NF-kappaB priklausoma MicroRNA-425 ląstelę skatina skrandžio vėžio ląstelių augimą nukreipiant PTEN nuo IL-1β indukcijos

NF-kappaB priklausoma MicroRNA-425 ląstelę skatina skrandžio vėžio ląstelių augimą nukreipiant PTEN nuo IL-1β indukcijos pervežimas tezės
raiška su priešuždegiminiais citokino IL-1β yra susijęs su įvairiais ligų, įskaitant vėžį. Keitimas mikro RNR buvo pastebėta vėžinių ląstelių, veikiamų prouždegiminių citokinų, tačiau jų funkcija uždegimas streso išlieka silpnas. Čia mes parodysime, kad IL-1β indukuoja PPN-425, kuris neigiamai reguliuoja fosfatazės ir angiotenziną homologą išraišką nukreipiant savo 3 "UTR ląstelę. In miR-425 padidėjimas priklauso nuo IL-1β sukeltos NF-kappaB aktyvavimo, kuris pagerina Pasaulis-425 genų transkripciją nuo IL-1β indukcija. Todėl, represijos fosfatazės ir angiotenziną homologas pagal miR-425 skatina skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją, kuris yra reikalingas, siekiant apsaugoti ląsteles nuo cisplatinos sukelto apoptozės. Kartu paėmus, mūsų duomenys patvirtina kritinį vaidmenį NF-kappaB priklausomas ląstelę PPN-425, kuri atstovauja naują kelią už fosfatazės ir angiotenziną homologą aktyvavimo represijų ir ląstelių išlikimo skatinimo ant IL-1β indukcija.
Raktiniai žodžiai
IL-1β NF-kappaB Pasaulis-425 PTEN Skrandžio vėžys faktai
skrandžio adenokarcinoma yra ketvirtoji ir penktoji dažniausia vėžio tarp vyrų ir moterų, atitinkamai, visame pasaulyje ir yra glaudžiai susijęs su lėtiniu uždegimu [1]. Tai dabar gerai priimtas, kad infekcijos Helicobacter pylori
(H. pylori pervežimas) vaidina svarbų vaidmenį sukeliant lėtinis uždegimas, vedantį į piktybinių navikų [2]. Lėtinis uždegimas, skrandžio inicijuoja histopatologiniam progresavimą lėtinio gastrito, kad skrandžio atrofijos, žarnyno metaplazijos ir pagaliau skrandžio vėžio [3]. Nors H. pylori
infekcija yra labai paplitęs, tik nedidelė mažuma (apie 1%) infekuotų asmenų plėtos skrandžio vėžiu ir po daugelio metų. Pasirodo kintamasis atsakas į šį bendrą patogeno būti reglamentuojamas pagal genetinį polinkį į aukštos raiškos lygių prouždegiminių citokinų [4].
branduolinės faktoriaus kapa B (NF-kappaB) kelias jau seniai laikomas pagrindinis prouždegiminių signalizacijos kelias, daugiausia remiantis NF-kappaB aktyvavimo priešuždegiminiais citokinų ir NF-kappaB vaidmens transkripcijos aktyvavimo reaguojančių genų įskaitant citokinų ir chemokinų [5]. Į "Canonical" kelias už NF-kappaB aktyvavimo iššaukiamas prouždegiminių citokinų, tokių kaip IL-1β ir paprastai veda prie santykių ar cRel turinčiais kompleksų aktyvavimo [6]. NF-kappaB egzistuoja į neaktyvios formos, susijusios su nurodytų kaip inhibitoriais κB (IκB) reguliuojančių baltymų, iš kurių svarbiausias gali būti IκBα, IκBβ ir IκBε citoplazmoje. IκBα yra susijęs su laikinu NF-kappaB aktyvavimo, kadangi IκBβ dalyvauja tvaraus aktyvavimo [7]. Tačiau, lėtinis uždegimas yra sudėtingas fiziologinis procesas, ir NF-kappaB vaidmuo uždegiminio atsako dar nėra visiškai ištirtas.
Be įtakos baltymų kodavimo genų ekspresiją, uždegimas stresas taip pat keičia ekspresijos lygį mikro RNR (miRNAs) [8]. Mikro RNR yra endogeninio, klasės mažos, ne kodavimo RNR, kad neigiamai reguliuoti genų ekspresiją ne po transkripcijos lygio daugiausia per privalomas iki 3 "neišverstas regiono tikslinės mRNR, ir jie turi svarbių reguliavimo funkcijas iš įvairių fiziologinių kontrolės ir patologinių procesų [9, 10]. Įrodyta Šie RNR turi būti įtrauktas į daugelio mobiliojo ryšio procesų, įskaitant platinimo, diferenciacijos ir apoptozės [11-13] reglamentą. Tačiau, ar lėtinis uždegimas reguliuoja Mirna išraiška, keičiant genų transkripciją ar pakeisti po transkripcijos brendimą nebuvo nustatytas.
