NF-kB ovisan mikrornk-425 regulaciju potiče želučane rast stanica raka ciljajući PTEN na indukciju IL-1

NF-kB ovisan mikrornk-425 regulaciju potiče rast stanica raka želuca ciljajući PTEN na IL-1 indukcije
apstraktna pregled prekomjerna ekspresija proupalnog citokina IL-1β je povezana s različitim bolestima, uključujući rak. Promjena mikroRNA je primijećeno u stanicama raka izloženim proupalnih citokina, a njihova uloga u upale stresa ostaje upitan. Ovdje ćemo pokazati da IL-1β izaziva reguliranje prema gore Mir-425, što je negativno regulira fosfataze i tensin izraz homologni ciljajući 3 'UTR. Povećanje Mir-425 ovisi o IL-1β-inducirane NF-kappaB aktivacije, što pojačava Mir-425 transkripciju gena na indukciju IL-1. Prema tome, represija fosfataza i tensin homologa strane Mir-425 promovira rak želuca proliferaciju stanica, koji je potreban kako bi zaštitili stanice od cisplatinom apoptozi. Uzeti zajedno, naši podaci podupiru ključnu ulogu NF-kB ovisan ranijim koracima Mir-425, što predstavlja novi put za represiju fosfataze i tensin homolognog aktivaciju i promicanje preživljavanja stanica nakon IL-1 indukcije. Pregled ključne riječi pregled, IL-1β NF-kB mir-425 PTEN Želučani Pozadina rak pregled želuca adenokarcinom je četvrti i peti najčešći rak kod muškaraca i žena, odnosno, u svijetu i snažno je povezana s kroničnom upalom [1]. To je sada dobro prihvaćen da je infekcija s Helicobacter pylori
(H. pylori
) igra važnu ulogu u nastanku kronične upale dovodi do malignosti [2]. Kronična upala želuca inicira histopatološko napredovanje kroničnog gastritisa želučanoj atrofije, crijevnih metaplazijama i raka želuca konačno [3]. Dok H. pylori pregled, infekcija je vrlo rasprostranjen, samo mala manjina (oko 1%) od zaraženih osoba će oboljeti od raka želuca, nakon mnogo godina. Varijabla odgovor na ovu zajedničku patogena čini se upravlja genetska predispozicija za visoke razine ekspresije proupalnih citokina [4].
Nuklearnog faktora kappa B (NF-kB) put je odavno smatra glavnim proupalnih signalni put, uglavnom se temelji na aktivaciju NF-kappaB pomoću proupalnih citokina i ulogu NF-kappaB u aktivaciji transkripcije reaktivnih gena uključujući citokina i kemokina [5]. Na "kanonski" put za NF-kappaB aktiviranje se pokreće pomoću proupalnih citokina kao što je IL-1 p i obično dovodi do aktivacije odnosima ili kompleksa cRel sadrže [6]. NF-kB postoji u citoplazmi u neaktivnom obliku koji je povezan s regulacijskih proteina nazivaju inhibitori kB (IκB), od kojih je najznačajniji može biti IκBα, IκBβ i IκBε. IκBα je povezana s prolaznim aktivacije NF-kappaB, dok IκBβ je uključen u održivi aktivacije [7]. Međutim, kronična upala je složen fiziološki proces, a uloga NF-kB u upalnom odgovoru još nije u potpunosti istražena.
Osim utječu na ekspresiju gena za kodiranje proteina, upala stres također mijenja razinu ekspresije mikroRNA (miRNAs) [8]. MikroRNA su klasa endogenih mali nekodirajuće RNA koje negativno reguliraju ekspresiju gena na post-transkripcijskoj razini uglavnom preko vezanja na 3 'netranslatirane regije ciljne mRNA, i oni imaju važne regulatorne funkcije u kontroli raznoliko fiziološko i patološki procesi [9, 10]. Te RNA su pokazala da su uključene u regulaciju brojnih staničnih procesa uključujući proliferaciju, diferencijaciju i apoptozu [11-13]. Međutim, da li kronična upala regulira ekspresiju Mirna modulacijom transkripciju gena ili mijenjanje post-transkripcijski sazrijevanje nije određena.
