NF-kappaB-függő mikroRNS-425 upreguláció elősegíti gyomorrák sejtek növekedését célozzák PTEN után az IL-1β induction

NF-kappaB-függő mikroRNS-425 upreguláció elősegíti gyomorrák sejtek növekedését célozzák PTEN után az IL-1β indukciós katalógusa Abstract
overexpressziója a proinflammatorikus citokin IL-1β társul változatos betegségek, beleértve a rákot. Megváltoztatása mikroRNS észlelték rákos sejtek ki vannak téve a proinflammatorikus citokinek, mégis a funkciójukat a gyulladásban stressz megfoghatatlan marad. Itt megmutatjuk, hogy az IL-1β indukálja túlszabályzását miR-425, amely negatívan szabályozza foszfatáz és tenzinhomológ kifejezés megcélozva a 3 'UTR. A növekedés miR-425 függ az IL-1β-indukált NF-kappaB aktiválás, ami növeli a miR-425 gén transzkripció után az IL-1β indukció. Következésképpen elnyomása foszfatáz és tenzinhomológ által miR-425 elősegíti a gyomor rákos sejtek proliferációját, ami szükséges, hogy megvédje a sejteket a cisplatin indukálta apoptózis. Mindezzel együtt, az adatok alátámasztják a kritikus szerepet játszik az NF-kappaB-függő túlszabályzását miR-425, amely egy új utat, amely az elnyomás foszfatáz és tenzinhomológ aktiválás és előmozdítása sejtek túlélését követően az IL-1β indukció. Katalógusa Kulcsszavak katalógusa IL-1β NF-kappaB miR-425 PTEN Gyomorrák Háttér katalógusa Gyomor adenocarcinoma a negyedik és az ötödik leggyakoribb daganatos között a hímek és nőstények, illetve az egész világon, és szorosan összefügg a krónikus gyulladás [1]. Ma már elfogadott, hogy Helicobacter pylori katalógusa (H. pylori
) fontos szerepet játszik a kiváltó krónikus gyulladás vezető malignus [2]. A krónikus gyulladás a gyomor kezdeményezi a kórszövettani progresszióját krónikus gyomorhurut gyomor atrophia, intesztinális metaplasia és végül gyomorrákban [3]. Míg a H. pylori fertőzés katalógusa rendkívül elterjedt, csak egy kis része (körülbelül 1%) a fertőzött egyének fejleszteni gyomorrák sok év után. A változó válasz erre közös kórokozó úgy tűnik, hogy szabályozza a genetikai hajlam a magas szintű expresszióját gyulladásos citokinek [4].
A nukleáris faktor kappa B (NF-kappaB) útvonal már régóta jelentős gyulladáskeltő jelátviteli, nagyrészt a NF-kappaB által gyulladásos citokinek és a szerepe az NF-kappaB a transzkripciós aktiválását reagáló gének, beleértve a citokinek és kemokinek [5]. A "kanonikus" Út az NF-kappaB aktiválás által kiváltott gyulladásos citokinek, mint az IL-1β, és általában vezet aktiválását kapcsolatok vagy cRel-tartalmú komplexek [6]. NF-kappaB létezik a citoplazmában inaktív formában társított szabályozó fehérjék említett inhibitoraiként kB (IκB), amelyek közül a legfontosabb lehet kBa, IκBβ, és IκBε. KBa társul tranziens NF-kappaB aktiválás, mivel IκBβ részt vesz a tartós aktiválása [7]. Azonban a krónikus gyulladás egy összetett élettani folyamat, és a szerepe a NF-kappaB a gyulladásos válasz még nem teljesen feltárt.
Amellett, hogy érintő fehérjét kódoló gén expresszióját, gyulladás stressz is megváltoztatja expressziós szintjének mikroRNS (miRNS) [8]. A mikroRNS egyik osztályát az endogén, kicsi, nem kódoló RNS-ek, amelyek negatívan szabályozzák a génexpressziót a poszt-transzkripciós szintű főleg keresztül kötődik a 3 'nem transzlálódó régiójának egy cél-mRNS, és fontos szabályozási funkciók a kontroll a különböző fiziológiai és kóros folyamatokat [9, 10]. Ezek RNS-ek már kimutatták, hogy részt vesz a szabályozásában számos sejtes folyamatot, beleértve a szaporodást, a differenciálódást és apoptózist [11-13]. Azt azonban, hogy a krónikus gyulladás szabályozza miRNS expressziós modulálásával gén transzkripcióját vagy megváltoztatását poszttranszkripciós érés még nem határozták meg.
