NF-kappaB odvisna od MicroRNA-425 Povecanje spodbuja rast želodčni rak celic z usmerjanjem PTEN na IL-1β induction

NF-kappaB odvisna od MicroRNA-425 Povecanje spodbuja rast želodčni rak celic z usmerjanjem PTEN na IL-1β indukcijo
Povzetek
prekomerno izražanje vnetnih citokinov IL-1β je povezana z različnimi boleznimi, vključno z rakom. Sprememba microRNAs so opazili pri rakavih celicah, izpostavljenih vnetnih citokinov, vendar njihova funkcija v vnetja stresa še vedno nedosegljiva. Tukaj bomo pokazali, da IL-1β inducira uravnavanjem miR-425, ki negativno ureja fosfatazo in tensin homolog izražanje z usmerjanjem svoje 3 'UTR. Povečanje miR-425 je odvisna od IL-1β inducirane aktivacije NF-kappaB, ki izboljša miR-425 gensko transkripcijo na indukcijo IL-1β. Zato zatiranje fosfataze in tensin homolog ga miR-425 spodbuja želodčni rak proliferacije celic, ki je potrebna za zaščito celic pred-cisplatinom inducirane apoptoze. Skupaj, naši podatki potrjujejo pomembno vlogo pri NF-kappaB odvisni uravnavanjem miR-425, ki predstavlja novo pot za represijo aktivacije fosfataze in tensin homologena in spodbujanje preživetja celic ob IL-1β indukcijo.
ključne besede
IL-1β NF-kappaB miR-425 PTEN rak želodca Ozadje
adenokarcinomom želodca je četrti in peti najpogostejši rak pri moških in ženskah, v tem zaporedju, po vsem svetu in je močno povezana s kronično vnetje [1]. Zdaj je dobro sprejet, da okužba s Helicobacter pylori
(H. pylori
) igra pomembno vlogo pri nastanku kroničnega vnetja, ki vodi do maligne bolezni [2]. Kronično vnetje želodca sproži histopatološko napredovanje kroničnega gastritisa želodčnemu atrofijo, intestinalno metaplazijo in rak želodca končno [3]. Medtem ko je H. pylori
okužba je zelo razširjena, se bo le manjšina (približno 1%) okuženih posameznikov razvoj raka želodca, po mnogih letih. Zdi se, da spremenljivka odziv na to skupno patogena, ki ureja genetsko nagnjenost k visokim ravnem izražanjem vnetnih citokinov [4].
jedrska faktorja kappa B (NF-kappaB) pot že dolgo veljajo za velik vnetnih signalizacijo pot, večinoma na osnovi aktiviranja NF-kappaB ga vnetnih citokinov in vlogi NF-kappaB v transkripcijske aktivacije odzivnih genov vključno citokinov in Kemokini [5]. "Kanonično" pot za aktiviranje NF-kappaB sproži vnetnih citokinov, kot so IL-1β in običajno vodi do aktivacije odnosov ali cRel-vsebujejo komplekse [6]. NF-kappaB obstaja v citoplazmi v neaktivni obliki, povezane z regulatornimi proteini iz kot inhibitorji κB (IκB), od katerih so lahko najpomembnejše IκBα, IκBβ in IκBε. IκBα je povezan s prehodnim aktivacije NF-kappaB, medtem ko IκBβ vpleten v trajno aktivacijo [7]. Vendar kronična vnetja je kompleksen fiziološki proces in vloga NF-kappaB v vnetnega odziva še ni povsem raziskan.
Poleg prizadene kodiranja protein izražanje genov, vnetje stres tudi spreminja nivo ekspresije microRNAs (miRNAs) [8]. MicroRNAs so razred endogenega, majhna, nekodiran RNA, ki negativno regulirajo izražanje genov na post-transkripcijski ravni predvsem preko vezave na neprevedene regije 3 'ciljnega mRNA in imajo pomembne regulativne funkcije pri obvladovanju raznolikih fiziološke in patološke procese [9, 10]. Te RNA je bilo dokazano, da sodelujejo pri urejanju številnih celičnih procesov, vključno s proliferacijo, diferenciacijo in apoptozo [11-13]. Vendar, ali kronično vnetje ureja Mirna izraz, in sicer s spreminjanjem gensko transkripcijo ali spremembo post-transkripcijski dozorevanje ni bila ugotovljena.
V tem delu smo ugotovili, da je miR-425 indukcija na IL-1β inducirane vnetja odvisna od aktivacije NF-kappaB, kar naj bi povečalo miR-425 gensko transkripcijo. Poleg tega molekul miR-425 neposredno usmerjene fosfataza in tensin homolog (PTEN) in negativno urejeno njegovo izražanje, ki spodbuja celično preživetje ob IL-1β indukcijo.