U ovom radu, utvrdili smo da je Mir-425 indukcija na IL-1β-inducirane upale ovisila je o aktivaciji NF-kB, koji je pojačan na transkripciju gena mir-425. Osim toga, regulira prema gore Mir-425 direktno ciljane fosfataze i tensin homologa (PTEN) i negativno regulirati svoj izraz, koji je promicao preživljavanje stanica nakon IL-1 indukcije. Pregled Eksperimentalni postupci
etiku izjave pregled svih uzorci dobiveni iz pacijenti koji su podvrgnuti operaciji na Sveučilištu Fudan Šangaju Cancer Center. Protokol je odobren od strane kliničkih istraživanja Etičko povjerenstvo Sveučilišta Fudan, a istraživanje je provedeno u skladu s odredbama Helsinškog Deklaracije 1975. pripadajućih normalnih tkiva izrezani su daleko od želuca lezija raka makroskopski, a njihova histološki dijagnoza je potvrđena mikroskopski. Pismeni informirani pristanak dobiven je od svih sudionika uključenih u studiju. Pregled Stanična kultura i reagensi
ljudske embrionalne stanice bubrega HEK293 (ATCC® CRL-1573 ™), ljudski rak dojke stanične linije MDA-MB361 (ATCC ® HTB-27 ™), humani želučani linijske stanice adenokarcinoma AGS (ATCC® CRL-1739 ™) SNU-1 (ATCC® CRL-5971 ™) SNU-5 (ATCC® CRL-5973 ™) SNU-16 (ATCC® CRL 5974 ™) Hs746T (ATCC® HTB-135 ™), NCI-N87 (ATCC® CRL-5822 ™) i KATO III (ATCC®HTB-103 ™) su održavane u DMEM koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma. Sve stanične linije su održavane u mediju koji sadrži penicilin (100 IU /ml) i streptomicin (100 mg /ml) pri 37 ° C s 5% CO 2. Mirne oponaša i anti-Mirni su kupljeni od Ambion (Austin, TX, USA). Je inhibitor IKK TPCA-1 (Mačka Br. S2824) inhibitor p38 MAPK BIX02188 (Mačka Br. S1574) i JNK inhibicijska SP600125 (Mačka Br. S1460) kupljeni su od Selleckchem (Houston, TX, USA). Rekombinantni humani IL-1β su nabavljeni od Sigma-Aldrich (kat. Br H6291, Shanghai, Kina). Pregled ekstrakcija RNA i u realnom vremenu PCR pregled Ukupna RNA je ekstrahirana iz stanica pomoću Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA ). Za mikrornk analizu, poli (A) rep dodani su ukupne RNA koristeći poli (A) polimeraza (Ambion, Carlsbad, CA) prije reverzne transkripcije. MiRcute Mirna qPCR otkrivanje kit (TIANGEN, Peking, Kina) je korištena kako bi se odredila razina ekspresije zrelog Mir-425 u skladu s uvjetom protokolu, a GAPDH je korištena kao interna kontrola. Real-time PCR je proveden pod sljedećim uvjetima: 95 ° C 10 m, 1 ciklus; 95 ° C 10 s, 55 ° C 34 s, 40 krugova.
Za sve rezultatima dobivenim u realnom vremenu PCR metoda, koristili smo delta delta CT metoda za izračunavanje puta promjene u ekspresiji gena između različitih skupina. Količina cilja (PTEN /Mir-425), normalizirana na endogene ponudi gena GAPDH i u odnosu na referentni uzorak, dan je sljedećom jednadžbom:. Iznos target = 2 - △△ CT pregled Imunobloting
Proteini su odvojeni na 10% SDS-PAGE gelu i zatim se prenosi na PVDF membrani. Nakon blokiranja s 5% -tnim nemasnim mlijekom, membrana se inkubira s mišjim monoklonskim anti-PTEN protutijelom (1: 500, Santa Cruz, SC-7974) i NF-kapa B P65 fosfo (pS536) (relativnog) protutijela (1: 10000 ., EPITOMICS, Mačka #: 2220-1). IRdye-obilježena sekundarna antitijela se koriste za određivanje količine imunobloting signala, a signali su analizirani pomoću Odyssey skeneru (Li-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA). Pregled Luciferaze pregled HEK293 stanice i AGS stanica bile transfecirane mir-425 i pGL3 luciferaza reporter konstrukti koji nose ciljni slijed mir-425. Nakon 24 sata, aktivnosti luciferaze krijesnice i Renilla luciferaze u staničnim lysates su mjereni sa Dual-luciferaze System (Promega, Madison, WI, USA). Za luciferaze transkripcije reporterskog testu Mir-425 gena promotorske sekvence (WT ili lokacija brisanje) klonirani su u promotorske regije pGL3-Basic vektor, a aktivnost luciferaze je mjerena kao što je opisano gore.