Šiame darbe, mes nustatėme, kad Pasaulis-425 indukcija nuo IL-1β sukeltos uždegimo buvo priklausomas nuo aktyvinimo NF-kappaB, kuris tvirtesnis Pasaulis-425 genų transkripciją. Be to, aktyvinama Pasaulis-425 tiesiogiai nukreipta fosfatazės ir angiotenziną homologą (PTEN) ir neigiamai reguliuoja savo išraišką, kuri skatinama ląstelių išgyvenimą po IL-1β indukcija.
Eksperimentų
etikos pareiškimą
Visi egzemplioriai buvo gauti iš pacientų, kuriems buvo atlikta operacija Fudan universiteto Šanchajuje Cancer Center. Protokolas buvo patvirtintas klinikinių tyrimų etikos komiteto Fudano universiteto, o tyrimas buvo atliekamas pagal Helsinkio deklaraciją 1975 gretimuose normaliuose audiniuose nuostatos buvo pašalintų nuo skrandžio vėžio pažeidimo makroskopinis ir jų histologinis diagnozė buvo patvirtinta mikroskopiškai. Parašė informuotas sutikimas buvo gautas iš visų tyrime dalyvavusių dalyvių.
Ląstelių kultūros ir reagentai
žmogaus embrioninių inkstų ląstelių linijos HEK293 (ATCC® BEL-1573 ™ "), žmogaus krūties vėžio ląstelių linijos MDA-MB361 (ATCC ® HTB-27 ™ "), žmogaus skrandžio adenokarcinoma ląstelių linija" AGS (ATCC® BEL-1739 ™ "), SNU-1 (ATCC® BEL-5971 ™"), SNU-5 (ATCC® BEL-5973 ™ "), SNU-16 (ATCC® CRL- 5974 ™ "), Hs746T (ATCC® HTB-135 ™), NVI-N87 (ATCC® BEL-5822 ™") ir KATO III (ATCC®HTB-103 ™) išliko DMEM, kurių sudėtyje yra 10% vaisiaus jaučio serumo. Visi ląstelių linijos ir buvo išlaikytos laikmena su peniciliną (100 TV /ml) ir streptomicino (100 mg /ml) 37 ° C temperatūroje su 5% CO 2. Į Mirna imituoja ir anti-Mirna buvo įsigytas iš Ambion (Austin, TX, USA). IKK inhibitorius TPCA-1 (Kat. Nr S2824), The p38 MAPK inhibitorius BIX02188 (Kat. Nr S1574) ir JNK inhibitoriaus SP600125 (Kat. Nr S1460) buvo nupirkta iš Selleckchem (Houston, TX, USA). Rekombinantinis žmogaus IL-1β buvo įsigytas iš Sigma-Aldrich (Kat. Nr H6291, Šanchajus, Kinija).
RNR gavybos ir realaus laiko PGR
viso RNR buvo išskirta iš ląstelių naudojant TRIzol (INVITROGEN, Carlsbad, CA ). Dėl MicroRNA analizės, poli (A) uodega buvo įtraukta į visų RNR naudojant poli (A), polimerazės (Ambion, Karlovi Varai, Kalifornija) prieš atvirkštinę transkripciją. MiRcute Mirna qPCR aptikimo komplektas (TIANGEN, Pekinas, Kinija) buvo naudojamas quantitate ekspresijos lygį brandaus miR-425 pagal pateiktą protokolą ir GAPDH buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės. Realaus laiko PGR buvo atliekama laikantis šių sąlygų: 95 ° C 10 m, 1 ciklo metu; 95 ° C 10 S, 55 ° C 34 S, 40 ciklų.
Visiems gautų realaus laiko PGR metodų rezultatų, naudojami delta delta CT metodą apskaičiuoti kartų kaita genų ekspresijos tarp skirtingų grupių. Tikslinių suma (PTEN /Pasaulis-425), normalizuotas endogeninio namų ruošos genų GAPDH ir, palyginti su atskaitos mėginyje, apskaičiuojamas pagal šią lygtį:. Suma target = 2 - △△ KT
imunoblotas
Baltymai buvo atskirtos 10% SDS-PAGE metodu, ir toliau perduota į PVDF membrana. Po blokavimo su 5% Nonfat pieno, membrana buvo inkubuojamos su pelių monokloninius anti-PTEN antikūno (1: 500, Santa Cruz, SC-7974) ir NF-kappaB 65 psl PHOSPHO (pS536) (RelA) antikūnų (1: 10000 ., EPITOMICS, Kačių #: 2220-1). IRdye žymėto antriniai antikūnai buvo naudojami kiekybinio iš imunoblotas signalas, ir signalai buvo analizuojami naudojant Odyssey skaitytuvas (Li-COR biomokslų, Lincoln, NE, JAV).
Liuciferazės Bandymo
HEK293 ląstelių ir AGS ląstelės buvo transfekuotos Pasaulis-425 ir pGL3 liuciferazė reporteris konstruoja slėpimas mir-425 tikslinę seką. Po 24 h, "Firefly liuciferazės ir renilla liuciferazės į ląstelių fragmentai veikla buvo matuojamas Dvejopo liuciferazės prabavimo sistemos (PROMEGA, Madison, WI, JAV). Apie liuciferazės transkripcijos reporterio testą, MIR-425 geno promotoriaus sekos (WT arba išbraukta vietoje) buvo klonuotas į promotoriaus regione pGL3-BASIC vektoriaus ir liuciferazės aktyvumas buvo matuojamas kaip aprašyta aukščiau.
