NF-kB-dipendente MicroRNA-425 upregulation promuove la crescita cellulare del cancro gastrico di mira PTEN su IL-1β induction

NF-kB-dipendente MicroRNA-425 upregulation promuove la crescita cellulare del cancro gastrico di mira PTEN su induzione di IL-1β
Abstract
sovraespressione della citochina proinfiammatoria iL-1β è associata a diverse malattie, compreso il cancro. Alterazione dei microRNA è stata osservata nelle cellule tumorali esposte a citochine pro-infiammatorie, ma la loro funzione dello stress infiammazione rimane elusiva. Qui, dimostriamo che l'IL-1β induce l'up-regolazione di miR-425, che regola negativamente fosfatasi e tensina espressione omologo di mira il suo 3 'UTR. Un aumento di miR-425 dipende da IL-1β indotta attivazione di NF-kB, che migliora miR-425 trascrizione genica su induzione di IL-1β. Di conseguenza, la repressione di fosfatasi e tensina omologo da miR-425 promuove la proliferazione delle cellule del cancro gastrico, che è necessario per proteggere le cellule da apoptosi indotta da cisplatino. Nel loro insieme, i nostri dati supportano un ruolo critico per la sovraregolazione di NF-kB-dipendente di miR-425, che rappresenta un nuovo percorso per la repressione di attivazione di fosfatasi e tensina omologo e la promozione della sopravvivenza cellulare su di induzione di IL-1β.
parole
iL-1β NF-kB miR-425 PTEN cancro gastrico Sfondo
adenocarcinoma gastrico è il quarto e il quinto tumore più comune tra i maschi e le femmine, rispettivamente, in tutto il mondo ed è fortemente legata a infiammazione cronica [1]. E 'ormai ben accettato che l'infezione da Helicobacter pylori
(H. pylori
) svolge un ruolo importante nello scatenare l'infiammazione cronica che porta alla malignità [2]. L'infiammazione cronica dello stomaco inizia la progressione istopatologica di gastrite cronica di atrofia gastrica, metaplasia intestinale e cancro gastrico, infine, [3]. Mentre H. pylori
infezione è estremamente diffusa, solo una piccola minoranza (circa 1%) degli individui infetti si svilupperà il cancro gastrico dopo molti anni. La risposta variabile per questo patogeno comune sembra essere governato da una predisposizione genetica a livelli elevati di espressione di citochine proinfiammatorie [4].
Il fattore nucleare kappa B (NF-kB) percorso è stato a lungo considerato un importante percorso di segnalazione proinfiammatorie, largamente basata sull'attivazione di NF-kB da citochine proinfiammatorie e il ruolo di NF-kB nell'attivazione trascrizionale di geni responsivi comprese citochine e chemochine [5]. La via "canonica" per l'attivazione di NF-kB viene attivato da citochine proinfiammatorie quali IL-1β e solitamente porta all'attivazione del rapporto o complessi cRel contenenti [6]. NF-kB esiste nel citoplasma in forma inattiva associata con proteine ​​regolatrici denominati inibitori della kB (IκB), di cui il più importante potrebbe essere IκBα, IκBβ e IκBε. IκBα è associata transitoria attivazione di NF-kB, che IκBβ è coinvolto nell'attivazione sostenuta [7]. Tuttavia, l'infiammazione cronica è un processo fisiologico complesso, e il ruolo di NF-kB nella risposta infiammatoria non è ancora stata completamente esplorata.
Oltre a condizionare l'espressione genica codificante, stress infiammazione cambia anche il livello di espressione dei microRNA (miRNA) [8]. MicroRNAs sono una classe di endogena, piccolo, non codificante RNA che regolano negativamente l'espressione genica a livello post-trascrizionale principalmente tramite legame regione non tradotta 3 'di un mRNA bersaglio, e hanno importanti funzioni di regolamentazione nel controllo di diverse fisiologica e processi patologici [9, 10]. Questi RNA hanno dimostrato di essere coinvolto nella regolazione di molti processi cellulari tra cui la proliferazione, la differenziazione e l'apoptosi [11-13]. Tuttavia, se l'infiammazione cronica regola l'espressione dei miRNA modulando la trascrizione del gene o alterare la maturazione post-trascrizionale non è stata determinata.