Kromatina imunoprecipitaciju (čip)
Ukratko, tretirane stanice su umreženi s 1% formaldehida, izrezan do prosječne veličine 400 bp, a nakon toga imunoprecipitiran s antitijelima protiv NF-kB (Santa Cruz, sC-166.588). Čip-PCR primeri su dizajnirani da pojača promotorska područja koji sadrže navodne vezna mjesta NF-kB unutar Mir-425 kao što je prikazano. Korištene su Pozitivna kontrola antitijelo (RNA polimeraza II) i negativna kontrola neimunim IgG da se pokaže efikasnost kit reagensa (Epigentek Group Inc, P-2025-48). zatim imunoistaloži DNA očišćen, objavljen i ispere. Eluirani DNA može se koristiti za daljnjim primjenama čip-PCR. Struko obogaćenje (FE) izračunata je pomoću omjera amplifikaciju učinkovitosti uzorka čip preko one neimunim IgG. Pojačanje učinkovitost Polymerase RNA II je korišten kao pozitivna kontrola. FE% = 2 (IgG CT - Uzorak CT). × 100% Test pregled stanične proliferacije pregled ispitivanjem razmnožavanja stanica izvedena je pomoću brojanja Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) u skladu s upute proizvođača. Prije dodavanja CCK-8, stanice su isprane s toplim mediju kulture vrtnjom ploče pri 500 rpm 3 m, a zatim odbacivanje supernatant.
Cell Test apoptoze pregled Stanice raka su sakupljene i resuspendirane u 500 ul veznog pufera. Suspenzije stanica (100 ul) je inkubiran s 5 jal aneksin V-propidij jodidom, a na sobnoj temperaturi tijekom 20 minuta. Obojene stanice su analizirane pomoću fluorescentno aktiviranih sortiranje stanica (FACS) koristeći BD LSR II citometrije. Pregled staničnog ciklusa analiza pregled Za analize protočnom citometrijom, stanice su tripsinizirane i fiksirane u 70% etanolu preko noći. Stanice su zatim inkubirane u 0,5 ml propidij jodida otopine koja sadrži 25 u.g -1 RNase tijekom 15 minuta na 37 ° C i izmjerena. Pregled miša pokusi
NCI-N87 stanice (3 x 10 6) je injektirano u desni bokova atimičnih nu /nu miševa. Tjedan dana nakon injekcije, miševi s usporedivo tumore su bili tretirani 4 tjedna s anti-MIR-425. Anti-Mir-425 (2 nmol) su ubrizgava izravno u tumor dva puta tjedno tijekom 4 tjedna. Pregled, Statistička analiza pregled, rezultati su prikazani kao srednje vrijednosti ± SEM, a podaci su analizirani Studentov t test. Vrijednost p Netlogu < 0,05 smatrana je statistički značajna. Pregled Rezultati
IL-1 tretman potiče Mir-425 ekspresija
za karakterizaciju miRNAs odgovorne za IL-1 indukcije, profilirani smo izraz Mirne na PBS-AGS stanice i IL-1 pobuđenog AGS stanice koriste Array sustava Exiqon miRCURY ™ LNA (v.14.0). Razine Mirni znatno razlikovala između PBS-tretirane skupine i IL-1β induciranog skupine, kao što je prikazano u karti topline koji je prikazan na slici 1A. Među 1.891 hvatanje sondi, 46 miRNAs su različito izraženi u AGS stanicama IL-1 inducirane u usporedbi s uparenim PBS-AGS stanica; tih miRNAs 29 je povećana i 17 bili smanjeni u IL-1 inducirane AGS stanicama (tablica 1), pokazuje da specifična Mirni uzorak je povezano s IL-1 indukcije. Slika 1 deregulacija miRNAs u ljudskim AGS stanica tretiranih sa IL-1. (A) Ljudski AGS stanice su obrađene s IL-1 (10 ng /ml) [14] i 24 h kasnije, profil miRNAs ekspresija je analizirana mikropolja tehnologije. Dijagram karta topline