Chromatino Imunoprecipitacijos (Chip)
Trumpai tariant, paveiktų ląstelių buvo susiūta skersiniais ryšiais su 1% formaldehido, šlyties jėgos, į vidutinio dydžio 400 bp, ir vėliau immunoprecipitated su antikūnų prieš NF-kappaB (Santa Kruzas, SC-166588). Lustas-PGR pradmenys buvo siekiama sustiprinti rengėjas regionuose, kuriuose yra tariamą NF-kappaB privalomus teritorijoms miR-425, kaip parodyta. Teigiama kontrolė antikūnas (RNR polimerazė II) ir neigiamos kontrolės ne imuninė IgG buvo naudojami įrodyti rinkinys reagentų (Epigentek Group Inc, P-2025-48) veiksmingumą. Immunoprecipitated DNR išvalo, išleistas, ir išplaunami. Išplauto DNR gali būti naudojami tolesniems programų lustas-PGR. Kartus sodrinimo (Fe) buvo apskaičiuojamas naudojant amplifikacijos efektyvumą ir jų pakavimą mėginio santykį, kad ne-imuninės IgG. Amplifikacijos efektyvumą polimerazės RNR II buvo naudojamas kaip teigiama kontrolė. FE% = 2 (IgG KT - pavyzdys KT). × 100%
ląstelių proliferacija tyrimas
Mobilusis proliferacijos tyrimu buvo atlikta naudojant Cell skaičiavimo KIT-8 (Dojindo, Kumamoto, Japonija) pagal gamintojo instrukcijas. Iki CCK-8 Be to, ląstelės buvo išplauti šiltu terpėje, kurį tuo 500 apsisukimų per minutę plokštelę verpimo: 3 m ir tada išpilant supernatantą.
Mobilusis apoptozę tyrimą
vėžio ląstelės buvo surinktos ir resuspenduojamos 500 mikrol, rišančios buferio. Ląstelių suspensija (100 mikrol) buvo inkubuojami su 5 pL aneksino-V ir propidiumo jodido kambario temperatūroje 20 minučių. Tamsintas ląstelės buvo analizuojami su fluorescencinė aktyvuota ląstelių rūšiavimo (FACS), naudojant BD LSR II tėkmės citometrijos.
Mobilusis ciklo analizė
Dėl tėkmės citometrijos analize, ląstelės buvo tripsinizuojamos ir nustatytas 70% etanolio per naktį. Tuomet ląstelės inkubuojamos 0,5 ml propidiumo jodido tirpalo, kuriame yra 25 mikrogramų ml -1 RNazės 15 minučių esant 37 ° C ir matuojamas.
Pelės eksperimentai
NVI-N87 ląsteles (3 × 10 6) buvo švirkščiamas į dešinę šonus nuo athymic nu /nu pelių. Vieną savaitę po injekcijos, pelėms, kuriuose yra panašios dydžio navikų buvo gydomi 4 savaites su anti-miR-425. Anti-Pasaulis-425 (2 nmol) buvo švirkščiamas tiesiai į navikų du kartus per savaitę 4 savaites.
Statistinė analizė
rezultatai pateikiami kaip reiškia ± SEM, o duomenys buvo analizuojami su Stjudento t testą. A p
<vertės; 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingas.
Rezultatai
IL-1β gydymo skatina Pasaulis-425 išraiška
apibūdinti miRNAs atsakingus už IL-1β indukcijos, mes profiliuoti Mirna išraišką PBS gydytų AGS ląstelių ir IL-1β indukuotų AGS ląstelės naudojant Exiqon miRCURY ™ LNA Array sistemos (v.14.0). Į Mirna lygiai labai skiriasi tarp PBS-gydytų pacientų grupėje ir IL-1β sukeltos grupės, kaip parodyta šilumos žemėlapyje pavaizduota 1A pav. Tarp 1,891 surinkimo zondai, 46 miRNAs buvo skirtingai išreikštas IL-1β sukeltos AGS ląstelių, lyginant su suporuotas PBS gydytų AGS ląstelių; iš šių miRNAs, 29 buvo padidintos ir 17 buvo sumažėjo IL-1β sukeltas AGS ląstelių (1 lentelė), nurodant, kad konkretus mirna modelis yra susijęs su IL-1β indukcijos. 1 pav disreguliacija miRNAs žmonėmis AGS ląstelių gydomiems IL-1β. (A) žmogaus AGS ląstelės buvo gydomi IL-1β (10 ng /ml) [14] ir 24 val vėliau, miRNAs išraiška profilis buvo analizuojami mikrogardeliq technologija. Šilumos žemėlapis schema generuoja neprižiūrimą grupavimo analizė 46 gerokai dysregulated miRNAs. Raudona rodo ląstelę; Žalia spalva reiškia, downregulation. (B), Padidėjęs PPN-425 36 navikų mėginiuose, palyginti su jų lygių suderintų gretimuose normaliuose audiniuose, tiksliau realaus laiko PGR. Normalus: gretimuose normaliuose audiniuose. (C), išraiška lygis miR-425 buvo nagrinėjama realaus laiko PGR keliomis skrandžio vėžio ląstelių linijų ir šešių normalių skrandžio gleivinės ląsteles.