Eksperimentalni postopki
izjavo etiko
so vsi osebki pridobljeni iz bolnikov, ki so imeli operacijo na Fudan University Shanghai Cancer Center. Protokol je bil odobren s kliničnimi raziskavami Odbor za etiko iz leta Fudan univerze in raziskave je bila izvedena v skladu z določbami Helsinške deklaracije iz leta 1975. sosednjih zdravih tkivih so izrezali od želodca lezijo raka mikroskopom in njihova histološka diagnoza je bila potrjena mikroskopsko. Pisna privolitev je bila pridobljena od vseh udeležencev, vključenih v raziskavo.
Celične kulture in reagenti
humanih embrionalnih ledvičnih celic linije HEK293 (ATCC® CRL-1573 ™), je človek dojke celična linija MDA-MB361 (ATCC ® HTB-27 ™), človeško želodca adenokarcinom celične linije AGS (ATCC® CRL-1739 ™), snu-1 (ATCC® CRL-5971 ™), snu-5 (ATCC® CRL-5973 ™), snu-16 (ATCC® referenčnim laboratorijem Skupnosti za 5974 ™), Hs746T (ATCC® HTB-135 ™), so bile po NCI-N87 (ATCC® CRL-5822 ™), in KATO III (ATCC®HTB-103 ™) ohraniti v DMEM, ki vsebuje 10% fetalnega goveji serum. Vse celične linije smo ohranjali in medijev, ki vsebujejo penicilin (100 ie /ml) in streptomicin (100 mg /ml) pri 37 ° C s 5% CO 2. Mirne posnema in anti-miRNA so bile kupljene od Ambion (Austin, TX, ZDA). IKK inhibitor TPCA-1 (kat. Št S2824), zaviralec p38 MAPK BIX02188 (kat. Št S1574) in SP600125 zaviralec JNK (kat. Št S1460) so bile kupljene od Selleckchem (Houston, TX, ZDA). Rekombinantni človeški IL-1β bili kupljeni pri Sigma-Aldrich (kat. Št H6291, Šanghaj, Kitajska).
Ekstrakcijo RNA in PCR v realnem času
Total RNA je bila vzeta iz celic, ki uporabljajo TRIzola (Invitrogen, Carlsbad, CA ). Za analizo microRNA so poli (A) rep dodamo k skupnemu RNA z uporabo poli (A) polimeraza (Ambion, Carlsbad CA) pred reverzne transkripcije. Zaznavanje komplet MiRcute miRNA qPCR (TIANGEN, Peking, Kitajska), je bila uporabljena za kvantitativno raven izražanja odraslih miR-425 v skladu s priloženim protokolom, in GAPDH je bila uporabljena kot notranji nadzor. PCR v realnem času smo izvedli pod naslednjimi pogoji: 95 ° C 10 m, 1 cikel; 95 ° C 10 s, 55 ° C 34 s, 40 ciklov.
Pri vseh rezultatov, ki jih v realnem času metod PCR smo uporabili delta delta CT metodo za izračun kratno spremembo v izražanju genov med različnimi skupinami. Količina cilja (PTEN /miR-425), normalizirano na endogeni vzdrževalni gen GAPDH, in glede na referenčni vzorec, je podana z naslednjo enačbo:. Količina target = 2 - △△ CT
imunoblot
Proteine ​​smo ločili na 10% SDS-PAGE gela in nato prenese na PVDF membrano. Po blokiranjem s 5% nemastnim mlekom, smo membrano inkubirali s mišjega monoklonskega anti-PTEN protitelesa (1: 500, Santa Cruz, SC-7974) in NF-kappaB p65 fosfo (pS536) (Rela) protitelesa (1: 10.000 ., EPITOMICS, Cat #: 2220-1). IRdye označenega sekundarnih protiteles, ki so bili uporabljeni za kvantifikacijo z imuno-signala, signali pa so bili analizirani z uporabo Odyssey skener (LI-COR bioznanosti, Lincoln, NE, ZDA).
Luciferazni test
HEK293 celice in AGS celic so bili transfekciji s miR-425 in pGL3 luciferaza reporter konstrukti zatočišča ciljno zaporedje miR-425. Po 24 urah so bile aktivnosti kresničkino luciferazo in renilla luciferaze v lizatov celic, merjena z Dual-luciferazni test System (Promega, Madison, WI, ZDA). Za luciferazni transkripcije reporterskega testa, MIR-425 gen promotorske sekvence (WT ali izbris stran) smo klonirali v promotorski regiji pGL3-Basic vektorja, in merimo luciferazno aktivnost, kot je opisano zgoraj.