generirani od strane nekontroliranog analizu klastera s 46 znatno nereguliranom miRNAs. Crvena boja označava povećanje ekspresije; zelena označava downregulation. (B) Povećana razina Mir-425 u 36 tumorskih uzoraka u odnosu na njihove razine u podudarnih susjedna normalna tkiva kao mjerene u realnom vremenu PCR. Normalne: susjedna normalnog tkiva. (C) razina ekspresije Mir-425 ispitan je u realnom vremenu PCR u nekoliko staničnih linija raka želuca i šest normalne sluznice želuca stanica. Pregled Tablica 1. Značajno deregulacija miRNAs pregled izraženo u IL-1 inducirane AGS stanicama
Mirna
mnogostrukost promjene
p vrijednost
HSA-mir-425 pregled 12.36 pregled 0.00
hsa-miR-584
11.03
0.01
hsa-miR-31
8.12
0.00
hsa-miR-155
6.22
0.00
hsa-let-7i
5.55
0.00
hsa-miR-21
5.11
0.00
hsa-miR-335
4.89
0.01
hsa-miR-191
4.73
0.03
hsa-miR-519d
4.37
0.02
hsa-miR-520d-5p
3,95
0.00
hsa-miR-331
3.67
0.01
hsa-miR-142
3.45
0.01
hsa-miR-518a-5p
3.28
0.01
hsa-miRPlus-F1231
3.11
0.01
hsa-miR-2113
2.94
0.02
hsa-miR-196a*
2.88
0.02
hsa-miR-1304
2.78
0.02
hsa-miR-185
2.65
0.01
hsa-let-7a
2.61
0.00
hsa-miR-130
2.52
0.02
hsa-miR-1280
2.50
0.01
hsa-miR-222
2.47
0.01
hsa-let-7c
2.43
0.00
hsa-miR-602
2.31
0.00
hsa-miR-548e
2.31
0.03
hsa-miR-32
2.27
0.04
hsa-miR-181a
2.24
0.02
hsa-miR-7
2.13
0.00
hsa-miR-21*
2.06
0.00
Underexpressed u IL-1 inducirane-AGS stanica
Mirna pregled Fold promjena
p vrijednost
hsa-miR-143
0.06
0.02
hsa-miR-200
0.08
0.01
hsa-miR-451
0.13
0.01
hsa-miR-144
0.17
0.00
hsa-miR-363
0.20
0.01
hsa-miR-637
0.25
0.03
hsa-miR-153
0.39
0.01
hsa-miR-139
0.39
0.00
hsa-miR-617
0.42
0.01
hsa-miR-1915
0.43
0.00
hsa-miRPlus-F1153
0.45
0.00
hsa-miR-381
0.46
0.00
hsa-miR-145
0.47
0.02
hsa-miR-659
0.47
0.03
hsa-miR-125b
0.48
0.00
hsa-miR-183*
0.49
0.00
hsa-miR-638
0.49
0.01
*: Kad se dva zrele miRNAs potječu iz suprotnih krakova iste prije Mirne zvjezdicom sljedećem ime ukazuje na Mirni izražena na niskim razinama u odnosu na Mirni u suprotnom rukom od ukosnica
Među tim miRNAs, miR-. 425 je većina visoko regulira prema gore na indukciju IL-1. Korištenje u realnom vremenu PCR analiza, analizirali smo Mir-425 izražavanje u 36 uparenih uzoraka (tumora i susjednih normalnih tkiva od istog pacijenta). Pronašli smo značajno višu razinu Mir-425 izražavanja u uzorcima tumora u odnosu na razine iz susjednih normalnim tkivima (p izvoznici < 0.0001) (Slika 1B). Ispitali smo razinu ekspresije Mir-425 u kompletu želučanih staničnim linijama karcinoma i šest normalnih želučane sluznice stanica. Kao što je prikazano na Slici 1C, pokupili smo do AGS stanice s dolje održavanoj Mir-425 i NCI-N87 stanica s up-regulirana Mir-425 za daljnje istraživanje. Iako je aktivacija Mir-425 je izvijestio da su temeljni utjecaj na početak i progresiju stanica raka raka smanjenjem ekspresije veliku mrežu genima [15], uloga Mir-425 rakom u čovjeka, nije razjašnjen , . Stoga smo odabrali Mir-425 radi daljnje istrage pregled Izražavanje PTEN negativno reguliran je Mir-425 pregled Identificirati ciljeve Mir-425, zaposleni smo najčešće koristi algoritam, miRecords (http: //mirecords . biolead. org /), koji je integriran resurs za životinjske Mirna ciljanoj interakcije. Kako bi se povećala točnost predviđanja, gena