1 lentelė Reikšmingas reguliacijos sutrikimas ir miRNAs
ekspresija IL-1β sukeltas-AGS ląstelių
Mirna
Sulenkite pakeisti
p reikšmė
HSA-Pasaulis-425
12,36
0.00
hsa-miR-584
11.03
0.01
hsa-miR-31
8.12
0.00
hsa-miR-155
6.22
0.00
hsa-let-7i
5.55
0.00
hsa-miR-21
5.11
0.00
hsa-miR-335
4.89
0.01
hsa-miR-191
4.73
0.03
hsa-miR-519d
4.37
0.02
hsa-miR-520d-5p
3,95
0.00
hsa-miR-331
3.67
0.01
hsa-miR-142
3.45
0.01
hsa-miR-518a-5p
3.28
0.01
hsa-miRPlus-F1231
3.11
0.01
hsa-miR-2113
2.94
0.02
hsa-miR-196a*
2.88
0.02
hsa-miR-1304
2.78
0.02
hsa-miR-185
2.65
0.01
hsa-let-7a
2.61
0.00
hsa-miR-130
2.52
0.02
hsa-miR-1280
2.50
0.01
hsa-miR-222
2.47
0.01
hsa-let-7c
2.43
0.00
hsa-miR-602
2.31
0.00
hsa-miR-548e
2.31
0.03
hsa-miR-32
2.27
0.04
hsa-miR-181a
2.24
0.02
hsa-miR-7
2.13
0.00
hsa-miR-21*
2.06
0.00
Underexpressed IL-1β sukeltas-AGS ląstelių
Mirna
Fold pokytis pervežimas p reikšmė
hsa-miR-143
0.06
0.02
hsa-miR-200
0.08
0.01
hsa-miR-451
0.13
0.01
hsa-miR-144
0.17
0.00
hsa-miR-363
0.20
0.01
hsa-miR-637
0.25
0.03
hsa-miR-153
0.39
0.01
hsa-miR-139
0.39
0.00
hsa-miR-617
0.42
0.01
hsa-miR-1915
0.43
0.00
hsa-miRPlus-F1153
0.45
0.00
hsa-miR-381
0.46
0.00
hsa-miR-145
0.47
0.02
hsa-miR-659
0.47
0.03
hsa-miR-125b
0.48
0.00
hsa-miR-183*
0.49
0.00
hsa-miR-638
0.49
0.01
*: Kai du brandus miRNAs kilę iš priešingų ginklų tos pačios anksto Mirna, žvaigždute po pavadinimo rodo Mirna išreiškė žemo lygio, palyginti su Mirna priešinga rankos yra segtukas
Tarp šių miRNAs, miR-. 425 buvo labiausiai aktyvinama nuo IL-1β indukcija. Naudojant realaus laiko PGR analizė, analizavome Pasaulis-425 išraišką 36 suporuotų mėginių (naviko ir gretimuose normaliuose audiniuose iš to paties paciento). Mes nustatėme, žymiai aukštesnio lygio Pasaulis-425 išraiška navikų mėginiuose, palyginti su lygius gretimose normaliuose audiniuose (psl
< 0,0001) (1B pav.) Mes išnagrinėjome raiškos lygį PPN-425 į skrandžio vėžio ląstelių linijų ir šešių normalių skrandžio gleivinės ląstelių rinkinys. Kaip parodyta 1C paveiksle, mes pakėlė AGS ląsteles žemyn reguliuojama miR-425 ir NVI-N87 ląstelių su iki reguliuojama MIR-425 tolesnei analizei. Nors miR-425 aktyvacijos buvo pranešta turėti esminį poveikį vėžio inicijavimo ir progresavimo vėžinių ląstelių mažinant plataus tinklo genų ekspresiją [15], miR-425 vaidmenį žmogaus vėžio neišaiškintas , . Todėl mes pasirinkome MIR-425 tolesniam tyrimui
išraiška PTEN neigiamai reglamentuoja miR-425
nustatyti PPN-425 tikslų, mes įdarbinti dažniausiai naudojamas algoritmas, miRecords (http: //mirecords . biolead. org /), kuris yra integruotas išteklių gyvūnų Mirna netikslinių sąveiką. Norėdami padidinti šio prognozavimas, genų, kurie buvo prognozuojama bent penkių vienuolika duomenų bazių (Diana microinspector, Miranda, mirtarget2, mitarget, nbmirtar, pictar, Pita, rna22, rnahybrid ir targetscan) tikslumas buvo pasirinktas kaip tariamų tikslų. Tarp šių tariamų tikslų PPN-425, genų ontologija analizė atskleidė, kad sąvoka lygiai 9 kandidačių genų buvo pakeisti; tokiu būdu, tai pakeitimas galėtų prisidėti prie piktybinio fenotipo. Naudojant 3 'UTR liuciferazė reporteris bandymo rezultatais, mes