In questo lavoro, abbiamo scoperto che miR-425 di induzione su infiammazione IL-1β-indotta era dipendente l'attivazione di NF-kB, che ha migliorato miR-425 la trascrizione del gene. Inoltre, il upregulated miR-425 direttamente mirato fosfatasi e tensina omologo (PTEN) e regolata negativamente la sua espressione, che ha promosso la sopravvivenza delle cellule su di induzione di IL-1β. Procedure sperimentali

dichiarazione etica
Tutti i campioni sono stati ottenuti da i pazienti che hanno subito un intervento chirurgico presso la Fudan University di Shanghai Cancer center. Il protocollo è stato approvato dal Comitato Etico Clinical Research di Fudan University, e la ricerca è stata effettuata secondo le disposizioni della Dichiarazione di Helsinki del 1975. tessuti normali adiacenti sono stati asportati dalla lesione cancro gastrico macroscopicamente, e la loro diagnosi istologica è stata confermata al microscopio. consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i partecipanti coinvolti nello studio.
coltura delle cellule e reagenti
La linea cellulare embrionale rene umano HEK293 (ATCC® CRL-1573 ™), il seno umano linea di cellule di cancro MDA-MB361 (ATCC ® HTB-27 ™), la linea di cellule gastriche adenocarcinoma umano AGS (ATCC® CRL-1739 ™), SNU-1 (ATCC® CRL-5971 ™), SNU-5 (ATCC® CRL-5973 ™), SNU-16 (ATCC® CRL-5974 ™), Hs746T (ATCC® HTB-135 ™), NCI-N87 (ATCC® CRL-5822 ™), e Kato III (ATCC®HTB-103 ™) sono state mantenute in DMEM contenente il 10% del feto siero bovino. Tutte le linee cellulari sono state mantenute in mezzi contenenti penicillina (100 UI /ml) e streptomicina (100 mg /ml) a 37 ° C con 5% di CO 2. Le imita miRNA e anti-miRNA sono stati acquistati da Ambion (Austin, TX, USA). L'inibitore IKK TPCA-1 (Cat. No. S2824), il BIX02188 inibitore p38 MAPK (Cat. No. S1574) e il SP600125 inibitore di JNK (Cat. No. S1460) sono stati acquistati da Selleckchem (Houston, TX, USA). Ricombinanti IL-1β umani sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (cat. N H6291, Shanghai, Cina).
Estrazione di RNA e real-time PCR
RNA totale è stato estratto dalle cellule utilizzando TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA ). Per l'analisi microRNA, poli code (A) sono stati aggiunti a RNA totale utilizzando poli (A) polimerasi (Ambion, Carlsbad, CA) prima trascrizione inversa. Il kit di rilevamento MiRcute miRNA qPCR (TIANGEN, Pechino, Cina) è stato utilizzato per quantificare i livelli di espressione di miR-425 maturo secondo il protocollo previsto, e GAPDH è stato utilizzato come controllo interno. Real-time PCR è stata eseguita nelle seguenti condizioni: 95 ° C 10 m, 1 ciclo; 95 ° C 10 s, 55 ° C 34 s, 40 cicli. Compra di tutti i risultati ottenuti dal real-time PCR metodi, abbiamo usato il delta metodo di CT delta per calcolare la variazione volte in espressione genica tra i diversi gruppi. La quantità di bersaglio (PTEN /miR-425), normalizzata alla endogena GAPDH gene housekeeping e relativa ad un campione di riferimento, è dato dalla seguente equazione:. Quantità di target = 2 - △△ CT
immunocolorazione
proteine ​​sono state separate su un gel SDS-PAGE 10% e successivamente trasferiti ad una membrana PVDF. Dopo aver bloccato con il 5% di latte scremato, la membrana è stata incubata con un mouse anticorpo monoclonale anti-PTEN (1: 500, Santa Cruz, SC-7974) e una fosfo anticorpi NF-kB p65 (pS536) (RELA) (1: 10000 ., Epitomics, Cat #: 2220-1). IRdye-etichettati anticorpi secondari sono stati utilizzati per la quantificazione del segnale immunoblotting, ei segnali sono stati analizzati utilizzando uno scanner Odyssey (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA).
Saggio luciferasi
cellule HEK293 e cellule AGS erano trasfettate con miR-425 e pGL3 giornalista luciferasi costruisce ospitare la sequenza bersaglio miR-425. Dopo 24 ore, le attività di luciferasi di lucciola e renilla luciferasi nei lisati cellulari sono stati misurati con il Dual-luciferasi Assay System (Promega, Madison, WI, USA). Per il saggio giornalista trascrizione della luciferasi, miR-425 sequenze del gene promotore (WT o soppressi sito) sono stati clonati nella regione promotrice del vettore pGL3-base, e l'attività della luciferasi è stata misurata come descritto sopra.
Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP)
brevemente, le cellule trattate erano reticolato con 1% di formaldeide, tranciato ad una dimensione media di 400 bp, e successivamente immunoprecipitati con anticorpi contro NF-kB (Santa Cruz, sc-166588). I primer ChIP-PCR sono stati progettati per amplificare le regioni promotrici contenenti putativi siti di legame di NF-kB all'interno di miR-425, come illustrato. Un anticorpo positivo di controllo (RNA polimerasi II) e un controllo negativo non immune IgG sono stati usati per dimostrare l'efficacia del kit reagenti (Epigentek Group Inc, P-2025-48). DNA immunoprecipitato viene pulito, rilasciato, e eluito. Eluito DNA può essere utilizzato per applicazioni a valle ChIP-PCR. arricchimento Fold (FE) è stato calcolato utilizzando un rapporto di efficienza di amplificazione del campione ChIP su quello del non-immuni IgG. efficienza di amplificazione di RNA polimerasi II è stato utilizzato come controllo positivo. FE% = 2 (IgG CT - CT campione). × 100%
proliferazione cellulare saggio
Un saggio di proliferazione cellulare è stata effettuata utilizzando il cellulare Kit-8 di conteggio (Dojindo, Kumamoto, Giappone) secondo il le istruzioni del produttore. Prima l'aggiunta di CCK-8, le cellule sono state lavate con terreni di coltura caldo facendo girare la piastra a 500 rpm per 3 metri e poi scartare il surnatante.
Saggio cellulare apoptosi
Le cellule tumorali sono state raccolte e risospese in 500 microlitri di tampone di legame. La sospensione cellulare (100 ml) è stato incubato con 5 microlitri annessina-V e propidio ioduro a temperatura ambiente per 20 minuti. Le cellule colorate sono state analizzate con cella a fluorescenza-attivato (FACS) utilizzando flusso BD LSR II citometria.
Ciclo cellulare analisi
Per la citometria a flusso, le cellule sono state tripsinizzate e fissati in etanolo al 70% durante la notte. Le cellule sono state poi incubate in 0,5 ml di soluzione di ioduro di propidio contenente 25 ug ml -1 RNasi per 15 minuti a 37 ° C e misurata.
Esperimenti mouse
Le cellule NCI-N87 (3 × 10 6) sono stati iniettati nei giusti fianchi di topi nu /nu atimici. Una settimana dopo le iniezioni, i topi con tumori di dimensioni analoghe sono stati trattati per 4 settimane con anti-miR-425. L'anti-miR-425 (2 nmol) sono state iniettate direttamente nei tumori due volte alla settimana per 4 settimane. Analisi statistica

I risultati sono presentati come media ± SEM, ed i dati sono stati analizzati con il test t di Student. Un valore di p
< 0.05 è stato
considerato statisticamente significativo. Risultati
trattamento IL-1β induce miR-425 espressione
per caratterizzare le miRNA responsabili per IL-1β induzione, abbiamo profilato miRNA nelle cellule AGS PBS-trattati e IL-1β cellule AGS -indotta utilizzando il sistema Array Exiqon miRCURY ™ LNA (v.14.0). I livelli di miRNA differivano notevolmente tra il gruppo PBS trattato ed il gruppo di IL-1β-indotta, come illustrato nella mappa di calore mostrato in figura 1A. Tra i 1.891 sonde di cattura, 46 miRNA sono stati differenzialmente espressi nelle cellule AGS IL-1b-indotta rispetto alle cellule AGS PBS-trattati appaiati; di questi miRNA, 29 sono stati aumentati e 17 sono stati diminuita nelle cellule AGS IL-1b-indotta (Tabella 1), che indica che un modello miRNA specifico è associato con l'induzione di IL-1β. Figura 1 Dysregulation dei miRNA in cellule AGS umane trattate con IL-1β. (A) cellule AGS umana sono stati trattati con IL-1β (10 ng /ml) [14], e 24 ore più tardi, il profilo di espressione dei miRNA sono stati analizzati con la tecnologia microarray. Schema mappa di calore generato da analisi di clustering non supervisionato con 46 miRNA significativamente disregolato. Il colore rosso indica upregulation; verde indica downregulation. (B) L'aumento dei livelli di miR-425 in 36 campioni di tumore rispetto ai loro livelli nei tessuti normali adiacenti appaiati come misurato mediante real-time PCR. Normale: tessuti normali adiacenti. (C) livello di espressione di miR-425 è stata esaminata mediante real-time PCR in più linee di cellule di cancro gastrico e sei normali cellule della mucosa gastrica.