Ebben a munkában azt találtuk, hogy a miR-425 indukció után az IL-1β-val indukált gyulladás volt függ a aktiválása NF-kappaB, amely fokozott miR-425 gén transzkripció. Sőt, a serkentett miR-425 közvetlenül megcélzó foszfatáz és tenzinhomológ (PTEN) és negatívan szabályozza annak kifejezése, ami elősegítette a sejtek túlélését követően az IL-1β indukció. Katalógusa kísérleti eljárások katalógusa Etikai nyilatkozat katalógusa Minden mintát vettünk átesett betegek műtét Fudan Egyetem Shanghai Cancer Center. A protokollt jóváhagyta a Klinikai Kutatási Etikai Bizottságának Fudan Egyetem, valamint a kutatást végeztek rendelkezései szerint a Helsinki Nyilatkozat 1975. szomszédos normál szövetben kivágtuk távol a gyomor daganatos elváltozás makroszkópos, a szövettani diagnózist mikroszkóppal. Tájékoztatás után írásos beleegyezésüket adták minden résztvevő részt vesz a vizsgálatban.
Sejtkultúrák és reagensek
A humán embrionális vese sejtvonal HEK293 (ATCC® CRL-1573 ™), a humán emlőrák sejtvonal MDA-MB361 (ATCC ® HTB-27 ™), az emberi gyomor adenokarcinóma sejtvonal AGS (ATCC® CRL-1739 ™), SNU-1 (ATCC® CRL-5971 ™), SNU-5 (ATCC® CRL-5973 ™), SNU-16 (ATCC® CRL 5974 ™), Hs746T (ATCC® HTB-135 ™), NCI-N87 (ATCC® CRL-5822 ™), és KATO III (ATCC®HTB-103 ™) tartottunk fenn DMEM, amely 10% magzati szarvasmarha szérum. Minden sejtvonalat tartalmazó táptalajban tartottuk fenn penicillinnel (100 NE /ml) és streptomicint (100 mg /ml) 37 ° C-on, 5% CO 2. A miRNS utánozza és anti-miRNS vásároltunk Ambion (Austin, TX, USA). Az IKK inhibitor TPCA-1 (Cat. No. S2824), p38 MAPK-inhibitor BIX02188 (Cat. No. S1574), valamint a JNK inhibitor SP600125 (Cat. No. S1460) vásároltunk a Selleckchem (Houston, TX, USA). A rekombináns humán IL-1β a Sigma-Aldrich (Cat. No. H6291, Shanghai, Kína).
RNS extrakció és valós idejű PCR
Az összes RNS-t extraháltuk a sejtekből TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA ). A mikro-RNS analízis, a poli (A) farok adtunk a teljes RNS alkalmazásával poli (A) polimeráz (Ambion, Carlsbad, CA), a reverz transzkripció előtt. A MiRcute miRNS qPCR Detection Kit (TIANGEN, Peking, Kína) alkalmaztunk kvantitatív expressziós szintjét érett miR-425 szerint, feltéve, protokoll, és GAPDH használtuk belső kontrollként. Real-time PCR-t végeztünk a következő körülmények között: 95 ° C 10 m, 1 ciklus; 95 ° C 10 s, 55 ° C 34 s, 40 ciklusban.
Minden kapott eredmények real-time PCR módszerek, használtuk a delta delta CT módszer kiszámításához szeres változást a génexpresszió különböző csoportok között. Az összeg a cél (PTEN /miR-425), normalizált az endogén háztartási gén GAPDH és relatív referencia minta, adja meg a következő egyenletet: mennyiségű target = 2 - △△ CT. Katalógusa immunblotolást
fehérjéket elválasztottuk 10% SDS-PAGE gél, és ezt követően át egy PVDF membránon. Blokkolás után 5% -os zsírtalan tejjel, a membránt egy egér monoklonális anti-PTEN antitesttel (1: 500, Santa Cruz, SC-7974), és egy NF-kappaB p65 foszfo (pS536) (RELA) antitestet (1: 10000 , EPITOMICS, Cat. #: 2220-1). IRdye-jelzett szekunder antitesteket használtunk mennyiségi az immunoblot jel, és a jeleket analizáltuk Odyssey szkenner (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA).
Luciferáz assay
HEK293-sejtek és AGS sejteket transzfektált miR-425 és pGL3 luciferáz konstrukciók menedéket a miR-425 target szekvenciát. 24 óra eltelte után, a tevékenységét a szentjánosbogár luciferáz és Renilla luciferáz a sejtlizátumokban mértük a Dual-Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI, USA). A luciferáz transzkripciós riporter assay, miR-425 gén promoter szekvenciákat (WT vagy helyszíni törlés) klónoztuk a promoter régió a pGL3-Basic vektorba, és luciferáz-aktivitást mértünk a fent leírtak szerint.