Kromatin imunoprecipitacije (ChIP)
na kratko, so bile obdelane celice zamrežen z 1% formaldehida, striženo s povprečno velikostjo 400 bp, in nato imunoprecipitirali s protitelesi proti NF-kappaB (santa Cruz, sc-166.588). Primerji chip-PCR so bili načrtovani za razširitev promotorja regije, ki vsebujejo domnevna NF-kappaB veznih mest znotraj miR-425, kot je prikazano na sliki. Pozitivna kontrola protitelesa (RNA polimeraza II) in negativno kontrolo, ki niso imuni IgG so bili uporabljeni za dokazovanje učinkovitosti reagentov kit (Epigentek Group Inc, P-2025-48). Imunoprecipitirali DNA nato očistimo, sprosti in eluiramo. Eluirani DNA lahko uporabimo za nadaljnji aplikacije chip-PCR. Krat obogatitev (FE) smo izračunali z uporabo razmerja učinkovitosti ojačanja vzorca čipa nad tem ne-imunskega IgG. Pomnoževanje učinkovitost polimerazo RNA II uporabimo kot pozitivno kontrolo. FE% = 2 (IgG CT - Vzorec CT). × 100% test
Cell širjenje
A proliferacije celic smo izvedli s pomočjo štetje celic Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japonska) glede na navodila proizvajalca. Pred dodatkom CCK-8, so bile celice izperemo s toplim gojišč s predenjem ploščo na 500 rpm za 3 m in nato zavržemo supernatant.
Celice apoptoza testa
bile med rakave celice poberemo in ponovno suspendirali v 500 ul obvezujoči pufra. Celično suspenzijo (100 ml) smo inkubirali s 5 ul aneksina-V in propidijevim jodidom pri sobni temperaturi 20 minut. Obarvane celice smo analizirali z žarnico aktivira celično razvrščanje (FACS) z uporabo toka BD LSR II citometrijo.
Cell ciklusu
Za citometrija analize so celice tripsinizirali in je določeno v 70% etanolu čez noč. Celice smo nato inkubirali v 0,5 ml propidijevim raztopine jodida, ki vsebuje 25 mikrogramov ml -1 RNase 15 minut pri 37 ° C in izmeriti.
Mouse poskusi
NCI-N87 celice (3 x 10 6) smo injicirali v desno boki atimičnih nu /nu miši. En teden po injekcijah, so miši, obdelane s primerljivo velikimi tumorji 4 tedne z anti-pokoj-425. Anti-miR-425 (2 nmol) smo injicirali neposredno v tumor dvakrat tedensko 4 tedne.
Statistična analiza
Rezultati so predstavljeni kot sredstvo ± SEM, in podatki, ki so bili analizirani z Studentov t test. Vrednost p
< 0.05 zdela statistično značilne.
Rezultati
IL-1β zdravljenje inducira miR-425 izraz
Za opredelitev miRNAs odgovorne za IL-1β indukcije, smo profilirane Mirna izraz v PBS, zdravljenih AGS celic in IL-1β inducirano AGS celice, ki uporabljajo Exiqon miRCURY ™ LNA Array System (v.14.0). Ravni MIRNA močno razlikuje med PBS zdravljeni skupini in IL-1β inducirane skupine, kot je prikazano v toplotnem zemljevidu, prikazanem na sliki 1A. Med zajemanje sond na 1.891, je bilo 46 miRNAs različno izražena v AGS celicah IL-1β, povzročene v primerjavi s seznanjenimi PBS, zdravljenih AGS celic; teh miRNAs, 29 so se povečale in jih je bilo 17 v IL-1β inducirane AGS celic (tabela 1) zmanjšalo, kar kaže, da je posebna miRNA vzorec povezan z IL-1β indukcijo. Slika 1 disregulacijo miRNAs v AGS celicami, zdravljenih z IL-1β. (A) Human AGS celice so bili zdravljeni z IL-1β (10 ng /ml) [14], in 24 ur kasneje, je bil profil miRNAs izraz analizirali z mikromrež tehnologijo. Heat map diagram ustvari nenadzorovano analize grozdenja s 46 bistveno dysregulated miRNAs. Red kaže pozitivni vpliv; zelena označuje downregulation. (B) Povišane ravni miR-425 v 36 vzorcih tumorja glede na njihovo raven v izravnanih sosednjih normalnih tkivih, izražene s PCR v realnem času. Normalno: sosednja normalna tkiva. (C) stopnja Izražanje miR-425 so bile pregledane z PCR v realnem času v več želodčnih raka celičnih linij in šestih normalnih želodčne sluznice celice.