nustatėme, kad Pasaulis-425 smarkiai slopino liuciferazės veiklos raiška į HEK293 ląstelių ir AGS ląstelių išreiškiančius laukinio tipo PTEN 3 "UTR reporteris (2a pav.) Mes patvirtino, kad PTEN yra spėjamas tiesioginė tikslinė miR-425. Kad būtų aiškiau, PPN-425 specifiką, mes parodė, kad kovos su Pasaulis-425 specialiai panaikino liuciferazės veiklos sukeltos miR-425 į HEK293 ląstelių ir NVI-N87 ląstelių (2b pav) slopinimas. Mutacijas Mirna jungimosi vietų (2c pav) pavert "stato nereaguoti į Pasaulis-425 indukcijos (2D brėžinį), taip pat patvirtinama, kad PTEN genas yra tiesioginis taikinys miR-425. 2 pav Pasaulis-425 tiesiogiai skirta PTEN. (A), Žurnalistė ištirtas HEK293 ląstelių ir AGS ląstelių transfektuotose miR-425 ir stato vežančių liuciferazės kDNR kondensuotą 3 "UTRs numatomomis kandidačių tikslų (vidurkis ± SEM). (B) Poveikis anti-miR-425 dėl liuciferazės veiklos liuciferazės konstruktų lydyto su 3 "UTRs apie PTEN į HEK293 ląstelių ir NVI-N87 ląstelių (vidurkis ± SEM). (C, D) Žurnalistė ištirtas HEK293 ląstelių ir AGS ląstelių transfektuotose liuciferazės konstruktai, vežančių PTEN 3 'UTRs su mutacijomis Mir-425-jungimosi vietų (vidurkis ± SEM). (E) HEK293 ląstelių ir AGS ląstelės buvo pernešta su liuciferazės konstruktą gabenančiam laukinio tipo PTEN 3 "UTR (LUC-WT) arba konstruktą vežančių mutavo PTEN 3" UTR (LUC-Mut). Po to, kai 24 h, ląstelės buvo gydomi IL-1β, ir liuciferazės veikla buvo įvertintas 24 h po gydymo. (F) Western blot ir RT-PGR rodo PTEN baltymų koncentracijos ir iRNR lygiui į AGS ląstelių po 48 h miR-425 transfekciją. (G) AGS ląstelės buvo transfekuota su anti-miR-425, ir 24 val vėliau, ląstelės buvo arba kairėje neapdorotas ar apdorotas IL-1β ir vėliau išaugintų 24 val po gydymo. Sveikos ląstelių fragmentai buvo immunoblotted su PTEN antikūnų. (H) NVI-N87 ląstelės buvo pernešta su anti-miR-425 ir nuimami 24 h po gydymo. Sveikos ląstelių fragmentai buvo immunoblotted su PTEN antikūnų. (I) AGS ląstelės buvo transfekuota su plazmidės, kuriame yra tik atviras skaitymo rėmelis seką PTEN (PTEN-CD). Po to, kai 24 h, ląstelės buvo gydomi IL-1β arba miR-425. Sveikos ląstelių fragmentai buvo tiriami munoblotingu po 24 h gydymo. (* P < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001)
Be to, mutacija ir miR-425 taikinio sekai, taip pat žymiai susilpnintas IL-1β sukeltas Represijos PTEN 3 'UTR. liuciferazė reporteris veikla HEK293 ląstelių ir AGS ląstelių (2e pav). Padidėjusi miR-425 pakako downregulate PTEN išraišką tiek baltymų ir mRNR lygių AGS ląstelių (2f paveikslą). Taigi, IL-1β sukeltos PTEN represijos buvo išgelbėtas išreikšdama anti-mir-425 į AGS ląstelių (2G pav). Anti-Pasaulis-425 galėjo iki reguliuoti PTEN išraišką NVI-N87 ląstelių be IL-1β stimuliacijos (2H pav.)
Mūsų duomenys taip pat parodė, kad 3 'UTR būtinas Mir-425-tarpininkaujant PTEN downregulation nes išraiška PTEN kodavimo regionas konstrukto (PTEN-CDS) buvo nejautrus Pasaulis-425 raiškos ir IL-1β indukcijos AGS ląstelių (2i pav). Kartu paėmus, šie rezultatai rodo, kad Pasaulis-425 vaidina lemiamą vaidmenį represuoti PTEN išraišką nukreipiant savo 3 "UTR nuo IL-1β indukcija.