Kromatin immunprecipitáció (chip)
Röviden, kezelt sejteket térhálós 1% formaldehid, nyírt, hogy átlagos mérete 400 bp, és ezt követően antitestekkel elleni NF-kappaB (santa Cruz, SC-166588). A chip-PCR-primereket terveztünk, hogy amplifikáljuk a promóter régiókat tartalmazó feltételezett NF-kappaB kötőhelyek belül miR-425 az ábra szerint. A pozitív kontroll antitest (RNS-polimeráz-II), és egy negatív kontroll, nem-immun IgG-t alkalmaztunk annak bizonyítására, a hatékonyságát a kit reagensek (Epigentek Group Inc, a P-2025-48). Immunoprecipitáltunk DNS majd megtisztítják, megjelent, és eluáljuk. Eluált DNS-t lehet használni a járulékos alkalmazások chip PCR-rel. Szeres dúsítást (FE) kiszámítása az arány amplifikációs hatékonysága a chip minta felett, hogy a nem-immun IgG-vel. Erősítési hatásfok polimeráz RNS II alkalmaztunk pozitív kontrollként. FE% = 2 (IgG CT - Minta CT) × 100%.
Cell proliferációs vizsgálati
sejtproliferáció vizsgálatot végeztünk a sejtszámlálás Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japán) állítottuk elő az gyártó utasításait. Hozzáadása előtt CCK-8, a sejteket mossuk meleg táptalaj spinning a lemezt 500 rpm-en, 3 m, majd A felülúszót eldobjuk.
Sejt apoptózis assay
rákos sejteket összegyűjtjük és újra szuszpendáljuk 500 ul kötőpuffer. A sejtszuszpenziót (100 ul) inkubálunk 5 ul Annexin-V és propídium-jodid jelenlétében szobahőmérsékleten 20 percig. A megfestett sejteket analizáltuk fluoreszcens-aktivált sejt (FACS) segítségével a BD LSR II áramlási citometriával.
Sejtciklus analízis
Az áramlási citometriás analízis a sejteket tripszinnel kezeltük és a fix 70% -os etanolban egy éjszakán át. A sejteket ezután inkubáljuk 0,5 ml propidium-jodid-oldatot, amely 25 jig ml -1 RNáz 15 percen át 37 ° C-on és mérjük.
Egér kísérletek
Az NCI-N87 sejteket (3 x 10 6) injektáltunk a jobb lágyék a csecsemőmirigy nélküli Nu /nu egerekben. Egy héttel az injekció után az egereket összehasonlíthatóan méretű tumorokat kezeltünk 4 héten anti-miR-425. Az anti-miR-425 (2 nmol) injektáltunk közvetlenül a tumorok hetente kétszer, 4 héten át.
Statisztikai analízis
Az eredményeket átlag ± SEM, és az adatokat analizáltuk a Student-féle t-teszt. A p katalógusa < 0,05 értéket tekintettük statisztikailag szignifikánsnak.
Eredmények
IL-1β kezelés indukálja a miR-425 expressziós
jellemzésére miRNS felelős IL-1β indukció, mi profilozott miRNS expresszió PBS-sel kezelt AGS sejtek és IL-1β indukált AGS sejtek felhasználásával Exiqon miRCURY ™ LNA Array rendszer (v.14.0). A miRNS szintek nagymértékben különbözött a PBS-sel kezelt csoport és az IL-1β indukált csoport, amint az a hő térkép az 1A ábrán látható. Között a 1891 befogás szondák, 46 miRNS voltak eltérően expresszált IL-1β indukált AGS sejtek összehasonlítva párosított PBS-sel kezelt AGS-sejtek; Ezen miRNS, 29 emelkedett és 17 csökkent az IL-1β-indukált AGS sejteket (1. táblázat), jelezve, hogy egy adott miRNS minta társul az IL-1β indukció. 1. ábra szabályozási zavarának miRNS-ek a humán AGS kezelt sejtekben az IL-1β. (A) Humán AGS sejteket kezeltünk IL-1β (10 ng /ml) [14], és 24 órával később, a miRNS-ek expressziós profil elemeztük microarray technológiával. Hőtérkép diagram által generált felügyelet nélkül csoportosítás elemzés 46 jelentős megbomlik miRNS. A vörös fény jelzi upreguláció; zöld azt downregulációját. (B) A megnövekedett szintjeit miR-425 36 tumorminták szintjéhez viszonyítva a párosított szomszédos normális szövetekben mért real-time PCR. Normál: szomszédos normál szövetben. (C) expressziós szintjének miR-425 vizsgáltuk real-time PCR több gyomorrák sejtvonalakat és hat normál gyomornyálkahártya sejtekben.