Tabela 1 Pomemben disregulacijo od miRNAs
izraženi pri IL-1β inducirano-AGS celic
miRNA
kratno spremembo
p vrednost
HSA-miR-425
12.36
0.00
hsa-miR-584
11.03
0.01
hsa-miR-31
8.12
0.00
hsa-miR-155
6.22
0.00
hsa-let-7i
5.55
0.00
hsa-miR-21
5.11
0.00
hsa-miR-335
4.89
0.01
hsa-miR-191
4.73
0.03
hsa-miR-519d
4.37
0.02
hsa-miR-520d-5p
3,95
0.00
hsa-miR-331
3.67
0.01
hsa-miR-142
3.45
0.01
hsa-miR-518a-5p
3.28
0.01
hsa-miRPlus-F1231
3.11
0.01
hsa-miR-2113
2.94
0.02
hsa-miR-196a*
2.88
0.02
hsa-miR-1304
2.78
0.02
hsa-miR-185
2.65
0.01
hsa-let-7a
2.61
0.00
hsa-miR-130
2.52
0.02
hsa-miR-1280
2.50
0.01
hsa-miR-222
2.47
0.01
hsa-let-7c
2.43
0.00
hsa-miR-602
2.31
0.00
hsa-miR-548e
2.31
0.03
hsa-miR-32
2.27
0.04
hsa-miR-181a
2.24
0.02
hsa-miR-7
2.13
0.00
hsa-miR-21*
2.06
0.00
Underexpressed v IL-1β celic, inducirane-AGS
Mirna
kratno spremembo
p vrednosti
hsa-miR-143
0.06
0.02
hsa-miR-200
0.08
0.01
hsa-miR-451
0.13
0.01
hsa-miR-144
0.17
0.00
hsa-miR-363
0.20
0.01
hsa-miR-637
0.25
0.03
hsa-miR-153
0.39
0.01
hsa-miR-139
0.39
0.00
hsa-miR-617
0.42
0.01
hsa-miR-1915
0.43
0.00
hsa-miRPlus-F1153
0.45
0.00
hsa-miR-381
0.46
0.00
hsa-miR-145
0.47
0.02
hsa-miR-659
0.47
0.03
hsa-miR-125b
0.48
0.00
hsa-miR-183*
0.49
0.00
hsa-miR-638
0.49
0.01
*: Ko dve zreli miRNAs izvirajo iz nasprotnih vej istega pre-miRNA, zvezdico po imenu označuje miRNA izražena na nizki ravni v primerjavi z Mirne v nasprotno roko lasne sponke
Med temi miRNAs, miR-. 425 je najbolj molekul na indukcijo IL-1β. Uporaba v realnem času analize PCR smo analizirali miR-425 izraz v 36 parih vzorcev (tumorja in sosednjih normalnih tkiv iz istega bolnika). Našli smo bistveno višjo raven miR-425 izražanja v vzorcih tumorjev v primerjavi z ravnmi iz sosednjih normalnih tkivih (p
< 0,0001) (slika 1B). Smo preučili nivo ekspresije miR-425 v nizu želodčnega raka celičnih linij in šestih normalnih želodčne sluznice celice. Kot je prikazano na sliki 1C, smo pobrali letnem pregledu rasti celic z določenimi urejene miR-425 in NCI-N87 celic z up-urejena MIR-425 za nadaljnji študij. Čeprav je aktivacija miR-425 poročali, da imajo bistveno vpliva na začetku in napredovanja raka rakavih celic z zmanjšanjem ekspresije široko mrežo genov [15], ni pojasnjena vloga miR-425 v človeških rakih . . Zato smo se odločili, MIR-425 za nadaljnjo preiskavo
Izražanje PTEN ga miR-425
negativno urejeno identificirati cilje miR-425, smo uporabili običajno uporablja algoritem, miRecords (http: //mirecords . biolead. org /), ki je integriran vir za živali miRNA-ciljnih interakcij. Da bi povečali točnost te napovedi, genov, ki so bile napovedane za vsaj pet baz podatkov enajstih (Diana, microinspector, miranda, mirtarget2, mitarget, nbmirtar, pictar, pita, rna22, rnahybrid in targetscan) so bili izbrani kot domnevne cilje. Med temi domnevno ciljev miR-425, analiza genske ontologije