dass anti-Mir-425 speziell d'inhibition vun luciferase Aktivitéit ofgeschaf entschlof vum Mir-425 zu HEK293 Zellen an NCI-N87 Zellen (Dorënner 2B). Projet'en am miRNA bindend Siten (Dorënner 2C) sprachlos der gesond Centre ze Mir-425 Aféierungs- (Dorënner 2D), weider confirméiert, dass d'PTEN Gentherapie eng direkt Zil vum Mir-425 ass. Figur 2 Mir-425 Ziler direkt PTEN. (A) Reporter assay zu HEK293 Zellen an AGS transfected Zellen mat Mir-425 a gesond luciferase cDNA fir d'3 'UTRs vun virausgesot Kandidat Ziler Äonen Droen (mengen ± Sem). (B) Effects vun Anti-Mir-425 op der luciferase Aktivitéit vun luciferase gesond Method mat den 3 "UTRs vun PTEN zu HEK293 Zellen an NCI-N87 Zellen (mengen ± Sem). (C, D) Reporter assay zu HEK293 Zellen an AGS transfected Zellen mat luciferase gesond PTEN 3 'UTRs mat Projet'en an d'Mir-425-verbindlech Siten Droen (mengen ± Sem). (E) HEK293 Zellen an AGS Zellen sech mat engem luciferase bauen transfected der Wëllschwäin Typ PTEN 3 Droduch 'UTR (LUC-virstellen) oder engem bauen e mutated PTEN 3 Droduch' UTR (LUC-Mut). No 24 h, goufen d'Zellen mat IL-1β behandelt, a war luciferase Aktivitéit 24 h der Behandlung laachen. (F) Western blot an RT-Hinnen alleguer weist PTEN FAQ Niveauen a mRNA Niveauen am AGS Zellen no 48 h vum Mir-425 transfection. (G) waren AGS Zellen transfected mat anti-Mir-425, an 24 h drop, huet den Zellen lénks onbehandelt oder behandelt mat IL-1β an dono 24 h der Behandlung recoltéiert. Ganz Zell lysates sech mat PTEN antibodies immunoblotted. (H) NCI-N87 Zellen sech mat Anti-Mir-425 transfected an recoltéiert 24 h der Behandlung. Ganz Zell lysates sech mat PTEN antibodies immunoblotted. (Ech) AGS Zellen sech mat engem plasmid transfected nëmmen oppen liesen Frame Haaptrei vun PTEN Droen (PTEN-CDen). No 24 h, goufen d'Zellen mat IL-1β oder Mir-425 behandelt. Ganz Zell lysates sech no 24 h vu Behandlung ze immunoblotting ënnerworf. (* P &Si besteet; 0,05; ** p &Si besteet; 0,01; *** p &Si besteet; 0.001) VerfÜgung Weideren stattfannen vun der Raumstatioun-425 Zil- leien och vill attenuated IL-1β-entschlof Repressioun vun PTEN 3 'UTR. luciferase reporter Aktivitéit zu HEK293 Zellen an AGS Zellen (Dorënner 2E). Overexpression vum Mir-425 huet genuch souwuel d'FAQ a mRNA Niveauen am AGS Zellen (Dorënner 2F) op PTEN Ausdrock ze downregulate. An anere Wierder, IL-1β-entschlof PTEN Repressioun war déi ausdrécken, anti-Mir-425 zu AGS Zellen (Dorënner 2G) gerett. Anti-Mir-425 gebass ze PTEN Ausdrock vun NCI-N87 Zellen ouni IL-1β Stimulatioun (Dorënner 2H) up-regléieren. VerfÜgung Eis Daten annoncéiert och dass d'3 'UTR fir Mir-425-mediated PTEN downregulation néideg ass well Ausdrock vun enger PTEN coding Regioun bauen (PTEN-CDen) war Géigestand seng Identitéit verléiert zu Mir-425 overexpression an IL-1β Aféierungs- zu AGS Zellen (Dorënner 2I). Geholl zesummen, weg dës Resultater dass Mir-425 engem kriteschen Roll spillt zu repressing PTEN Ausdrock vun hiren 3 'UTR op IL-1β Aféierungs- gezielt. VerfÜgung IL-1β-entschlof NF-kappaB Aktivéierung fir Mir-425 Aféierungs- néideg ass