1. táblázat Jelentős szabályozási zavarának miRNS katalógusa túlexpresszálódik az IL-1β indukált-AGS sejtek Matton miRNS Matton szeres változást Matton p értéke Matton hsa-miR-425 katalógusa 12.36 katalógusa 0.00
hsa-miR-584
11.03
0.01
hsa-miR-31
8.12
0.00
hsa-miR-155
6.22
0.00
hsa-let-7i
5.55
0.00
hsa-miR-21
5.11
0.00
hsa-miR-335
4.89
0.01
hsa-miR-191
4.73
0.03
hsa-miR-519d
4.37
0.02
hsa-miR-520d-5p
3,95
0.00
hsa-miR-331
3.67
0.01
hsa-miR-142
3.45
0.01
hsa-miR-518a-5p
3.28
0.01
hsa-miRPlus-F1231
3.11
0.01
hsa-miR-2113
2.94
0.02
hsa-miR-196a*
2.88
0.02
hsa-miR-1304
2.78
0.02
hsa-miR-185
2.65
0.01
hsa-let-7a
2.61
0.00
hsa-miR-130
2.52
0.02
hsa-miR-1280
2.50
0.01
hsa-miR-222
2.47
0.01
hsa-let-7c
2.43
0.00
hsa-miR-602
2.31
0.00
hsa-miR-548e
2.31
0.03
hsa-miR-32
2.27
0.04
hsa-miR-181a
2.24
0.02
hsa-miR-7
2.13
0.00
hsa-miR-21*
2.06
0.00
Alulexpresszáltak az IL-1β indukált AGS sejtek katalógusa miRNS katalógusa szeres változást katalógusa p értéke
hsa-miR-143
0.06
0.02
hsa-miR-200
0.08
0.01
hsa-miR-451
0.13
0.01
hsa-miR-144
0.17
0.00
hsa-miR-363
0.20
0.01
hsa-miR-637
0.25
0.03
hsa-miR-153
0.39
0.01
hsa-miR-139
0.39
0.00
hsa-miR-617
0.42
0.01
hsa-miR-1915
0.43
0.00
hsa-miRPlus-F1153
0.45
0.00
hsa-miR-381
0.46
0.00
hsa-miR-145
0.47
0.02
hsa-miR-659
0.47
0.03
hsa-miR-125b
0.48
0.00
hsa-miR-183*
0.49
0.00
hsa-miR-638
0.49
0.01
*: Ha két érett miRNS származnak szemben lévő karja azonos pre-miRNS egy csillag követően a neve is mutatja egy miRNS expressziója alacsony szintű képest miRNS a másik kar egy hajtű.
Ezek közül miRNS, miR 425 a leginkább során felszaporodnak az IL-1β indukció. Valós idejű PCR-analízis, elemeztük miR-425 expresszió 36 párosított minta (tumor és a szomszédos normális szövetekben az azonos beteg). Találtunk egy lényegesen magasabb szintű miR-425 expresszió a tumor minták képest a szint a szomszédos normál szövetekben (p
< 0,0001) (1B ábra). Megvizsgáltuk expressziós szintjének a miR-425 egy sor gyomor rákos sejtvonal és hat normál gyomornyálkahártya sejtekben. Amint az ábra 1C, szedtünk fel a AGS sejtek alulszabályozott miR-425 és NCI-N87 sejtek felülszabályozott miR-425 további vizsgálat céljából. Bár az aktiváló miR-425 leírták, hogy van egy alapvető hatással rák kialakulásában és progressziójában a rákos sejtek által expressziójának mértékét csökkenteni egy kiterjedt gének [15], a szerepe a miR-425 a humán rákok nem tisztázott . Ezért választottuk a miR-425 további vizsgálat céljából. Katalógusa kifejezése PTEN negatívan szabályozza a miR-425 katalógusa azonosítása célpontjai miR-425, mi foglalkoztatott egy általánosan használt algoritmust, miRecords (http: //mirecords . biolead. org /), amely egy integrált erőforrás állati miRNS-target kölcsönhatások. A pontosság e jóslat, gének jósoltak legalább öt tizenegy adatbázisok (Diana, microinspector, Miranda, mirtarget2, mitarget, nbmirtar, pictar, pita, rna22, rnahybrid és targetscan) választottunk vélt célokat. Ezek között a feltételezett célpontjai miR-425, gén ontológia elemzés feltárta, hogy az expressziós szintek 9 jelölt gének változnak; Így ez a módosítás hozzájárulhat az malignus fenotípus. A 3 'UTR-luciferáz riporter assay, azt találtuk, hogy