je pokazala, da so se spremenile stopnje izraženosti od 9 kandidatnih genih; Tako lahko ta sprememba prispevala k maligni fenotipi. Uporaba 3 'UTR luciferaza reporter teste, smo ugotovili, da je čezmerno miR-425 bistveno blokiranem luciferazne aktivnosti v HEK293 celicah in AGS celic, ki izražajo divjega tipa PTEN 3' UTR reporter (slika 2A). Potrdili smo, da je PTEN določena domnevna neposreden cilj miR-425. Za ponazoritev posebnosti miR-425, smo pokazali, da anti-miR-425 izrecno odpravila inhibicijo luciferazne aktivnosti, ki jih miR-425 inducirane v HEK293 celice in NCI-N87 celic (slika 2b). Mutacije v Mirnski vezavnih mest (slika 2C) topljena konstrukte neodzivni miR-425 indukcijo (slika 2D), dodatno potrjuje, da je gen PTEN neposreden cilj miR-425. Slika 2 miR-425 neposredno namenjen PTEN. (A) reporterskega testa v HEK293 celice in AGS celic, transfektiranih z miR-425 in konstrukti prevažajo luciferazno cDNA fuziran na 3 'UTRs od predvidenih tarč kandidatke (povprečje ± SEM). (B) Učinki anti-miR-425 za luciferazno aktivnost luciferaze konstruktov zlite s 3 'UTRs iz PTEN v HEK293 celice in NCI-N87 celic (srednja ± SEM). (C, D) Reporter testom v HEK293 celice in AGS celic, transfektiranih s luciferaza konstrukti prevažajo PTEN 3 'UTRs z mutacijami v miR-425-vezavna mesta (srednja ± SEM). (E) HEK293 celice in AGS celice smo transfektirali z luciferazno konstruktom nosi divji tip PTEN 3 'UTR (LUC-WT) ali konstrukt nosi mutirano PTEN 3' UTR (LUC-Mut). Po 24 urah smo celice obdelali z IL-1β in luciferazne aktivnosti smo kvantitativno 24 ur po obdelavi. (F) Western blot in RT-PCR, ki prikazuje ravni beljakovin PTEN in ravni mRNA v AGS celic po 48 h miR-425 transfekciji. (G) AGS celice smo transfektirali z anti-miR-425 in 24 ur kasneje, so bile celice bodisi levo neobdelano ali zdraviti z IL-1β in nato požeto 24 ur po obdelavi. Cela lizati celic so immunoblotted z PTEN protiteles. (H) NIS-N87 celice smo transfektirali z anti-miR-425 in nabrani 24 ur po zdravljenju. Cela lizati celic so immunoblotted z PTEN protiteles. (I) AGS celice smo transfektirali s plazmidom, ki nosi le odprto zaporedje obravnava okvirja PTEN (PTEN-CD). Po 24 urah smo celice obdelali z IL-1β ali miR-425. Celi lizate celic podvržemo imuno po 24 urah zdravljenja. (* P 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001)
Poleg mutacija na miR-425 ciljni sekvenci tudi bistveno oslabljena IL-1β-inducirano zatiranju PTEN 3 'UTR. dejavnost novinar luciferaza v HEK293 celicah in AGS celic (slika 2e). Čezmernim miR-425 je bil dovolj, da upocasnjujejo PTEN izraza tako na beljakovine in mRNA v AGS celic (slika 2f). V skladu s tem je IL-1β inducirane PTEN zatiranje rešili z izražanjem anti-MIR-425 v AGS celic (Slika 2G). Anti-miR-425 je lahko up-urejanje PTEN izraz v NCI-N87 celic brez IL-1β stimulacije (slika 2H).