fir de Mechanismus bestëmmen Équipe an mir-425 transactivation op IL-1β kopéiert, iwwerpréift mer den Impakt vun verschiddenen kinase inhibitors op mir-425 Aféierungs- zu IL-1β-behandelt AGS Zellen. IL-1β-entschlof Mir-425 upregulation war vun der IKK inhibitor TPCA-1, awer net vun der p38 MAPK inhibitor BIX02188 oder der JNK inhibitor SP600125 (Dorënner 3A) bedeitend inhibited. Virdrun Studien hu bewisen, datt IKK eng essentiel kinase fir NF-kappaB sécher néideg ass; dofir, uginn dësem Resultat den kriteschen Roll vun NF-kappaB sécher an der Regulatioun vun Mir-425 Transkriptiouns op IL-1β kopéiert. Figur 3 IKK Aktivéierung ass fir d'Aféierungs- vum Mir-425 an Äntwert ze IL-1β Aféierungs- néideg. (A) AGS Zellen sech mat IL-1β an der Präsenz vun der IKK inhibitor TPCA-1, der p38 MAPK inhibitor BIX02188 an der JNK inhibitor SP600125 behandelt. Mature Mir-425 Ausdrock um 12 h der Behandlung war vun real-Zäit Hinnen alleguer quantitated. Déi fantastesch Ännerung vun relativer Mir-425 Ausdrock (Mir-425 /U6) war vun PBS-behandelt Zellen zu deem observéiert normalized. (B) Den Ausdrock vun der Primärschoul Mir-425 (pri-Mir-425) war wéi am A. (C) vun real-Zäit Hinnen alleguer analyséiert Den Ausdrock Niveau vun NF-kappaB FAQ a pri-Mir-425 huet analyséieren real- Zäit Hinnen alleguer zu AGS mat siRNAs fir NF-kappaB behandelt Zellen. (D) AGS Zellen sech mat Chimie inhibitors oder siRNAs fir NF-kappaB behandelt. Zell lysates goufen 24 h der IL-1β Behandlung kritt an immunoblotted mat PTEN antibodies. (E) Western blot Analyse vun phosphorylated NF-kappaB p65 (serine 536). (F) Den Ausdrock Niveau vun NF-kappaB FAQ a pri-Mir-425 vun real-Zäit Hinnen alleguer zu NCI-N87 Zellen behandelt mat siRNAs fir NF-kappaB analyséiert goufen. (* P &Si besteet; 0,05; ** p &Si besteet; 0,01; *** p &Si besteet; 0.001). VerfÜgung, aus, Aféierungs- vun pri-Mir-425 op IL-1β Traitement war bemierkenswäert inhibited an der Präsenz vun der IKK inhibitor oder siRNAs fir NF-kappaB (Dorënner 3B an C). Mir gesinn och datt IL-1β-entschlof PTEN Repressioun vun der Präsenz vun der IKK inhibitor oder siRNAs fir NF-kappaB (Dorënner 3D) attenuated war. Fir erauszefannen, ob NF-kappaB Aktivitéit zu AGS Zellen präsent war mat IL-1β behandelt, déi mir engem westlech blot den Niveau vun phosphorylated NF-kappaB p65 (serine 536) ze bestëmmen. Den Niveau vun phosphorylated NF-kappaB p65 (serine 536) war héich an AGS behandelt Zellen mat IL-1β (10 Dummeldéng /ml; 24 Stonnen) (Well 3). Zousätzlech, silencing vun NF-kappaB inhibited Mir-425 Ausdrock vun NCI-N87 Zellen ouni IL-1β Behandlung (Dorënner 3F). Dës Resultater suggeréiert datt IKK-ofhängeg NF-kappaB Aktivéierung op IL-1β Behandlung ass fir PTEN downregulation néideg, Wahrscheinlechkeet via hir Opléisung vum Mir-425 Transkriptiouns. VerfÜgung Fir erauszefannen, ob NF-kappaB direkt Mir-425 Transkriptiouns reguléieren, mir den Offloss Message vum Mir-425 analyséiert d'WeightMatrix Bibliothéik (matrixTFP60.lib) an identifizéiert dräi potentiell NF-kappaB bindend Siten an de Promoteur Regioun vum Mir-425 benotzt (Zentral-Off: Matrixentgasung Ähnlechkeet = 0,9 an Kär Ähnlechkeet = 0,95) ( Figur 4A). Mir standing chromatin immunoprecipitation (Chip) assays mat AGS Kriibs Zellen