overexpressziója miR-425 jelentősen gátolt luciferáz aktivitást HEK293 sejtekben és AGS expresszáló sejtek a vad típusú PTEN 3' UTR-riporter (2A ábra). Azt megerősítette, hogy a PTEN egy feltételezett közvetlen célpontja a miR-425. Annak illusztrálására, a specificitás a miR-425, azt mutatta, hogy az anti-miR-425 kifejezetten eltörölte a gátlását luciferáz aktivitás által indukált miR-425 HEK293 sejtekben és az NCI-N87-sejtek (2b ábra). Mutáció a miRNS kötőhelyek (2C ábra) tette a konstrukciók nem reagál a miR-425 indukció (2D, ábra), továbbá megerősíti, hogy a PTEN gén közvetlen célpontja a miR-425. 2. ábra miR-425 közvetlenül célozza PTEN. (A) riporter assay HEK293 sejtekben és AGS transzfektált sejtek miR-425 és konstrukciót hordozó luciferáz-cDNS-fuzionált 3 'UTRs előrejelzett jelölt célok (átlag ± SEM). (B) hatása az anti-miR-425 a luciferáz aktivitást a luciferáz konstrukciók olvasztott a 3 'UTRs PTEN HEK293 sejtekben és az NCI-N87-sejtek (átlag ± SEM). (C, D) riporter assay HEK293 sejtekben és AGS transzfektált sejtek luciferáz konstrukciók készítésére, amelyek a PTEN 3 'UTRs a mutációk a miR-425-kötőhelyek (átlag ± SEM). (E) HEK293-sejtek és AGS sejteket transzfektáltunk egy luciferáz konstrukciót hordozó vad típusú PTEN 3 'UTR (LUC-WT) vagy egy konstrukciót hordozó mutáns PTEN 3' UTR (LUC-Mut). 24 óra elteltével a sejteket kezeltük az IL-1β, és a luciferáz aktivitás mennyiségi 24 órával a kezelés után. (F) Western blot és RT-PCR mutatja PTEN-fehérje szintek és a mRNS-szintjét a AGS sejtek 48 óra után a miR-425 transzfekciós. (G) AGS sejteket transzfektáltunk anti-miR-425, és 24 órával később, a sejteket vagy kezeletlenül hagytuk, vagy kezelt IL-1β, és ezt követően betakarított 24 órával a kezelés után. A teljes sejt lizátumokat immunblottoltuk a PTEN antitestekkel. (H) NCI-N87 sejteket transzfektáltunk anti-miR-425 és a betakarított 24 órával a kezelés után. A teljes sejt lizátumokat immunblottoltuk a PTEN antitestekkel. Az (I) AGS sejteket transzfektáltunk hordozó plazmid csak a nyitott leolvasási keret szekvenciáját a PTEN (PTEN-CDS). 24 óra elteltével a sejteket IL-1β vagy miR-425. A teljes sejt lizátumokat alá, immunoblot 24 óra után a kezelés. (* P < 0,05; ** P 0,01; ***, p < 0,001).
Továbbá mutáció a miR-425 célszekvencia is szignifikánsan csökkentette az IL-1β-indukált elnyomás PTEN 3 'UTR luciferáz riporter aktivitást HEK293 sejtekben és AGS sejtek (ábra 2E). Túlexpressziója miR-425 volt elegendő ahhoz, hogy downregulate PTEN expressziója mind a fehérje és mRNS szintek AGS sejtekben (ábra 2F). Ennek megfelelően, az IL-1β indukálta PTEN elnyomás megmentette kifejező anti-miR-425 AGS sejtek (ábra 2G). Anti-miR-425 képes volt erősítő szabályozása PTEN-expresszió NCI-N87 nélküli sejtek IL-1β stimuláció (2H ábra).
Adataink azt is jelezte, hogy a 3 'UTR szükséges miR-425 által közvetített PTEN downregulation mert kifejezése egy PTEN kódoló régió konstrukcióval (PTEN-CDS) volt érzéketlen miR-425 fokozott expressziója és IL-1β indukció AGS sejtekben (ábra 2I). Összefoglalva, ezek az eredmények azt mutatják, hogy a miR-425 játszik kritikus szerepet represszáló PTEN expressziójának célzott 3 'UTR upon IL-1β indukció.