Tabella 1 disregolazione significativa dei miRNA
sovraespresso in cellule indotte-AGS IL-1b
miRNA
Piegare cambiamento
valore
p
HSA-miR-425
12.36
0.00
hsa-miR-584
11.03
0.01
hsa-miR-31
8.12
0.00
hsa-miR-155
6.22
0.00
hsa-let-7i
5.55
0.00
hsa-miR-21
5.11
0.00
hsa-miR-335
4.89
0.01
hsa-miR-191
4.73
0.03
hsa-miR-519d
4.37
0.02
hsa-miR-520d-5p
3,95
0.00
hsa-miR-331
3.67
0.01
hsa-miR-142
3.45
0.01
hsa-miR-518a-5p
3.28
0.01
hsa-miRPlus-F1231
3.11
0.01
hsa-miR-2113
2.94
0.02
hsa-miR-196a*
2.88
0.02
hsa-miR-1304
2.78
0.02
hsa-miR-185
2.65
0.01
hsa-let-7a
2.61
0.00
hsa-miR-130
2.52
0.02
hsa-miR-1280
2.50
0.01
hsa-miR-222
2.47
0.01
hsa-let-7c
2.43
0.00
hsa-miR-602
2.31
0.00
hsa-miR-548e
2.31
0.03
hsa-miR-32
2.27
0.04
hsa-miR-181a
2.24
0.02
hsa-miR-7
2.13
0.00
hsa-miR-21*
2.06
0.00
Underexpressed in IL-1b cellule indotte-AGS
miRNA
Fold cambiamento
valore di p
hsa-miR-143
0.06
0.02
hsa-miR-200
0.08
0.01
hsa-miR-451
0.13
0.01
hsa-miR-144
0.17
0.00
hsa-miR-363
0.20
0.01
hsa-miR-637
0.25
0.03
hsa-miR-153
0.39
0.01
hsa-miR-139
0.39
0.00
hsa-miR-617
0.42
0.01
hsa-miR-1915
0.43
0.00
hsa-miRPlus-F1153
0.45
0.00
hsa-miR-381
0.46
0.00
hsa-miR-145
0.47
0.02
hsa-miR-659
0.47
0.03
hsa-miR-125b
0.48
0.00
hsa-miR-183*
0.49
0.00
hsa-miR-638
0.49
0.01
*: Quando due miRNA maturi provengono da armi opposti della stessa pre-miRNA, un asterisco dopo il nome indica un miRNA espresso a bassi livelli rispetto al miRNA nel braccio opposto di un tornante
Tra questi miRNA, retrovisori. 425 è stato il più altamente upregulated su di induzione di iL-1β. Utilizzando real-time PCR, abbiamo analizzato l'espressione di miR-425 in 36 campioni accoppiati (tumore ei tessuti normali adiacenti dello stesso paziente). Abbiamo trovato un livello significativamente più alto di espressione di miR-425 nei campioni di tumore rispetto ai livelli nei tessuti normali adiacenti (p
< 0,0001) (Figura 1B). Abbiamo esaminato il livello di espressione di miR-425 in una serie di linee di cellule di cancro gastrico e sei normali cellule della mucosa gastrica. Come mostrato in Figura 1C, abbiamo raccolto le cellule AGS con down-regolato le cellule NCI-N87 con up-regolata miR-425 per un ulteriore studio miR-425 e. Anche se l'attivazione di miR-425 è stato segnalato per avere un impatto fondamentale sulla iniziazione cancro e nella progressione delle cellule tumorali, riducendo l'espressione di una vasta rete di geni [15], il ruolo di miR-425 in tumori umani non è stato chiarito . . Abbiamo scelto pertanto miR-425 per ulteriori indagini
espressione di PTEN è regolata negativamente da miR-425
Per identificare i target di miR-425, abbiamo impiegato un algoritmo comunemente usato, miRecords (http: //mirecords . biolead. org /), che è una risorsa integrata per animali interazioni miRNA bersaglio. Per aumentare la precisione di questa previsione, i geni che sono stati previsti da almeno cinque dei database undici (Diana, microinspector, miranda, mirtarget2, mitarget, nbmirtar, PicTar, pita, rna22, rnahybrid e TargetScan) sono stati scelti come bersagli putativi. Tra questi obiettivi putativi di miR-425, l'analisi del gene ontologia ha rivelato che i livelli di espressione di 9 geni candidati sono stati modificati; pertanto, questa alterazione potrebbe contribuire al fenotipo maligno. Utilizzando 3 'UTR saggi di luciferasi, abbiamo scoperto che l'iperespressione di miR-425 attività luciferasi inibito significativamente in cellule HEK293 e