koji su predvidjeli najmanje pet od jedanaest bazama podataka (Diana, microinspector, Miranda, mirtarget2, mitarget, nbmirtar, pictar, Pita, rna22, rnahybrid i targetscan) su odabrani kao tobožnjih ciljeva. Među tim navodnih meta Mir-425, gen ontologije analiza pokazala je da je razina ekspresije 9 gena kandidata su promijenjeni; dakle, to promjena mogla pridonijeti maligni fenotip. Korištenje 3 'UTR luciferaze reporter testovima, otkrili smo da je izražajnost Mir-425 značajno inhibira aktivnosti luciferaze u HEK293 stanice i AGS stanica koje eksprimiraju divlji tip PTEN 3' UTR reporter (slika 2a). Potvrdili smo da PTEN se pretpostavlja da je izravna meta Mir-425. Za ilustraciju specifičnost Mir-425, pokazali smo da anti-Mir-425 posebno je ukinula inhibiciju aktivnosti luciferaze izazvane Mir-425 u HEK293 stanice i NCI-N87 stanica (Slika 2b). Mutacije u veznih mjesta Mirna (slika 2c) donio konstrukti ne reagira na Mir-425 indukcije (Slika 2D), što dodatno potvrđuje da je PTEN gen je izravna meta Mir-425. Slika 2 Mir-425 izravno cilja PTEN. (A) Reporter test u HEK293 stanicama i stanicama transfektiranim s AGS Mir-425 i konstrukata nose cDNA za luciferazu je spojen na 3 'UTRs unaprijed zadanih ciljeva kandidata (srednja vrijednost ± SEM). (B) Učinci anti-Mir-425 na aktivnosti luciferaze luciferaze konstrukata spojen sa 3 'UTRs od PTEN u HEK293 stanice i NCI-N87 stanica (srednja vrijednost ± SEM). (C, D) Reporter test u HEK293 stanice i AGS stanica transfeciranih konstruktima luciferazom nose PTEN 3 'UTRs s mutacijama na mjestima Mir-425 vežu (srednja vrijednost ± SEM). (E) HEK293 stanice i AGS stanice su transfektirane s konstruktom luciferaze nosi divlji tip PTEN 3 'UTR (LUC-WT) ili konstrukt koji nosi mutirani PTEN 3' UTR (LUC-Mut). Nakon 24 sata, stanice su tretirane s IL-1, a aktivnost luciferaze je kvantificiran 24 sati nakon tretmana. (F) Western blot i RT-PCR pokazuje razinu PTEN proteina i mRNA u AGS stanica nakon 48 sata od Mir-425 ubacivanja. (G) AGS stanice su transficirane s anti-Mir-425, a 24 sata kasnije, stanice su bile ili netretirani ili su tretirani s IL-1, a nakon toga prikupe 24 sati nakon tretmana. Cijeli stanični lizati imunoblot uz PTEN protutijela. (H) NCI-N87 stanice su transficirane s anti-Mir-425 i prikupe 24 sati nakon tretmana. Cijeli stanični lizati imunoblot uz PTEN protutijela. (I) AGS stanice su transfektirane sa plazmidom koji nosi samo otvoren okvir čitanja slijed PTEN (PTEN-CD). Nakon 24 sata, stanice su tretirane s IL-1 i Mir-425. Cijeli stanični lizati su podvrgnuti imunoblot nakon 24 sata od tretmana. (* P 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001)
Nadalje, mutacija miR-425 ciljne sekvence također značajno smanjuje IL-1β inducirane represiju PTEN 3 'UTR. aktivnost luciferaze reporter u HEK293 stanice i AGS stanicama (Slika 2e). Prekomjerna ekspresija Mir-425 bio je dovoljan da se dodatno regulira ekspresiju PTEN na razini proteina i mRNA u AGS stanica (Slika 2F). Prema tome, IL-1β-inducirana PTEN represija je spasio izražavajući anti-MIR-425 u AGS stanicama (Slika 2G). Anti-miR-425 je u mogućnosti da se regulira ekspresiju PTEN u NCI-N87 stanica bez IL-1 stimuliranje (Slika 2H).