Naši podatki prav tako pokazala, da je 3 'UTR potrebna za miR-425 posredovano PTEN downregulation ker je bila izraz PTEN kodiranja regije konstrukt (PTEN-CDS) neobčutljivi na miR-425 prekomerno in IL-1β indukcijo v AGS celic (Slika 2i). Če povzamemo, ti rezultati kažejo, da ima miR-425 pomembno vlogo pri zatiranju PTEN izraz z usmerjanjem svoje 3 'UTR na IL-1β indukcijo. Je potrebno
IL-1β, povzročene aktivacije NF-kappaB za miR-425 indukcijo
Za določitev vpletenega mehanizma v miR-425 transaktivacije ob IL-1β indukcije, smo preučili vpliv različnih kinaze inhibitorjev na miR-425 indukcije v IL-1β, zdravljenih AGS celic. IL-1β-inducirane miR-425 Povecanje je močno inhibira IKK zaviralcem TPCA-1, ne pa z zaviralcem BIX02188 na p38 MAPK ali SP600125 zaviralcem JNK (slika 3A). Prejšnje študije so pokazale, da je IKK bistveni kinaze potreben za NF-kappaB signalizacijo; zato je ta rezultat navedeno odločilno vlogo NF-kappaB signalizacijo v regulaciji miR-425 transkripciji ob indukcijo IL-1β. Slika 3 aktiviranje IKK je za indukcijo miR-425, kot odgovor na indukcijo IL-1β potrebno. (A) AGS Celice smo obdelali z IL-1β v prisotnosti IKK zaviralca TPCA-1, inhibitorja BIX02188 na p38 MAPK in SP600125 zaviralcev JNK. Zrel miR-425 ekspresijo v 12 urah po obdelavi je kvantificiramo s PCR v realnem času. Pokrovček sprememba relativne miR-425 izražanja (miR-425 /U6) je normalizirana kot pri PBS-obdelanih celic. (B) Izraz primarne miR-425 (pri-miR-425) smo analizirali s PCR v realnem času, kot v A. (c) raven izražanja NF-kappaB beljakovin in pri-miR-425 so bili analizirani v realnem PCR v realnem času v AGS celicah tretiranih z siRNAs za NF-kappaB. (D) AGS celice so bili zdravljeni z zaviralci kemije ali siRNAs za NF-kappaB. Celični lizati Dobimo 24 ur po IL-1β zdravljenje in immunoblotted z PTEN protiteles. (E) Western analizo blot fosforiliranega NF-kappaB p65 (serinske 536). (F) Ravni izraz za NF-kappaB beljakovin in pri-miR-425 smo analizirali s PCR v realnem času v NCI-N87 celic, ki so se zdravili z siRNAs za NF-kappaB. (* P 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001).
Dosledno je bila indukcija pri-miR-425 na IL-1β zdravljenje izredno zaviral v prisotnosti inhibitorja IKK ali siRNAs za NF-kappaB (slika 3B in C). Opazili smo tudi, da je bil IL-1β inducirane PTEN zatiranje oslabljen v prisotnosti inhibitorja IKK ali siRNAs za NF-kappaB (Slika 3D). Da bi ugotovili, ali je NF-kappaB dejavnost prisotna v AGS celicah, obdelanih z IL-1β, smo uporabili Western Blot za določitev stopnje fosforiliranega NF-kappaB p65 (serin 536). Nivo fosforiliranega NF-kappaB p65 (serinske 536) je bila visoka AGS celicah obdelanih z IL-1β (10 ng /ml; 24 ur) (Slika 3E). Poleg tega, utišanje NF-kappaB zaviral miR-425 izraz v NCI-N87 celic brez IL-1β zdravljenja (Slika 3F). Ti rezultati, ki kažejo, da je IKK odvisna od aktivacije NF-kappaB zdravljenjem IL-1β je potrebna za PTEN downregulation, najverjetneje prek izboljšanje miR-425 prepisu.
Želite ugotoviti, ali NF-kappaB neposredno ureja miR-425 transkripcijo smo analizirali gorvodno sekvence miR-425, ki uporabljajo knjižnico WeightMatrix (matrixTFP60.lib) in določila tri možne NF-kappaB veznih mest v promotorja regiji miR-425 (cut-off: matrika podobnosti = 0,9 in jedro podobnosti = 0,95) ( slika 4A). Izvedli smo kromatin imunoprecipitacije (čip), teste z AGS rakave celice z uporabo monoklonskih anti-NF-kappaB protitelesa. Kot je prikazano na sliki 4B, samo primer, B miR-425 proizvaja močne PCR izdelke, ki kažejo, da NF-kappaB protein tvori komplekse z B vezavno mesto na promotor miR-425. Rezultati luciferaza reporterskih testov kažejo, da je potrebno potencial B vezavno mesto na promotor miR-425 za transaktivacije gena nadaljnjega ob IL-1β indukcijo (slika 4A in C). Slika 4 NF-kappaB veznih mest na promotor miR-425. (A) Značilnosti miR-425 5 'robna DNA. promoter regije človekovih Mir-425 vsebuje tri domnevna vezavna mesta za NF-kappaB. (B) Chip testi z anti-NF-kappaB protiteles pokazala vezavo NF-kappaB na promotor miR-425 v AGS celicah. Relativne zasedenost od NF-kappaB so označeni kot vertikalne palice. V bar grafi prikazujejo povprečje treh neodvisnih čip poskusih. (C) Predlagatelj miR-425 je bil aktiviran s NF-kappaB. AGS celice so bili zdravljeni z NF-kappaB in transfektirali z navedenimi vektorji Luc.