monoclonal anti-NF-kappaB antibodies benotzt. Als zu Dorënner 4B gewisen, produzéiert nëmmen primer-B vum Mir-425 staark Hinnen alleguer Produiten, déi proposéiert, datt d'NF-kappaB FAQ investéiert mat der B bindend Site vun der Raumstatioun-425 Promoteur gemaach. D'Resultater vun luciferase reporter assays ugeholl, datt d'Potential B bindend Site vun der Mir-425 Promoteur fir transactivation vun der afgerappt Gentherapie op IL-1β Aféierungs- (Dorënner 4A an C) néideg ass. Figur 4 NF-kappaB bindend Siten an d'Mir-425 Promoteur. (A) Particularitéite vum Mir-425 5 "Kontinentaltruppe DNA. Mënsch Promoteur Regioune vum Mir-425 enthält dräi putative bindend Siten fir NF-kappaB. (B) Chip assays mat anti-NF-kappaB antibodies zougedréckt bindend vun NF-kappaB fir de Promoteur vum Mir-425 zu AGS Zellen. Der relativer occupancies vun NF-kappaB sinn als vertikal Baren uginn. Déi Bar Grafike weisen d'ronn vun dräi onofhängeg Chip Experimenter. (C) De Promoteur vum Mir-425 war vun NF-kappaB ausgeléist. AGS Zellen sech mat NF-kappaB behandelt a mat der uginn LUC vectors transfected. VerfÜgung Schulung vun Mir-425 ënnerstëtzt Zell Iwwerliewe op IL-1β Aféierungs- VerfÜgung Et war dës déi PTEN ënnert de Meeschter ass dacks inactivated entholl suppressor Genen. Overexpression vun PTEN zu verschiddene mammalian Otemschwieregkeeten Kultur Zellen schellt verschiddenen Prozesser dorënner Zell Prolifératioun, Zell Doud a Zell Migratioun [16]. Mir hunn och déi inhibiting PTEN der Aktivatioun vun caspase-3 an Zellen mat IL-1β (Dorënner 5A) behandelt ofgeholl. Et ass plausibel dass Mir-425 Aféierungs- apoptosis via de downregulation vun PTEN zu IL-1β-behandelt Zellen inhibit kann. Tatsächlech overexpression vum Mir-425 inhibited caspase-3 Aktivatioun vun cisplatin-behandelt AGS Zellen (Dorënner 5B). Desweideren, an cisplatin-behandelt AGS Zellen, cotransfection vun engem bauen nëmmen de PTEN coding Regioun (PTEN-CDen) mat, wat fir Mir-425 Géigestand seng Identitéit verléiert ass, iergendwéi onfräiwelleg op d'antiapoptotic Effet vum Mir-425 overexpression (Dorënner 5C). An anere Wierder, transfection vun Anti-Mir-425 zu AGS Zellen vill caspase-3 Aktivéierung an apoptosis an Äntwert ze IL-1β Behandlung (Dorënner 5D) verstäerkt. Zousätzlech, transfection vun Anti-Mir-425 zu NCI-N87 Zellen caspase-3 Aktivéierung an apoptosis ouni IL-1β Stimulatioun (Dorënner 5E) bedeitend verstäerkt ginn. Figur 5 Mir-425 bremst Zell apoptosis vun PTEN repressing. (A). AGS Zellen sech mat Kontroll (PBS) oder IL-1β behandelt. No 48 h, ware ganz Zell lysates immunoblotted. (B). AGS Zellen sech mat negativen Kontroll (Mir-NC) oder Mir-425 eleng transiently transfected. No 24 h, goufen d'Zellen mat cisplatin behandelt a recoltéiert 24 h der Behandlung. Ganz Zell lysates sech immunoblotted. (C). AGS Zellen sech mat Mir-NC, Mir-425 transfected, an PTEN-CDen als uginn. No 24 h, goufen d'Zellen mat cisplatin behandelt a recoltéiert 24 h der Behandlung. D'Zell apoptosis Taux war mat de Flux cytometry Method alles. (D). AGS Zellen sech mat Mir-NC oder anti-Mir-425 transfected. No 48 h, goufen d'Zellen mat IL-1β behandelt an 24 h der Behandlung recoltéiert. Total