Naši podaci također pokazuju da je 3 'UTR je potreban za miR-425 posredovanog PTEN smanjenom jer izraz PTEN kodiranja konstrukt regije (PTEN-CDS) bio je neosjetljiv na mir-425 prekomjernom ekspresijom i IL-1 indukcije u AGS stanica (Slika 2i). Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju da Mir-425 ima ključnu ulogu u suzbijanju PTEN izraz ciljajući 3 'UTR na IL-1 indukcije. Pregled, IL-1β inducirane NF-kB aktivaciju potreban je za Mir-425 indukcije
Da bi se odredio mehanizam koji su uključeni u miR-425 transaktivacije nakon IL-1 indukcije, ispitali smo učinak različitih inhibitora kinaze na miR-425 indukcije u miševima tretiranih s IL-1β-AGS stanica. IL-1β inducirane miR-425 regulaciju značajno inhibirane pomoću inhibitora IKK TPCA-1, ali ne i inhibitora BIX02188 p38 MAPK ili SP600125 inhibitora JNK (slika 3A). Prethodna ispitivanja su pokazala da se IKK bitan kinaza potreban za NF-kappaB signalizacije; Stoga, ovaj rezultat pokazuje kritičnu ulogu NF-kappaB signalizaciju u regulaciji Mir-425 transkripcije nakon indukcije IL-1. Slika 3 aktivaciju IKK potreban za izazivanje Mir-425 kao odgovor na indukciju IL-1. (A) AGS stanice su obrađene s IL-1 u prisutnosti inhibitora IKK TPCA-1, inhibitor BIX02188 p38 MAPK i inhibitora JNK SP600125. Zreli miR-425 ekspresija u 12 sati nakon tretmana se kvantificira u realnom vremenu PCR. Mnogostrukost promjene relativne miR-425 ekspresije (Mir-425 /U6) je normalizirana na istom kod PBS-om tretiranih stanica. (B) izraz primarne Mir-425 (pri-Mir-425) analizirana je real-time PCR kao u A. (c) razine ekspresije NF-kappaB proteina i pri-Mir-425 analizirani su stvarnost time PCR u AGS stanice tretirane iRNK za NF-kB. (D) AGS stanice su tretirane s inhibitorima kemije ili iRNK za NF-kB. Stanični lizati su dobiveni 24 h nakon IL-1 tretman imunoblot uz PTEN protutijela. (E) Western blot analiza fosforiliranog NF-kappaB (P65 serin 536). (F) Ekspresijske razine NF-kappaB proteina i pri-miR-425 analizirani su u realnom vremenu PCR u NCI-N87 stanice tretirane iRNK za NF-kB. (* P 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0,001).
Dosljedno, indukcija pri-Mir-425 na IL-1 liječenja bila je značajno inhibirana u prisutnosti inhibitora IKK ili siRNA za NF-kB (slika 3B i C). Također primijetili da IL-1β inducirane PTEN represija je oslabljena u prisutnosti inhibitora IKK ili iRNK za NF-kB (Slika 3d). Da bi se utvrdilo da li NF-kB aktivnost bila je prisutna u AGS stanica tretiranih s IL-1, koristili smo western blot za određivanje razine fosforilirane NF-kappaB P65 (serin 536). Razina fosforiliranog NF-kappaB (P65 serin 536), bio je visoko AGS stanica tretiranih sa IL-1 (10 ng /ml; 24 sata) (Slika 3E). Osim toga, prigušenje NF-kappaB inhibirala miR-425 ekspresiju u NCI-N87 stanica bez IL-1 liječenja (Slika 3F). Ovi rezultati ukazuju na to IKK-ovisnu aktivaciju NF-kB nakon IL-1 tretmana je potrebno za PTEN silazni, najvjerojatnije preko svog unapređenje Mir-425 transkripcije.
Bi se utvrdilo je li NF-kB izravno regulira Mir-425 transkripciju, mi analizirao uzvodno sekvence Mir-425 pomoću WeightMatrix knjižnicu (matrixTFP60.lib) i utvrđena su tri potencijalna mjesta NF-kB vezivanje u promotorske regije Mir-425 (cut-off: matrica sličnosti = 0,9 i temeljne sličnosti = 0,95) ( slika 4A). Izvršili smo kromatina imunoprecipitaciju (chip) testova s ​​AGS stanice raka koriste monoklonska anti-NF-kB antitijela. Kao što je prikazano na slici 4B, samo primer-B Mir-425 proizveden je jaki PCR proizvoda, što sugerira da je NF-kB protein oblikovan komplekse sa veznog mjesta B u miR-425 promotora. Rezultati ispitivanja luciferaze sugerira da je potencijalni B vezanja na miR-425 promotora je potreban za transaktivaciju nizvodnog gena nakon indukcije IL-1 (Slika 4A i C). Slika 4 vezna NF-kB u Mir-425 promotora. (A) Značajke Mir-425 5 'postranični DNK. Ljudska promotorske regije Mir-425 sadrže tri pretpostavljena mjesta za vezanje NF-kB. (B) čip testovi s anti-NF-kB antitijela pokazala vezanje NF-kB na promicatelj Mir-425 u AGS stanicama. Relativne zauzetost NF-kappaB označeni su