IL-1β-indukált NF-kappaB aktiválás szükséges miR-425 indukció
az egyes mechanizmus vesz részt a miR-425 transzaktivációját upon IL-1β indukciós megvizsgáltuk a hatását a különböző kináz gátlók miR-425 indukció IL-1β-val kezelt AGS sejtekben. Az IL-1β indukált miR-425 upreguláció szignifikánsan gátolta az IKK inhibitor TPCA-1 és nem a p38 MAPK-inhibitor BIX02188 vagy a JNK inhibitor SP600125 (3A ábra). Korábbi tanulmányok már kimutatták, hogy az IKK lényeges kináz szükséges az NF-kappaB jelátviteli; ezért ez az eredmény azt mutatja, milyen fontos a NF-kappaB jelátviteli szabályozásában a miR-425 transzkripció után az IL-1β indukció. A 3. ábra az IKK aktiválás szükséges indukciójában miR-425, válaszul az IL-1β indukció. (A) AGS sejteket kezeltünk IL-1β jelenlétében az IKK inhibitor TPCA-1, a p38 MAPK-inhibitor BIX02188 és a JNK inhibitor SP600125. Érett miR-425 expressziós 12 órával a kezelés után mennyiségileg valós idejű PCR. A szoros változást relatív miR-425 expresszió (miR-425 /U6) normalizáltuk megfigyelt PBS-kezelt sejtekben. (B) Az expresszióját primer miR-425 (pri-miR-425) analizáltuk valós idejű PCR, mint A. (C) Az expressziós szinteket az NF-kappaB fehérje és pri-miR-425 analizáltunk valós time PCR AGS kezelt sejtek siRNS az NF-kappaB. (D) AGS sejteket kezeltünk kémia inhibitorokkal vagy siRNS az NF-kappaB. A sejtlizátumokat kapunk után 24 órával az IL-1β kezelés és immunblottoltuk a PTEN antitestekkel. (E) Western-blot-analízise foszforilezett NF-kappaB p65 (szerin 536). (F) Az expressziós szinteket az NF-kappaB fehérje és pri-miR-425 analizáltuk valós idejű PCR NCI-N87 kezelt sejtek siRNS az NF-kappaB. (* P < 0,05; ** P 0,01; ***, p < 0,001).
Következetesen, indukciója pri-miR-425 upon IL-1β kezelés volt feltűnően gátolt jelenlétében a IKK inhibitor vagy siRNS az NF-kappaB (3B és C). Azt is megfigyeltük, hogy az IL-1β indukált PTEN elnyomás attenuált jelenlétében az IKK inhibitor vagy siRNS az NF-kappaB (ábra 3D). Annak meghatározására, hogy az NF-kappaB aktivitás volt jelen AGS kezelt sejtekben az IL-1β, használtuk Western-blot szintjének meghatározásához a foszforilált NF-kappaB p65 (szerin 536). A szint foszforilált NF-kappaB p65 (szerin 536) magas volt a AGS kezelt sejtekben az IL-1β (10 ng /ml; 24 óra) (ábra 3E). Emellett elhallgattatása NF-kappaB gátolta miR-425 expresszió NCI-N87 nélküli sejtek IL-1β kezelés (3F ábrán). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az IKK-dependens NF-kappaB aktiváció IL-1β kezelés szükséges PTEN alulszabályozottsághoz, valószínűleg a saját fejlesztése a miR-425 átírás.
Annak megállapításához, hogy az NF-kappaB közvetlenül szabályozza a miR-425 átírás, mi elemezte az upstream szekvenciákat a miR-425 segítségével WeightMatrix könyvtár (matrixTFP60.lib) és azonosított három potenciális NF-kappaB kötőhelyek promoter régiójában a miR-425 (cut-off: mátrix hasonlósági = 0,9 és az alapvető hasonlóság = 0,95) ( 4A). Végeztünk kromatin immunprecipitációt (chip) esszékben AGS rákos sejtek monoklonális anti-NF-kappaB antitesteket. Ahogyan a 4b ábrán látható, csak a primer-B miR-425 előállított erős PCR-termékeket, amely azt sugallta, hogy az NF-kappaB fehérje képződött komplexek a B-kötőhely a miR-425 promoter. Az eredmények a luciferáz riporter assay javasolta, hogy a potenciális B kötőhely a miR-425 promoter szükséges transzaktivációja a downstream gén upon IL-1β indukció (4a ábra és C). 4. ábra NF-kappaB kötőhelyek miR-425 promoter. (A) Jellemzők A miR-425 5 'szegélyező DNS-t. Emberi promoter régiói miR-425 tartalmazhat három feltételezett kötőhelyeket NF-kappaB. (B) chip vizsgálatok anti-NF-kappaB antitestek kötődést mutattak az NF-kappaB a promoter a miR-425 AGS sejtekben. A relatív occupancies NF-kappaB vannak feltüntetve függőleges sávok. Az oszlopdiagram mutatja átlagai három Independent Chip kísérletek. (C) A promoter a miR-425-aktivált NF-kappaB. AGS sejteket kezeltünk NF-kappaB és transzfektált a jelzett LUC vektorok.