cellule AGS che esprimono il tipo selvaggio PTEN 3' UTR giornalista (Figura 2A). Abbiamo confermato che PTEN è un bersaglio diretto putativo di miR-425. Per illustrare la specificità di miR-425, abbiamo dimostrato che l'anti-miR-425 in particolare ha abolito l'inibizione dell'attività della luciferasi indotta da miR-425 in cellule HEK293 e cellule NCI-N87 (Figura 2b). Le mutazioni nei siti di legame miRNA (Figura 2C) resi i costrutti che non rispondono ai miR-425 di induzione (Figura 2D), inoltre conferma che il gene PTEN è un bersaglio diretto di miR-425. Figura 2 miR-425 si rivolge direttamente PTEN. (A) saggio reporter in cellule HEK293 e cellule AGS trasfettate con miR-425 e costrutti che portano cDNA luciferasi fusa alle 'UTR di obiettivi candidati previsti 3 (media ± SEM). (B) Effetti di anti-miR-425 sull'attività della luciferasi di costrutti luciferasi fuse con i 'UTR di PTEN nelle cellule HEK293 e cellule NCI-N87 3 (media ± SEM). (C, D) saggio Reporter in cellule HEK293 e cellule AGS trasfettate con costrutti luciferasi che trasportano PTEN 3 'UTR con mutazioni nei siti miR-425 vincolanti (media ± SEM). (E) HEK293 cellule e cellule AGS sono state transfettate con un costrutto luciferasi che trasporta il tipo di PTEN selvaggio 3 'UTR (LUC-WT) o un costrutto che porta un PTEN mutato 3' UTR (LUC-Mut). Dopo 24 h, le cellule sono state trattate con IL-1β, e l'attività della luciferasi è stata quantificata 24 ore dopo il trattamento. (F) Western Blot e RT-PCR che mostra i livelli di proteina PTEN e livelli di mRNA nelle cellule AGS dopo 48 ore di miR-425 trasfezione. (G), le cellule sono state trasfettate con AGS anti-miR-425, e 24 ore dopo, le cellule erano o sinistra non trattati o trattati con IL-1β e successivamente raccolte 24 ore dopo il trattamento. lisati cellulari interi sono stati immunoblotted con anticorpi PTEN. cellule (H) NCI-N87 sono state trasfettate con anti-miR-425 e raccolte 24 ore dopo il trattamento. lisati cellulari interi sono stati immunoblotted con anticorpi PTEN. (I), le cellule AGS sono state trasfettate con un plasmide che trasporta solo la sequenza di lettura della struttura aperta di PTEN (PTEN-CDS). Dopo 24 h, le cellule sono state trattate con IL-1β o miR-425. lisati cellulari interi sono stati sottoposti a immunoblotting dopo 24 ore di trattamento. (* P < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001)
Inoltre, la mutazione del miR-425 sequenza bersaglio significativamente attenuato IL-1β-indotta repressione dei UTR PTEN 3 '. attività di giornalista luciferasi in cellule HEK293 e cellule AGS (Figura 2E). Sovraespressione di miR-425 è stato sufficiente a downregulate PTEN espressione sia a proteine ​​e livelli di mRNA nelle cellule AGS (Figura 2F). Di conseguenza, la repressione PTEN IL-1β-indotta è stato salvato esprimendo anti-miR-425 in cellule AGS (Figura 2G). Anti-miR-425 è stato in grado di up-regolare l'espressione di PTEN nelle cellule NCI-N87 senza stimolazione IL-1β (Figura 2H).
I nostri dati hanno anche indicato che il 3 'UTR è necessario per downregulation PTEN miR-425-mediata perché espressione di un PTEN regione codificante costrutto (PTEN-CDS) è stato insensibile a miR-425 sovraespressione e l'induzione di IL-1β nelle cellule AGS (Figura 2i). Presi insieme, questi risultati indicano che miR-425 gioca un ruolo critico nel reprimere l'espressione di PTEN prendendo di mira il suo 3 'UTR su induzione di IL-1β.