IL-1β sukeltos NF-kappaB aktyvavimo reikia Mir-425 indukcijos
Norėdami nustatyti mechanizmą dalyvauja Pasaulis-425 transactivation ant IL-1β indukcijos, mes išnagrinėjo įvairių kinazės inhibitorių poveikį Pasaulis-425 indukcijos IL-1β gydytų AGS ląsteles. IL-1β sukeltos Pasaulis-425 ląstelę buvo žymiai slopinamas IK inhibitorių TPCA-1, bet ne pagal p38 MAPK inhibitorių BIX02188 arba JNK inhibitoriaus SP600125 (3a pav.) Ankstesni tyrimai parodė, kad IKK yra esminis kinazės reikalingas NF-kappaB signalizacijos; Todėl šis rezultatas nurodė svarbų vaidmenį NF-kappaB signalizacijos sistema PPN-425 transkripcijos reguliavimo ant IL-1β indukcija. 3 pav IKK aktyvinimas svarbus miR-425 indukcijos, reaguojant į IL-1β indukcijos. (A) AGS ląstelės buvo gydomi IL-1β atsižvelgiant į IKK inhibitorių TPCA-1, kad p38 MAPK inhibitoriaus BIX02188 ir JNK inhibitoriaus SP600125 buvimą. Brandaus Pasaulis-425 išraiška 12 h po gydymo buvo kiekybiškai realaus laiko PGR. Sulenktas santykinio Pasaulis-425 išraiškos kaita (MIR-425 /U6) buvo normalizuotas, kad pastebėtas PBS gydytų ląsteles. (B) pirminei miR-425 išraiška (pri-Pasaulis-425) buvo analizuojami realaus laiko PGR kaip A. (C) Sąvoka lygius NF-kappaB baltymų ir pri-Pasaulis-425 buvo analizuojami Real- laiko PGR į AGS ląstelių gydomiems siRNAs už NF-kappaB. (D) AGS ląstelės buvo gydomi chemija inhibitoriais arba siRNAs už NF-kappaB. Ląstelių fragmentai buvo gauti 24 h po IL-1β gydymo ir immunoblotted su PTEN antikūnų. (R) Vakarų dėmė analizė fosforilinto NF-kappaB 65 psl (serino 536). (F) sąvoka lygiai NF-kappaB baltymų ir pri-Pasaulis-425 buvo analizuojami realaus laiko PGR NVI-N87 ląstelių gydomiems siRNAs už NF-kappaB. (* P < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001).
Nuosekliai, indukcija pri-miR-425 ant IL-1β gydymo, buvo nepaprastai slopinamas atsižvelgiant į IKK inhibitorių buvimo arba siRNAs už NF-kappaB (3b pav ir C). Mes taip pat pastebėjo, kad IL-1β sukeltos PTEN represijos buvo susilpnintas atsižvelgiant į IK inhibitoriumi arba siRNAs už NF-kappaB (3D paveikslas) buvimą. Norėdami nustatyti, ar NF-kappaB veikla buvo pateikti AGS ląstelių gydomiems IL-1β, mes panaudojome Vakarų dėmė nustatyti fosforilinto NF-kappaB 65 psl (serino 536) lygį. Iš fosforilinto NF-kappaB 65 psl (serino 536) lygis buvo aukštas AGS ląstelių gydomiems IL-1β (10 ng /ml; 24 valandos) (3E pav.) Be to, triukšmo slopinimo NF-kappaB slopinamas Pasaulis-425 išraišką NVI-N87 ląstelių be IL-1β gydymo (3F pav.) Šie rezultatai rodo, kad IK priklauso nuo NF-kappaB aktyvacijos ant IL-1β gydymo reikia PTEN downregulation, greičiausiai per savo gerinimo PPN-425 transkripcijos.
Norėdami nustatyti, ar NF-kappaB tiesiogiai reguliuoja Pasaulis-425 transkripciją, mes analizuojami tiekėjų sekas PPN-425 per WeightMatrix biblioteka (matrixTFP60.lib) ir nustatė tris potencialius NF-kappaB jungimosi vietų promotoriaus regione PPN-425 (cut-off: matrica panašumo = 0,9 ir pagrindinė panašumo = 0,95) ( 4A pav.) Mes atlikome chromatino Imunoprecipitacijos (Chip) tyrimams su AGS vėžinių ląstelių, naudojant monokloninius kovos su NF-kappaB antikūnus. Kaip nurodyta 4B paveiksle, tik gruntas-B miR-425 pagamintas stiprių PGR produktų, kurie leidžia manyti, kad NF-kappaB baltymų suformuota kompleksus su B prijungimo vietos ir miR-425 promotoriaus. Į liuciferazės reporteris tyrimų rezultatai rodo, kad potencialus B privalomas svetainė Mir-425 rengėjas reikalingas transactivation antrinę geno ant IL-1β indukcijos (4A ir C pav.) 4 pav NF-kappaB jungimosi vietų Mir-425 rengėjas. (A), Savybės Mir-425 5 "supančių DNR. Žmogaus promotorinės regionai PPN-425 yra tris spėjamus privalomus svetaines NF-kappaB. (B) lustas tyrimai su anti-NF-kappaB antikūnų parodė, jungiasi NF-kappaB į miR-425 promotoriaus AGS ląstelių. Santykiniai occupancies NF-kappaB yra nurodoma kaip vertikalių strypų. Brūkšniniai grafikai parodyti trijų nepriklausomų Chip eksperimentų vidurkiai. (C) miR-425 rengėjas buvo aktyvuota NF-kappaB. AGS ląstelės buvo gydomi NF-kappaB ir perkeltų su nurodytais Luc vektorių.