Indukcija miR-425 pospešuje celično preživetje ob IL-1β indukcijo
Izkazalo se je, da je PTEN med najpogosteje inaktivirana zaviralnih genov. Čezmerno PTEN v različnih tkivne kulture sesalskih celicah vpliva na različne procese, vključno s celično proliferacijo, celično smrt in celične migracije [16]. Prav Ugotovili smo, da inhibira PTEN zmanjšala aktivacije kaspaze-3 v celicah, obdelanih z IL-1β (slika 5A). To je verjetno, da miR-425 indukcija lahko zavira apoptozo preko downregulation za PTEN v IL-1β obdelano celic. Dejansko čezmernim miR-425 blokiranem aktivacija kaspaze-3 v AGS celic cisplatin obdelan (slika 5B). Poleg tega, je za cisplatin obdelamo AGS celic, kotransfekcijo iz konstrukta, ki vsebuje le PTEN kodirni regiji (PTEN-CD), ki je neobčutljiv za miR-425, izognilo antiapoptotic učinek miR-425 prekomerno (slika 5C). V skladu s tem transfekciji anti-miR-425 v AGS celic znatno povečala kaspaze-3 aktivacijo in apoptozo v odgovor na IL-1β zdravljenja (Slika 5D). Poleg tega transfekciji anti-miR-425 v NCI-N87 celic znatno povečala kaspaze-3 aktivacijo in apoptozo brez IL-1β stimulacije (slika 5E). Slika 5 miR-425 inhibira apoptozo celic, ki jih zatira PTEN. (A). AGS celice so bili zdravljeni s kontrolo (PBS) ali IL-1β. Po 48 urah smo immunoblotted cele lizate celic. (B). AGS celice so bile prehodno transfekciji s negativne kontrole (miR-NC) ali miR-425 sam. Po 24 urah smo celice obdelali s cisplatinom in nabrani 24 ur po obdelavi. Cela lizati celic so immunoblotted. (C). AGS Celice so transfekciji s pokoj-NC, MIR-425, in PTEN-CDS, kot je navedeno. Po 24 urah smo celice obdelali s cisplatinom in nabrani 24 ur po obdelavi. Stopnja celično apoptozo smo določili s pomočjo pretočne citometrije metodo. (D). AGS celice smo transfektirali z miR-NC ali anti-miR-425. Po 48 urah smo celice obdelali z IL-1β in nabrani 24 ur po obdelavi. Skupne lizate celic smo immunoblotted z označenimi protitelesi, stopnja apoptoza celic smo določili s pomočjo pretočne citometrije metodo. (E) po NCI-N87 celice smo transfektirali z miR-NC ali anti-miR-425. Skupaj lizati celic so immunoblotted z označenimi protitelesi, in stopnja apoptoza celic je bila določena s pomočjo pretočne citometrije.
Skladno s svojo vlogo pri zaviranju aktivacijo kaspazo, uravnavanjem miR-425 bistveno okrepljeno širjenje AGS celic, medtem ko je pro- učinek preživetje je bila popolnoma blokirana, ki jih so-transfekciji z eksogeno PTEN (PTEN-CDS) (slika 6A). Anti-miR-425 je zmanjšal delež razraščajo celic za NCI-N87 celic (slika 6b). Prav tako smo ugotovili, da je imel za zaviranje PTEN zaščitni učinek podoben kot pri celicah s prekomerno ekspresijo MIR-425 (slika 6c), kar kaže, da PTEN represijo lahko igrajo pomembno vlogo pri miR-425-odvisne zaščito v celicah, ki so se zdravili z IL-1β. Slika 6 miR-425 pospešuje celično proliferacijo jih zatira PTEN. (A) AGS celice so bili zdravljeni s PBS, IL-1β, MIR-NC, MIR-425, in PTEN-CDS, kot je navedeno. Po 72 urah je bila proliferacijo celic določimo z uporabo kompleta za označevanje edu. (B) po NCI-N87 celice smo transfektirali z miR-NC ali anti-miR-425. Po 72 urah je bila stopnja celično proliferacijo določimo z uporabo kompleta za označevanje ESD. (C) AGS celice so zdravili z siRNA-PTEN ali miR-425. Po 72 urah je bila proliferacijo celic določimo z uporabo kompleta za označevanje edu. (D) Fotografije PTEN beljakovin izražanja v tumorskih tkivih (zgornje plošče) ter tumorjev (spodnje plošče). (E) Graf prikazuje težo 3 tumorjev po 4 tednih (n = 3). (F) Pomemben inverzna korelacija so opazili med ravnmi izražanja MIR-425 in PTEN v želodčnih tkivih rakom (n = 52). (G) so ekspresijski nivoji PTEN so določeni v šestih normalnih želodčni sluznici celic in želodčnega raka celičnih linijah z uporabo PCR v realnem času. (H) model ponazarja domnevni vlogi IL-1β in miR-425 v nadzorom PTEN poti v človeških želodčnega karcinoma celic.