Zell lysates sech mat der uginn antibodies immunoblotted, an der Zell apoptosis Taux war mat de Flux cytometry Method alles. (E) NCI-N87 Zellen sech mat Mir-NC transfected oder anti-Mir-425. Total Zell lysates sech mat der uginn antibodies immunoblotted, an der Zell apoptosis Taux war mat de Flux cytometry Method alles. VerfÜgung haalt mat senger Roll caspase Aktivatioun vun inhibiting, upregulation vum Mir-425 méi AGS Zell Prolifératioun verstäerkte hierkommen d'Regle- Iwwerliewe war Effekt komplett vun de Ko-transfection mat exogenous PTEN (PTEN-CDen) (Dorënner 6A) gespaart. Anti-Mir-425 erofgaangen de Prozentsaz vun proliferating Zellen fir NCI-N87 Zellen (Dorënner 6B). Mir hunn och déi PTEN inhibiting ähnlech engem Schutzpatrounin Effekt huet, datt bis zu Zellen observéiert overexpressing Mir-425 (Dorënner 6C) suggeréiert datt PTEN Repressioun vun Zellen eng grouss Roll an Mir-425-ofhängeg Schutz spille kann mat IL-1β behandelt. Figur 6 Mir-425 ënnerstëtzt Zell Prolifératioun vun PTEN repressing. (A) huet AGS Zellen mat PBS, IL-1β behandelt, Mir-NC, Mir-425, an PTEN-CDen als uginn. No 72 h, war Zell Prolifératioun mat de Goalkeeper opgepasst hat Etikette Kit alles. (B) NCI-N87 Zellen sech mat Mir-NC transfected oder anti-Mir-425. No 72 h, war d'Zell Prolifératioun Taux mat de Kit hat Etikette alles. (C) AGS Zellen sech mat siRNA-PTEN oder Mir-425 behandelt. No 72 h, war Zell Prolifératioun mat de Goalkeeper opgepasst hat Etikette Kit alles. (D) Photoen vun PTEN FAQ Ausdrock vun der entholl Stoffer (ieweschte Brieder) an erhéijen (ënneschten Brieder). (E) D'Grafik weist d'Gewiicht vun den 3 erhéijen no 4 Wochen (n = 3). (F) Eng bedeitend ëmgedréit, et gesäit Korrelatioun tëschend der Mir-425 an PTEN Ausdrock Niveauen an der gastric Kriibs Stoffer (n = 52) observéiert. (G) Den Ausdrock Niveau vun PTEN sinn zu sechs normal gastric mucosa Zellen sech an gastric Kriibs Zell Linnen mat real-Zäit Hinnen alleguer. (H) E Modell z der putative Rollen vun IL-1β an Mir-425 zu der Kontroll vun der PTEN Passerelle an mënschlechen gastric carcinoma Zellen. VerfÜgung Mir den Effet vun Mir-425 propagéieren op tumorigenicity zu VIVO. D'erhéijen mat anti-Mir-425 behandelt zougedréckt a dem Niveau vun der PTEN FAQ (Dorënner 6D) fräi. Och, anti-Mir-425 reduzéiert der entholl Gewiicht vun der Mais am Verglach mat der Raumstatioun-NC-behandelt Grupp (Dorënner 6E). Benotzt Net-parametric Tester, hunn mir e wesentleche ëmgedréit, et gesäit Korrelatioun tëscht PTEN mRNA an Mir-425 Ausdrock vun der gastric Kriibs Echantillon (Dorënner 6F). Den Ausdrock Niveau vun PTEN goufen och zu sechs normal gastric mucosa Zellen an gastric Kriibs Zell Linnen mat real-Zäit Hinnen alleguer alles. Wéi dës, hunn d'Zellen mat "verwandelt-reegelen" Mir-425 héich Zommen vun PTEN Verglach zu Zell Linnen mat "up-reegelen" Mir-425 Niveauen (Dorënner 6G). Zu der Konklusioun, hunn eis Resultater bewisen dass Mir-425 engem causal Roll spillt PTEN duerch gezielt an gastric Cancers. VerfÜgung Diskussioun VerfÜgung Interleukin-1 (IL-1) ass eng grouss pro-demagogesch cytokine datt duerch malignant produzéiert gëtt oder microenvironmental Zellen [17]. IL-1 Funktiounen och als pleiotropic cytokine zu tumorigenesis an entholl invasiveness Équipe; dofir, stellt et eng Konsequenz Kandidat fir eng modulatory cytokine datt d'Gläichgewiicht tëscht inflammation an excellence géintiwwer der Aféierungs- vun antitumor Äntwerte Schréiegt kann [18]. IL-1α an IL-1β sinn déi grouss agonists vun IL-1. An hirem secreted Formen, IL-1α an IL-1β kruet zu der selwechter kenne an induce der selwechter biologescher Funktiounen [19]. Allerdéngs, IL-1α an IL-1β ënnerscheeden an hir compartmentalization bannent der Zell oder der microenvironment [20]. IL-1β ass nëmmen aktiv an hirer secreted Form an mediates inflammation, déi carcinogenesis, entholl invasiveness an immunosuppression ënnerstëtzt [21]. Verschidde Roman anti-IL-1β Agenten goufen zu Medeziner Prozesser an Patienten suer- verschiddenste Krankheeten mat demagogesch Manifestatiounen [22] benotzt. E bessere Verständnis vun der integrative Roll vun IL-1β Weeër an der malignant Prozess sécher wäert d'Applikatioun vum Roman IL-1β modulation Approche zu Kriibs Patienten aktivéiert. VerfÜgung PTEN war als eng wichteg entholl suppressor entdeckt, datt oft mutated ass oder verluer an verschidde Cancers [23]. Puer Zeilen Beweiser hunn PTEN als Lipid phosphatase ervirgehuewen, dass den 3 'phosphate zu phosphoinositides [24] hydrolyzes. PTEN kann och d'Aktivitéit vun der serine /threonine kinase AKT /PKB regléieren an domat Zell Iwwerliewe sécher Afloss kann [25]. UV aussetzt kann PTEN Interaktioun Iwwerleeung mat Wëld-Typ melanocortin-1 receptor Varianten, déi PTEN schützt aus WWP2-mediated ofgeschnidden, flénke AKT inactivation zu melanoma [26]. Et gi verschidde Mechanismen fir d'Regulatioun vun PTEN, dorënner Transkriptiouns, mRNA Stabilitéit, microRNA gezielt, Iwwersetzung an FAQ Stabilitéit. PTEN ass transcriptionally vum Promoteur methylation zu gastric carcinoma entsat [27]. PTEN kann och sinn Post-translationally vun acetylation reegelen, ubiquitylation, Chemiker, phosphorylation, an subcellular Lokalisatioun [28]. Trotz extensiv characterization vun PTEN kennen Mënsch Cancers an enger relativ gutt Verständnis vun de molekulare Rollen vun PTEN an der Kontroll vun bewosst Prozesser ass, wéineg iwwert Verkéiersmëttel vun PTEN Regulatioun bekannt. VerfÜgung PTEN kann zu Kriibs Zellen op Aféierungs- vun der inhibited ginn pro-demagogesch cytokine IL-1β [29]. Stimulatioun mat IL-1β activéiert NF-kappaB vun phosphorylation an ofgeschnidden vun IκB. Dëst Aktivéierung erlaabt NF-kappaB an der Keimzell ze translocate an transcriptionally aktivéieren Zil- Genen [30]. NF-kappaB ass eng heterodimeric Transkriptiouns activator aus der DNA bindend subunit p50 an der transactivation subunit p65 [31]. Héich Niveaue vu endogenous NF-kappaB ofgeholl den Ausdrock vun PTEN, an PTEN Ausdrock hätt duerch spezifesch inhibition vun der NF-kappaB Passerelle [32] gerett ginn. All Auteuren liesen an guttgeheescht der Finale mëttelalterlech Handschrëft. VerfÜgung

• Afloss vun IL17A schiefgang op der aberrant methylation vun DAPK an CDH1 an Net-kriibserreegend gastric mucosa
• Ongewéinlech trichobezoar vun de Mo an der Daarm: e Fall report