okomite trake. Grafove pokazati prosjeka tri neovisna pokusa čip. (C) Promotor Mir-425 je aktiviran NF-kB. AGS stanice su tretirane s NF-kB i transfektirane s naznačenim LUC vektora. Pregled Induction Mir-425 potiče preživljavanje stanica nakon IL-1 indukciju pregled Pokazano je PTEN je među najčešće inaktiviranim gena za suzbijanje tumora. Prekomjerna ekspresija PTEN u različitim stanicama za kulturu tkiva sisavaca utječe na različite procese, uključujući staničnu proliferaciju, smrt stanica i migraciju stanica [16]. Također smo otkrili da inhibicija PTEN smanjio aktivacije kaspaze-3 u stanicama koje su tretirane s IL-1 (Slika 5A). Vjerojatno je da Mir-425 indukcija može inhibirati apoptozu preko silazni PTEN u stanicama IL-1 tretirane. Doista, pojačanom ekspresijom Mir-425 inhibiran kaspaze-3 aktiviranje u AGS stanica cisplatin liječi (slika 5B). Osim toga, u cisplatin tretiranih AGS stanica kotransfekcijom konstruktom koji sadrži samo PTEN kodirajuću regiju (PTEN-CD), koji je neosjetljiv na Mir-425, zaobići antiapoptotski učinak miR-425 ekspresijom (Slika 5C). S tim u skladu, transfekcija anti-Mir-425 u AGS stanicama znatno poboljšana kaspaze-3, aktivaciju i apoptozu kao odgovor na IL-1 liječenja (Slika 5D). Osim toga, transfekcii anti-Mir-425 u NCI-N87 stanica značajno poboljšana kaspaze-3 aktiviranje i apoptozu bez IL-1 stimulacije (Slika 5E). Slika 5 Mir-425 inhibira staničnu apoptozu suzbijanja PTEN. (A). AGS stanice su tretirane s kontrolom (PBS) ili IL-1. Nakon 48 sati, cijela stanični lizati imunoblot. (B). AGS stanice prolazno su transfecirane negativne kontrole (Mir-NC) ili Mir-425 sam. Nakon 24 sata, stanice su tretirane sa cisplatinom i prikupe 24 sati nakon tretmana. Cijeli stanični lizati imunoblot. (° C). AGS stanice su transficirane s Mir-NC, Mir-425, i PTEN-CDS kako je naznačeno. Nakon 24 sata, stanice su tretirane sa cisplatinom i prikupe 24 sati nakon tretmana. Brzina apoptoze stanica određena je pomoću protočne citometrije metodom. (D). AGS stanice su transficirane s Mir-NC ili anti-MIR-425. Nakon 48 sati, stanice su tretirane s IL-1 i prikupe 24 sati nakon tretmana. Ukupni stanični lizati su imunoblot označenim protutijelima, a brzina apoptoze stanica određena je pomoću protočne citometrije metodom. (E) NCI-N87 stanice su transficirane s Mir-NC ili anti-MIR-425. Ukupni stanični lizati su imunoblot označenim protutijelima, a brzina apoptoze stanica određena je pomoću protočne citometrije metodom.
Skladu s ulogom u inhibiranju aktivaciju kaspaze, doreguliranje Mir-425 značajno poboljšanu AGS stanica, dok pro- učinak preživljavanja je u potpunosti blokirana kotransfekcije s egzogenim PTEN (PTEN-CDS) (Slika 6A). Anti-miR-425 je smanjen postotak proliferacijom stanica za NCI-N87 stanica (Slika 6b). Također smo otkrili da inhibicija PTEN zaštitno djelovanje slično onom u stanicama ekspresijom Mir-425 (slika 6C), što ukazuje da PTEN potiskivanje može igrati važnu ulogu u miR-425 ovisan zaštitu stanica tretiranih s IL-1. Slika 6 Mir-425 potiče staničnu proliferaciju suzbijanja PTEN. (A) AGS stanice su tretirane s PBS-om, IL-1, Mir-NC, Mir-425 i PTEN-CDS kao što je naznačeno. Nakon 72 h, stanična proliferacija se određuje korištenjem edu kita za označavanje. (B) NCI-N87 stanice su transficirane s Mir-NC ili anti-MIR-425. Nakon 72 h, velik broj proliferacije stanica je određena korištenjem edu kita za označavanje. (C) AGS stanice su tretirane s siRNA-PTEN ili Mir-425. Nakon 72 h, stanična proliferacija se određuje korištenjem edu kita za označavanje. (D) Fotografije PTEN ekspresiju proteina u tumorskim tkivima (gornje tribine) i tumora (donje plohe). (E) Graf prikazuje težinu 3 tumora nakon 4 tjedna (n = 3). (F) Značajna Inverzna korelacija opažena između razine ekspresije Mir-425 i PTEN u želučanim tkivima raka (n = 52). (G) Razina ekspresije PTEN se određuje za šest normalne želučanu sluznicu stanica i rak želuca staničnim linijama uz korištenje PCR u realnom vremenu. (H) Model prikazuje pretpostavljena uloga IL-1 i Mir-425 u kontroli PTEN put u ljudskim stanicama karcinoma želuca.