IL-1β indotta attivazione di NF-kB è necessario per miR-425 di induzione
Per determinare il meccanismo coinvolto nella miR-425 transattivazione su induzione di iL-1β, abbiamo esaminato l'impatto di vari inibitori delle chinasi sul miR-425 di induzione nelle cellule AGS iL-1β-trattati. IL-1β-indotta miR-425 upregulation era significativamente inibito dalla inibitore IKK TPCA-1, ma non dal inibitore BIX02188 p38 MAPK o SP600125 inibitore di JNK (Figura 3A). Studi precedenti hanno dimostrato che IKK è una chinasi essenziale richiesto per la segnalazione NF-kB; Pertanto, questo risultato ha indicato il ruolo critico di segnalazione NF-kB nella regolazione del miR-425 trascrizione su induzione di IL-1β. Figura 3 IKK è richiesta per l'induzione di miR-425 in risposta ad induzione di IL-1β. (A) cellule AGS sono state trattate con IL-1β in presenza dell'inibitore IKK TPCA-1, l'inibitore BIX02188 p38 MAPK e SP600125 inibitore JNK. Coppia miR-425 espressione a 12 ore dopo il trattamento è stato quantificato mediante real-time PCR. La variazione piega della relativa miR-425 espressione (miR-425 /U6) è stata normalizzata a quella osservata in cellule PBS-trattati. (B) L'espressione di primaria miR-425 (PRI-miR-425) è stata analizzata mediante real-time PCR come in A. (C) I livelli di espressione di NF-kB proteine ​​e pri-miR-425 sono stati analizzati mediante real time PCR in cellule AGS trattati con siRNA per NF-kB. (D), le cellule AGS sono stati trattati con inibitori chimici o siRNA per NF-kB. I lisati cellulari sono stati ottenuti 24 ore dopo la IL-1β trattamento e immunoblotted con anticorpi PTEN. (E) Analisi Western Blot di fosforilata p65 NF-kB (serina 536). (F) I livelli di espressione di NF-kB proteine ​​e pri-miR-425 sono stati analizzati mediante PCR in tempo reale nelle cellule NCI-N87 trattati con siRNA per NF-kB. (* P < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001).
Coerentemente, l'induzione di pri-miR-425 in seguito al trattamento di IL-1β era notevolmente inibita in presenza dell'inibitore IKK o siRNAs per NF-kB (Figura 3B e C). Abbiamo anche osservato che IL-1β-indotta repressione PTEN è stata attenuata in presenza dell'inibitore IKK o siRNAs per NF-kB (Figura 3D). Per determinare se l'attività di NF-kB è presente nelle cellule AGS trattate con IL-1β, abbiamo usato un Western Blot per determinare il livello di fosforilata p65 NF-kB (serina 536). Il livello di fosforilazione p65 NF-kB (serina 536) era alto in cellule AGS trattate con IL-1b (10 ng /ml; 24 ore) (Figura 3E). Inoltre, il silenziamento di NF-kB ha inibito l'espressione di miR-425 in cellule NCI-N87 senza trattamento IL-1β (Figura 3F). Questi risultati suggeriscono che IKK-dipendenti di NF-kB attivazione in seguito al trattamento di IL-1β è richiesto per PTEN downregulation, molto probabilmente attraverso la sua valorizzazione del miR-425 di trascrizione.
Per determinare se NF-kB regola direttamente miR-425 di trascrizione, abbiamo analizzato le sequenze a monte di miR-425 utilizzando la libreria WeightMatrix (matrixTFP60.lib) e identificato tre potenziali siti di legame di NF-kB nella regione del promotore di miR-425 (cut-off: matrice di similarità = 0,9 e somiglianza di base = 0,95) ( Figura 4A). Abbiamo eseguito immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) test con le cellule tumorali AGS utilizzando anticorpi monoclonali anti-NF-kB. Come mostrato in Figura 4B, solo primer B di miR-425 prodotto forti prodotti PCR, che ha suggerito che la proteina NF-kB complessi formata con il sito di legame B nel promotore miR-425. I risultati dei dosaggi luciferasi suggerito che il potenziale sito di legame B nel promotore miR-425 è richiesto per transattivazione del gene valle dopo induzione di IL-1β (Figura 4A e C). Figura 4 NF-kB siti di legame nel promotore miR-425. (A) Caratteristiche del miR-425 5 'del DNA fiancheggiante. regioni promotrici umani del miR-425 contiene tre siti di legame putativi per NF-kB. saggi (B) chip con anticorpi anti-NF-kB hanno mostrato legame di NF-kB al promotore di miR-425 in cellule AGS. Le occupazioni relative di NF-kB sono indicati come barre verticali. I grafici a barre mostrano le medie dei tre esperimenti ChIP indipendenti. (C) Il promotore di miR-425 è stata attivata da NF-kB. cellule AGS sono stati trattati con NF-kB e trasfettate con i vettori LUC indicati.