Indukciója miR-425 elősegíti a sejt túlélését upon IL-1β indukció
Kimutatták, hogy a PTEN között a leggyakrabban inaktivált tumor szupresszor gének. Túlexpressziója PTEN különböző emlős szövettenyészet sejtekben befolyásolja különböző folyamatok, ideértve a sejtszaporodást, a sejthalál és a sejtmigrációt [16]. Azt is megállapították, hogy gátolja a PTEN csökkent a kaszpáz-3-val kezelt sejtekben az IL-1β (5A ábra). Valószínűsíthető, hogy a miR-425 indukciós gátolhatja az apoptózist keresztül downregulation PTEN az IL-1β-val kezelt sejtekben. Sőt, túltermelése miR-425 gátolja a kaszpáz-3 aktiváció ciszplatinnal kezelt AGS sejtekben (5B). Sőt, a ciszplatinnal kezelt AGS sejtek együttes transzfekció konstrukció, amely csak a PTEN kódoló régió (PTEN-CDS), amely érzéketlen a miR-425, kiiktatott antiapoptotikus hatását miR-425 fokozott expressziója (5C). Ennek megfelelően a transzfekció anti-miR-425 in AGS sejtekben jelentősen továbbfejlesztett kaszpáz-3 aktiválását és az apoptózist, válaszul az IL-1β kezelés (5D ábra). Ezen túlmenően, a transzfekció anti-miR-425 NCI-N87 sejtek szignifikánsan fokozta a kaszpáz-3 aktiválását és az apoptózist nélkül az IL-1β stimuláció (5E ábra). 5. ábra miR-425 gátolja a sejtek apoptózis elnyomásával PTEN. (A). AGS sejteket kezeltünk kontroll (PBS) vagy az IL-1β. 48 óra múlva a teljes sejt lizátumokat immunblottoltuk. (B). AGS-sejteket tranziensen transzfektáltunk a negatív kontroll (MIR-NC), vagy a miR-425 egyedül. 24 óra elteltével a sejteket kezeltük a ciszplatin és a betakarított 24 órával a kezelés után. A teljes sejt lizátumokat immunblottoltuk. (C). AGS sejteket transzfektáltunk miR-NC, miR-425, és PTEN-CDS jelzett. 24 óra elteltével a sejteket kezeltük a ciszplatin és a betakarított 24 órával a kezelés után. A sejt apoptózis arány alkalmazásával határoztuk meg az áramlási citometriás módszerrel. (D). AGS sejteket transzfektáltunk miR-NC vagy anti-miR-425. 48 óra elteltével a sejteket kezeltük az IL-1β és betakarított 24 órával a kezelés után. Teljes sejt lizátumokat immunblottoltuk a feltüntetett ellenanyagokkal, és a sejt apoptózis arány alkalmazásával határoztuk meg az áramlási citometriás módszerrel. (E) NCI-N87 sejteket transzfektáltunk miR-NC vagy anti-miR-425. Teljes sejt lizátumokat immunblottoltuk a feltüntetett ellenanyagokkal, és a sejt apoptózis arány alkalmazásával határoztuk meg az áramlási citometriás módszerrel.
Összhangban lévő szerepet gátlására kaszpáz-aktiválás fokozza a miR-425 jelentős mértékben fokozni AGS sejtburjánzást, míg a pro- túlélési hatást teljesen blokkolta kotranszfekció exogén PTEN (PTEN-CDS) (6a ábra). Anti-miR-425 és csökkentette a szaporodó sejtek NCI-N87 sejtek (6B). Azt is megállapították, hogy gátolja a PTEN volt védő hatása hasonló a megfigyelt sejtek overexpresszáló miR-425 (ábra a 6C), ami arra utal, hogy a PTEN elnyomás játszhatnak jelentős szerepet miR-425-függő védelmet kezelt sejtekben az IL-1β. 6. ábra miR-425 elősegíti a sejtek proliferációját elnyomásával PTEN. (A) AGS sejteket kezeltük PBS, az IL-1β, miR-NC, miR-425, és PTEN-CDS jelzett. 72 óra elteltével a sejtproliferáció segítségével határoztuk meg a edu jelölő kit. (B) NCI-N87 sejteket transzfektáltunk miR-NC vagy anti-miR-425. 72 óra elteltével a sejt proliferációs sebesség alkalmazásával határozzuk meg a edu jelölő kit. (C) AGS sejteket siRNS-sel kezelt-PTEN vagy miR-425. 72 óra elteltével a sejtproliferáció segítségével határoztuk meg a edu jelölő kit. (D) fényképei PTEN-fehérje expressziójának a tumor szövetekben (felső panelek) és tumorok (alsó panelek). (E) A grafikon azt mutatja, a súlya a 3 tumorok 4 hét után (n = 3). (F) szignifikáns fordított korreláció figyelhető között a miR-425 és a PTEN expressziós szinteket a gyomorrák szövetekben (n = 52). (G) Az expressziós szinteket a PTEN határozzák hat normál gyomornyálkahártya sejtek és gyomor rákos sejtvonalakban valós idejű PCR-rel. (H) A modell szemlélteti a feltételezett szerepét az IL-1β és miR-425 az irányítást a PTEN útvonal humán gyomor karcinóma sejteket.