Preučevali smo vpliv miR-425 na tumorjev in vivo. Tumorji se zdravijo z anti-pokoj-425 je pokazala zviša raven PTEN proteina (slika 6d). Tudi anti-miR-425 zmanjša teža tumorja od miši v primerjavi z miR-NC-zdravljeni skupini (slika 6E). Uporaba ne-parametrične teste, smo našli veliko inverzno povezavo med PTEN mRNA in miR-425 izražanja v želodcu vzorcih raka (Slika 6F). Je ekspresijski nivoji PTEN smo določili tudi pri šestih normalnih želodčni sluznici celic in želodčnega raka celičnih linijah z uporabo PCR v realnem času. Kot je razvidno, celic z "down-urejeno» MIR-425 imajo večje količine PTEN primerjavi z celičnih linij z "up-reguliranih» MIR-425 ravni (Slika 6g). Na koncu so naši rezultati dokazali, da ima miR-425 vzročno vlogo s ciljanjem PTEN v želodcu raka.
Razprava
interlevkin-1 (IL-1) je glavni pro-vnetnih citokinov, ki se proizvaja maligni ali microenvironmental celice [17]. IL-1 deluje tudi kot pleiotropski citokinov, vključenih v tumorigeneze in tumorja invazivnosti; Zato predstavlja izvedljivo kandidata za modulatorni citokinov, ki lahko nagibanje ravnovesje med vnetja in imunitete proti indukcijo protitumornih odgovorov [18]. IL-1α in IL-1β so glavni agonisti IL-1. V svojih izločajo oblikah, IL-1 a in IL-1β vežejo na iste receptorje in povzročijo enake biološke funkcije [19]. Vendar, IL-1α in IL-1β razlikujejo v svoji kompartmentalizacije znotraj celice ali mikrookolju [20]. IL-1β je aktivna samo v svoji izločajo obliki in posreduje vnetje, ki spodbuja rakotvornosti tumorja invazivnosti in imunosupresivno [21]. Nekatere nove anti-IL-1β agenti so bili uporabljeni v kliničnih preskušanjih pri bolnikih, ki kažejo različne bolezni z vnetnimi manifestacije [22]. Boljše razumevanje integrativne vloge IL-1β signalnih poti v malignega procesa bo omogočila uporabo novih IL-1β modulacije pristopov pri bolnikih z rakom.
PTEN je bila odkrita kot pomemben zaviralnih, ki je pogosto mutirani ali izgubil v različne vrste raka [23]. Precej podatkov, so poudarili PTEN kot lipidne fosfataze, ki hidrolizira 3 'fosfat v phosphoinositides [24]. PTEN lahko tudi regulirati aktivnost serinske /treonin kinazo AKT /PKB in torej lahko vplivajo na preživetje celic signalnih [25]. UV izpostavljenost lahko sproži PTEN interakcijo z divjim tipom variante receptorjev melanokortin-1, ki ščiti PTEN iz WWP2 posredovano degradacijo, ki vodi do AKT inaktivacijo v melanoma [26]. Obstaja več mehanizmov za urejanje PTEN, vključno s transkripcijo, mRNA stabilnosti, microRNA ciljanje prevajanje in stabilnost proteinov. PTEN je transkripcijsko zatrejo promotorja metilacije v želodcu raka [27]. PTEN lahko tudi post-translacijsko ureja acetiliranjem, ubiquitylation, oksidacija, fosforilacije in subcelično lokalizacijo [28]. Kljub obsežnim karakterizacijo PTEN mutacij pri človeških rakih in relativno dobro razumevanje molekularnih vloge PTEN v kontrolo celične procese, je malo znanega o načinih regulacije PTEN.
PTEN lahko zaviral rakavih celic po indukciji izmed pro-vnetnih citokinov IL-1β [29]. Stimulacija z IL-1β aktivira NF-kappaB s fosforilacijo in degradacije IκB. Ta aktivacija omogoča NF-kappaB da translocira v jedro in transkripcijsko aktivirati ciljnih genov [30]. NF-kappaB je heterodimerni transkripcija aktivator sestavljen iz DNA vezave podenoto P50 in transaktivacije podenote p65 je [31]. Vsi avtorji prebrali in potrdil končni rokopis.

• Vpliv IL17A polimorfizmov na odklonskega metitiranjem DAPK in CDH1 v ne-rakasto želodčne sluznice
• Nenavadna trichobezoar želodca in črevesja: prikaz primera