induzione del miR-425 promuove la sopravvivenza delle cellule su di induzione di IL-1β
E 'stato dimostrato che PTEN è tra i geni soppressori tumorali più frequenti inattivati. Sovraespressione di PTEN nelle diverse cellule di coltura dei tessuti di mammiferi colpisce vari processi tra cui la proliferazione cellulare, morte cellulare e la migrazione delle cellule [16]. Abbiamo anche trovato che l'inibizione PTEN diminuito l'attivazione della caspasi-3 nelle cellule trattate con IL-1β (Figura 5A). E 'plausibile che miR-425 di induzione può inibire l'apoptosi attraverso la down-regulation di PTEN nelle cellule IL-1b-trattata. In effetti, la sovraespressione di miR-425 inibito caspasi-3 attivazione nelle cellule AGS cisplatino-trattati (Figura 5B). Inoltre, in cellule AGS cisplatino-trattati, cotrasfezione di un costrutto contenente solo la regione codificante PTEN (PTEN-CDS), che è insensibile ai miR-425, bypassato l'effetto antiapoptotica di miR-425 sovraespressione (Figura 5C). Pertanto, trasfezione di anti-miR-425 in cellule AGS significativamente migliorata caspasi-3 attivazione e apoptosi in risposta al trattamento IL-1β (Figura 5D). Inoltre, trasfezione di anti-miR-425 in cellule NCI-N87 significativamente migliorata caspasi-3 attivazione e apoptosi senza stimolazione IL-1β (Figura 5E). Figura 5 miR-425 inibisce l'apoptosi delle cellule reprimendo PTEN. (UN). cellule AGS sono stati trattati con il controllo (PBS) o IL-1β. Dopo 48 h, lisati cellulari intero sono stati immunoblotted. (B). cellule AGS sono state trasfettate con controllo negativo (miR-NC) o miR-425 da solo. Dopo 24 h, le cellule sono state trattate con cisplatino e raccolte 24 ore dopo il trattamento. lisati cellulari interi sono stati immunoblotted. (C). cellule AGS sono state trasfettate con miR-NC, miR-425, e PTEN-CDS come indicato. Dopo 24 h, le cellule sono state trattate con cisplatino e raccolte 24 ore dopo il trattamento. Il tasso di apoptosi delle cellule è stata determinata con il metodo di citometria a flusso. (D). cellule AGS sono state trasfettate con miR-NC o anti-miR-425. Dopo 48 h, le cellule sono state trattate con IL-1β e raccolte 24 ore dopo il trattamento. lisati cellulari totali sono stati immunoblotted con gli anticorpi indicati, e il tasso di apoptosi delle cellule è stato determinato utilizzando il metodo di citometria a flusso. cellule (E) NCI-N87 sono state trasfettate con miR-NC o anti-miR-425. lisati cellulari totali sono stati immunoblotted con gli anticorpi indicati, e il tasso di apoptosi delle cellule è stato determinato utilizzando il metodo di citometria a flusso.
Coerentemente con il suo ruolo nell'inibire l'attivazione delle caspasi, upregulation di miR-425 sostanzialmente migliorato la proliferazione delle cellule AGS, mentre il pro- effetto di sopravvivenza è stato completamente bloccato da co-trasfezione con esogena PTEN (PTEN-CDS) (Figura 6A). Anti-miR-425 è diminuita la percentuale di cellule proliferanti per le cellule NCI-N87 (figura 6b). Abbiamo anche scoperto che inibendo PTEN ha avuto un effetto protettivo simile a quello osservato nelle cellule overexpressing miR-425 (figura 6C), suggerendo che la repressione PTEN può svolgere un ruolo importante nella miR-425-dipendente protezione in cellule trattate con IL-1β. Figura 6 miR-425 promuove la proliferazione cellulare reprimendo PTEN. (A) cellule AGS sono stati trattati con PBS, IL-1β, miR-NC, miR-425, e PTEN-CDS come indicato. Dopo 72 ore, la proliferazione cellulare è stata determinata utilizzando il kit di etichettatura edu. cellule (B) NCI-N87 sono state trasfettate con miR-NC o anti-miR-425. Dopo 72 h, il tasso di proliferazione delle cellule è stato determinato utilizzando il kit di etichettatura edu. (C), le cellule AGS sono stati trattati con siRNA-PTEN o miR-425. Dopo 72 ore, la proliferazione cellulare è stata determinata utilizzando il kit di etichettatura edu. (D) Le fotografie di espressione della proteina PTEN nei tessuti tumorali (pannelli superiori) e tumori (pannelli inferiori). (E) Il grafico mostra il peso dei 3 tumori dopo 4 settimane (n = 3). (F) una correlazione inversa significativa è osservata tra i livelli di espressione miR-425 e PTEN nei tessuti di cancro gastrico (n = 52). (G) I livelli di espressione di PTEN sono determinati in sei normali cellule della mucosa gastrica e linee cellulari di cancro gastrico mediante PCR in tempo reale. (H) Un modello che illustra i ruoli putativi di IL-1β e miR-425 nel controllo del percorso PTEN nelle cellule di carcinoma gastrico umane.