Vizsgáltuk a miR-425 tumorgenézisre in vivo. A daganatok kezelt anti-miR-425 mutatott megnövekedett szintje a PTEN-fehérje (ábra 6D). Továbbá, az anti-miR-425 csökkentette a tumor tömegét az egerek összehasonlítva a miR-NC-vel kezelt csoportban (ábra 6E). Nem-paraméteres próbák, találtunk szignifikáns fordított korreláció PTEN mRNS és miR-425 expresszió a gyomorrák mintától (6F). Az expressziós szinteket a PTEN is meghatároztuk hat normál gyomornyálkahártya sejtek és gyomor rákos sejtvonalakban valós idejű PCR-rel. Mint látható, a sejteket "down-szabályozott" miR-425 nagyobb mennyiségű PTEN képest sejtvonalak "up-regulációját" miR-425 szintek (ábra 6g). Összefoglalva, eredményeink azt bizonyították, hogy a miR-425 játszik oki szerepet a célzást PTEN a gyomorrák. Katalógusa Vita
interleukin-1 (IL-1) jelentős gyulladáskeltő citokin, amely által termelt rosszindulatú vagy mikrokörnyezeti sejtek [17]. IL-1 is működik, mint egy pleiotróp citokin szerepet játszik tumorigenezisben és a tumor invazív; Ezért jelent megvalósítható jelölt egy modulátor citokin, amely képes billenteni az egyensúlyt a gyulladás és immunitás felé indukcióját tumorellenes válaszok [18]. IL-1α és IL-1β a fő agonisták az IL-1. Az ő szekretált formáit, az IL-1α és IL-1β kötődni ugyanahhoz a receptorokat és indukálják az azonos biológiai funkciók [19]. Azonban az IL-1α és IL-1β különböznek kompartmentalizáció a cellán belül vagy a mikrokörnyezetben [20]. Az IL-1β csak aktív a kiválasztott forma és gyulladást, amely elősegíti a rákkeltő képességet, a tumor invazív és immunszuppresszió [21]. Néhány új anti-IL-1β szereket használnak a klinikai vizsgálatokban a betegnél különböző betegségek gyulladásos manifesztációk [22]. Jobb megértése az integratív szerepét IL-1β jelátviteli a malignus folyamat lehetővé teszi alkalmazását újszerű IL-1β moduláció megközelítések a rákos betegeknél.
PTEN fedezték fel, mint fontos tumorszuppresszor hogy gyakran mutált vagy elveszett a különböző rákos megbetegedések [23]. Számos bizonyíték kiemelték PTEN mint egy lipid foszfatáz, amely hidrolizálja a 3 'foszfátot foszfoinozitidek [24]. PTEN is szabályozni a aktivitását a szerin /treonin-kináz-Akt /PKB, és így befolyásolhatja a sejtek túlélését jelátviteli [25]. UV expozíció kiválthatja PTEN kölcsönhatás vad típusú melanokortin-1 receptor variánsokat, amely megvédi a PTEN-re WWP2 által közvetített lebomlási, ami a AKT inaktiválás a melanoma [26]. Vannak több mechanizmusok szabályozása PTEN, beleértve a transzkripció, az mRNS stabilitását, mikroRNS célzás fordítás és fehérje stabilitását. PTEN a transzkripció elhallgattatta promoter metiláció gyomorrák [27]. PTEN is lehet poszttranszlációsan által szabályozott acetilezés, ubiquitylation, oxidáció, foszforiláció, és sejten belüli lokalizációja [28]. Annak ellenére, hogy kiterjedt jellemzése PTEN mutációk humán rákos megbetegedések és a viszonylag jó megértése a molekuláris szerepének PTEN a kontroll a sejtes folyamatok, keveset tudunk a módok PTEN szabályozás.
PTEN gátolható a rákos sejtekben történő indukció a pro-gyulladásos citokin az IL-1β [29]. Stimulációt IL-1β aktiválja az NF-kappaB által foszforiláció és lebomlása IκB. Ez az aktiválás lehetővé teszi, hogy az NF-kappaB hogy a sejtmagba kerülnek és transzkripciós szinten aktiválnak célgének [30]. NF-kappaB egy heterodimer transzkripciós aktivátor, amely a DNS-kötő alegység P50 és a transzaktivációs alegység p65 [31]. Minden szerző elolvasta és jóváhagyta a végleges kéziratot. Katalógusa

• Befolyásolja a IL17A polimorfizmusok aberráns metilációját DAPK és Cdh1 a nem rákos gyomornyálkahártya
• Szokatlan trichobezoar a gyomor és a bél: egy esetismertetés