Indukcija miR-425 skatina ląstelių išgyvenimą ant IL-1β indukcijos
Buvo parodyta, kad PTEN yra tarp dažniausiai inaktyvuotų navikas slopintuvas genų. Padidėjusi PTEN įvairių žinduolių audinių kultūros ląstelių veikia įvairius procesus, įskaitant ląstelių proliferaciją, ląstelių mirties ir ląstelių migraciją [16]. Mes taip pat nustatyta, kad slopina PTEN sumažėjo kaspazės-3 aktyvaciją ląstelių, gydytų IL-1β (5a pav). Tai tikėtina, kad Pasaulis-425 indukcija gali slopinti apoptozę per iš PTEN downregulation IL-1β gydytų ląsteles. Iš tiesų, raiška miR-425 inhibuoja kaspazės-3 aktyvacijos cisplatinos gydytų AGS ląstelių (5b pav.) Be to, cisplatinos gydytų AGS ląstelių, kontransfekcijai iš Konstruktas, kurių sudėtyje yra tik PTEN koduojančios srities (PTEN-CD), kuris yra nejautrios miR-425, apeiti antiapoptotic poveikį miR-425 raiškos (5C pav). Todėl transfekcija anti-miR-425 į AGS ląstelių gerokai sustiprinti kaspazės-3 aktyvinimą ir apoptozę reaguojant į IL-1β gydymo (5d pav.) Be to, transfekcija anti-miR-425 į NVI-N87 ląstelių gerokai sustiprinti kaspazės-3 aktyvinimą ir apoptozę be IL-1β stimuliacijos (5E pav.) 5 paveikslas Pasaulis-425 slopina ląstelių apoptozę iki represuoti PTEN. (A). AGS ląstelės buvo gydomi kontrolės (PBS) arba IL-1β. Po 48 h, nepažeistų ląstelių Lizatai immunoblotted. (B). AGS ląstelės buvo laikinai perkeltų su neigiamos kontrolės (MIR-NC) arba miR-425 vien. Po to, kai 24 h, ląstelės buvo gydytos cisplatina ir nuimami 24 h po gydymo. Sveikos ląstelių fragmentai buvo immunoblotted. (C). AGS ląstelės buvo pernešta su miR-NC, PPN-425, ir PTEN-CDS kaip nurodyta. Po to, kai 24 h, ląstelės buvo gydytos cisplatina ir nuimami 24 h po gydymo. Ląstelių apoptozė norma buvo nustatoma naudojant tėkmės citometrijos metodu. (D). AGS ląstelės buvo pernešta su miR-NC arba anti-miR-425. Po to, kai 48 h, ląstelės buvo gydomi IL-1β ir nuimami 24 h po gydymo. Iš viso ląstelių fragmentai buvo immunoblotted su nurodytais antikūnų ir ląstelių apoptozė norma buvo nustatoma naudojant tėkmės citometrijos metodu. (R) NVI-N87 ląstelės buvo pernešta su miR-NC arba anti-miR-425. Iš viso ląstelių fragmentai buvo immunoblotted su nurodytais antikūnų ir ląstelių apoptozė norma buvo nustatoma naudojant tėkmės citometrijos metodu.
Laikantis jos vaidmenį slopinant kaspaze aktyvavimo, ląstelę PPN-425 iš esmės patobulintą "AGS ląstelių proliferacija, o pro- išlikimo poveikis buvo visiškai užblokuotas bendradarbiavimo transfekciją su egzogeninės PTEN (PTEN-CDS) (6a pav). Anti-Pasaulis-425 sumažino proliferuojančias ląstelių NVI-N87 ląstelių (6b pav) procentas. Mes taip pat nustatė, kad slopina PTEN turėjo apsauginį poveikį, panašų į tą pastebėtas ląstelių ekspresija MIR-425 (6c paveikslas) rodo, kad PTEN represijas gali vaidinti svarbų vaidmenį Pasaulis-425-priklausomo apsaugos ląstelėse gydomiems IL-1β. 6 pav Pasaulis-425 skatina ląstelių platinimu represuoti PTEN. (A), AGS ląstelės buvo gydomi PBS, IL-1β, PPN-NC, PPN-425, ir PTEN-CDS kaip nurodyta. Po 72 h, ląstelių proliferacija buvo nustatomas naudojant Edu ženklinimo rinkinys. (B), NVI-N87 ląstelės buvo pernešta su miR-NC arba anti-miR-425. Po 72 h, ląstelių proliferacija norma buvo nustatoma naudojant Edu ženklinimo rinkinys. (C) AGS ląstelės buvo gydomi siRNA-PTEN ar miR-425. Po 72 h, ląstelių proliferacija buvo nustatomas naudojant Edu ženklinimo rinkinys. (D) nuotraukos iš PTEN baltymų raiškos naviko audiniuose (viršutinis plokštės) ir navikų (apatinių panelių). (R) Grafikas rodo 3 navikų svorį po 4 savaičių (n = 3). (F) reikšmingas atvirkštinis ryšys stebimas tarp Mir-425 ir PTEN raiškos lygių skrandžio vėžio audiniuose (n = 52). (G) ekspresijos lygis PTEN nustatomos šešių normalių skrandžio gleivinės ląstelių ir skrandžio vėžio ląstelių linijų, naudojant realaus laiko PGR. (H) modelis, iliustruojantis spėjamus vaidmenis IL-1β ir Pasaulis-425, atsižvelgiant į PTEN kelio į žmogaus skrandžio karcinoma ląstelių kontrolei.