Istraživali smo učinak Mir-425 na torn smjeru in vivo. Tumori tretirani s anti-Mir-425 pokazala povišene razine u PTEN proteina (Slika 6D). Također, anti-miR-425 smanjio težinu tumora miševa u odnosu na tretirane miR-NC-skupine (Slika 6E). Korištenje ne-parametarske ispitivanja, pronašli smo značajnu inverznu korelaciju između PTEN mRNA i Mir-425 izražavanja u uzorcima želučane raka (Slika 6F). Razina ekspresije PTEN također određene u šest normalne želučanu sluznicu stanica i rak želuca staničnim linijama uz korištenje PCR u realnom vremenu. Kao što je prikazano, stanice sa "dolje-regulira" MIR-425 imaju veće količine PTEN odnosu na staničnim linijama sa "up-regulirana" MIR-425 razina (Slika 6 g). U zaključku, naši rezultati su dokazali da je Mir-425 ima uzročnu ulogu kroz ciljanje PTEN u želučanim raka. Pregled Rasprava
interleukin-1 (IL-1) je jedan od glavnih pro-upalni citokin koji je proizveden od strane maligni ili microenvironmental stanice [17]. IL-1 također funkcionira kao pleiotropni citokin uključen u nastanku tumora i tumora invazivnosti; dakle, predstavlja mogući kandidat za modulacijskog citokina koji se može nagnuti ravnotežu između upale i imunosti prema indukciji antitumorskih odgovora [18]. IL-1α i IL-1β su glavni agonisti IL-1. U svojim izlučenih oblika, IL-1 a i IL-1β vežu na iste receptore i da induciraju iste biološke funkcije [19]. Međutim, IL-1α i IL-1β razlikuju po svojoj kompartmentalizacija u stanici ili mikro [20]. IL-1β je aktivan samo u luče obliku i posreduje upalu, koja promiče karcinogeneze, napade tumora i imunosupresije [21]. Neki novi anti-IL-1 agensa su korišteni u kliničkim ispitivanjima na pacijentima koji pokazuju različite bolesti kod upalnih manifestacija [22]. Bolje razumijevanje integrativne uloge IL-1β signalnih putova u malignog procesa omogućit će primjenu novih IL-1 modulacije pristupi u pacijenata oboljelih od raka. Pregled PTEN je otkrivena kao važan tumor supresor koji se često mutirani ili izgubljenu u raznih oblika raka [23]. Neki dokazi su naglasili PTEN kao lipida fosfataze koja hidrolizira 3 'fosfata u fosfoinozitida [24]. PTEN može regulirati aktivnost serin /treonin kinaze Akt /PKB i na taj način može utjecati na preživljenje stanica signaliziranje [25]. UV izlaganje može izazvati PTEN interakciju s divljim tipom melanokortin-1 varijanata receptora, koji štiti od razgradnje PTEN WWP2 posredovanog, što dovodi do inaktivacije AKT u melanomu [26]. Postoji više mehanizama za regulaciju PTEN, uključujući i prepisivanje, mRNA stabilnost, mikrornk ciljanje, prijevod i stabilnost proteina. PTEN transcriptionally se prigušuje promotora metilacije u želučanom karcinomu [27]. PTEN također može biti post-translacijski regulirana acetilaciju, ubiquitylation, oksidacijom, fosforilacije i podstanično lokaliziranje [28]. Unatoč opsežnim karakterizaciju PTEN mutacija u ljudskim tumorima i relativno dobro razumijevanje molekularnih uloga PTEN u kontroli stanične procese, malo se zna o načinima PTEN regulacije. Pregled PTEN može biti inhibirana u stanicama raka nakon indukcije upalni citokin IL-1β [29]. Stimulacija s IL-1 aktivira NF-kB po fosforilacije i degradacije IκB. Ova aktivacija omogućuje NF-kB za pomjeriti u jezgru i transkripcijski aktivira ciljnih gena [30]. NF-kB je heterodimerni transkripcijski aktivator koji se sastoji od DNA vezanja podjedinica p50 i transaktivacija podjedinica p65 [31]. Visoke razine endogenog NF-kB smanjio izražaj PTEN, a izraz PTEN može spasiti specifičnom inhibicijom NF-kappaB puta [32]. Svi autori pročitali i odobrili konačnu rukopis. Pregled

• Utjecaj IL17A polimorfizama na poremećenim metilacije DAPK i CDH1 u ne-kancerozne želučane mucosa
• Neobična trichobezoar želuca i crijeva: slučaj report