Mes tyrė PPN-425 poveikį tumorogeniš- in vivo. Apdoroti su anti-miR-425 navikai parodė padidėjo lygius PTEN baltymų (6d pav.) Taip pat, anti-miR-425 sumažino naviko svorį pelių, palyginti su miR-NC-gydytoje grupėje (6e pav). Naudojant neparametriniai testai, mes nustatėme reikšmingą atvirkštinę koreliaciją tarp PTEN mRNR ir Pasaulis-425 raiškos skrandžio vėžio mėginių (6F pav). Ekspresijos lygis PTEN taip pat buvo nustatytas šešių įprastomis skrandžio gleivinės ląstelės ir skrandžio vėžio ląstelių linijų, naudojant realaus laiko PGR. Kaip parodyta, ląstelės su "žemyn reguliuojama" Pasaulis-425 turi didesnes sumas PTEN palyginti su ląstelių linijų su "Iki reguliuojamų" Pasaulis-425 lygių (6g pav). Taigi, mūsų rezultatai įrodė, kad Pasaulis-425 vaidina priežastinis vaidmenį per orientacija PTEN skrandžio vėžio.
Diskusijos
Interleukinas 1 (IL-1) yra pagrindinis Pro-uždegiminių citokinų, kuri pagaminta piktybiniai arba mikroklimato ląstelės [17]. IL-1 taip pat veikia kaip pleiotropic citokino dalyvauja tumorigenezei, ir naviko invazijos; Todėl ji yra įmanomas kandidatas moduliacinį citokino, kuri gali pakreipti tarp uždegimo ir imunitetui pusiausvyrą link priešvėžiniai atsakymų indukcijos [18]. IL-1α ir IL-1β yra pagrindiniai agonistai IL-1. Jų išskiriami formų, IL-1α ir IL-1β suriša tą pačią receptorių ir indukuoja tomis pačiomis biologinėmis funkcijas [19]. Tačiau, IL-1α ir IL-1β skiriasi savo compartmentalization ląstelės viduje, arba jo mikroaplinkoje [20]. IL-1β yra aktyvus tik savo išskiriami forma ir sukelia uždegimą, kuris skatina Kancerogeninis ir naviko invazinis ir imunosupresija [21]. Kai naujų kovos su IL-1β agentai buvo naudojami klinikiniuose tyrimuose pacientams, eksponuoti įvairių ligų su uždegimo apraiškų [22]. Geresnis supratimas integruotos vaidmenį IL-1β signalizacijos kelius į piktybinio proceso leis romano IL-1β moduliavimo taikymo metodus, sergantiems vėžiu.
PTEN buvo atrasta kaip svarbus naviko slopintuvas, kad dažnai mutavo ar prarastas įvairios vėžio [23]. Kai kurie faktai išryškino PTEN kaip lipidų fosfatazės, kad hidrolizuodamas 3 'fosfato, phosphoinositides [24]. PTEN taip pat gali reguliuoti serino /treonino kinazės AKT /PKB veiklą ir todėl gali turėti įtakos ląstelių išgyvenimą signalizacijos [25]. UV spindulių poveikio gali sukelti PTEN sąveiką su laukinio tipo melanocortin-1 receptorių variantų, kuris apsaugo PTEN nuo WWP2 sąlygojamą degradacija, todėl AKT nukenksminti melanomos [26]. Yra keli mechanizmai, skirti PTEN reglamentavimo, įskaitant Transkribavimas, iRNR stabilumo, MicroRNA nukreipimą, vertimo ir baltymų stabilumą. PTEN yra transkripciškai nutildyti promotoriaus metilinimo skrandžio karcinoma [27]. PTEN taip pat gali būti po translationally reglamentuoja acetilinimo, ubiquitylation, oksidacija, fosforilinimas ir pavienių ląstelių tyri- mas lokalizaciją [28]. Nepaisant intensyvių apibūdinimo PTEN mutacijų žmogaus vėžio ir gana gerai suprasti molekulinius vaidmenų PTEN į ląstelių procesų kontrolės, mažai žinoma apie rūšių PTEN reglamentą.
PTEN gali būti slopinamas vėžinių ląstelių nuo indukcijos Pro-uždegiminių citokinų IL-1β [29]. Stimuliavimas su IL-1β aktyvuoja NF-kappaB iki fosforilinimo ir degradacijos IκB. Ši aktyvacija leidžia NF-kappaB į translocate į branduolį ir transkripciškai aktyvuoti tikslines genus [30]. NF-kappaB yra heterodimerinis transkripcija aktyviklio, susidedantis iš DNR privalomu subvieneto P50 ir transactivation subvieneto 65 psl [31]. Didelis endogeninio NF-kappaB sumažino PTEN išraiška, ir PTEN išraiška gali būti išgelbėti specifiškai slopinantis NF-kappaB keliu [32]. Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį.
Autorių originalios pateikti failai vaizdų
Žemiau išvardintos nuorodos į autorių originalių pateiktų failų vaizdų , Visi autoriai skaityti ir patvirtino galutinį rankraštį.

• Įtaka IL17A polimorfizmas ant nukrypusiu nuo normos metilinimo DAPK ir CDH1 į nevėžinės skrandžio mucosa
• Neįprastos trichobezoar skrandžio ir žarnyno: byla report