Abbiamo studiato l'effetto di miR-425 sulla tumorigenicità in vivo. I tumori trattati con anti-miR-425 hanno mostrato un aumento dei livelli di proteina PTEN (Figura 6D). Inoltre, anti-miR-425 ha ridotto il peso del tumore dei topi rispetto al gruppo miR-NC-trattate (Figura 6E). Utilizzando test non parametrici, abbiamo trovato una correlazione inversa significativa tra PTEN mRNA e l'espressione di miR-425 nei campioni di cancro gastrico (Figura 6F). I livelli di espressione di PTEN sono stati determinati anche in sei normali cellule della mucosa gastrica e linee cellulari di cancro gastrico mediante PCR in tempo reale. Come si vede, le cellule con "down-regolato" miR-425 hanno una maggiore quantità di PTEN rispetto alle linee cellulari con miR-425 livelli "up-regolati" (figura 6G). In conclusione, i nostri risultati hanno dimostrato che il miR-425 gioca un ruolo causale attraverso mira PTEN nei tumori gastrici.
Discussione
interleuchina-1 (IL-1) è un importante citochina pro-infiammatoria che viene prodotta dal maligno o cellule del microambiente [17]. IL-1 funziona anche come una citochina pleiotropica coinvolti nella tumorigenesi e tumori invasività; Pertanto, esso rappresenta un candidato fattibile per una citochina modulatorio che può inclinare l'equilibrio tra infiammazione e immunità verso l'induzione di risposte antitumorali [18]. IL-1α e IL-1β sono i principali agonisti di IL-1. Nelle loro forme secrete, IL-1α e IL-1β legano agli stessi recettori e di indurre le stesse funzioni biologiche [19]. Tuttavia, IL-1α e IL-1β differiscono nella loro compartimentazione all'interno della cella o il microambiente [20]. IL-1β è attiva solo nella sua forma secreta e media l'infiammazione, che promuove la carcinogenesi, invasività tumorale e immunosoppressione [21]. Alcuni agenti anti-IL-1b romanzo sono stati utilizzati negli studi clinici in pazienti che presentano patologie diverse con manifestazioni infiammatorie [22]. Una migliore comprensione del ruolo integrativo di IL-1β segnalazione percorsi nel processo maligno consentirà l'applicazione di nuovi modulazione IL-1β avvicina in pazienti affetti da cancro.
PTEN è stato scoperto come un importante soppressore del tumore che è spesso mutato o perso in vari tipi di cancro [23]. Diverse linee di prove hanno evidenziato PTEN come fosfatasi lipidica che idrolizza fosfato 3 'in fosfoinositidi [24]. PTEN può anche regolare l'attività della serina /treonina chinasi Akt /PKB e può quindi influenzare la sopravvivenza delle cellule di segnalazione [25]. esposizione ai raggi UV può innescare l'interazione PTEN con wild-type melanocortina-1 varianti del recettore, che protegge dalla degradazione di PTEN WWP2-mediata, con conseguente inattivazione AKT nel melanoma [26]. Ci sono diversi meccanismi per la regolazione di PTEN, tra cui la trascrizione, la stabilità mRNA, microRNA il targeting, la traduzione e la stabilità della proteina. PTEN è trascrizionalmente a tacere da metilazione del promotore nel carcinoma gastrico [27]. PTEN può anche essere post-traduzionali regolato da acetilazione, ubiquitinazione, l'ossidazione, la fosforilazione e localizzazione subcellulare [28]. Nonostante estesa caratterizzazione di mutazioni PTEN nei tumori umani e di una relativamente buona comprensione dei ruoli molecolari di PTEN nel controllo di processi cellulari, poco si sa circa le modalità di regolazione PTEN.
PTEN può essere inibita in cellule tumorali sulla induzione della citochina pro-infiammatoria IL-1β [29]. La stimolazione con IL-1β attiva NF-kB da fosforilazione e la degradazione di IκB. Questa attivazione consente di NF-kB di traslocare nel nucleo e trascrizionalmente attivare geni bersaglio [30]. NF-kB è un attivatore di trascrizione heterodimeric costituito dal legame al DNA p50 subunità e la p65 transattivazione subunità [31]. I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto.
Autori fascicoli presentati originali per
di seguito sono riportati i link ai file originali degli autori presentati per le immagini . Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

• Influenza dei polimorfismi IL17A sulla metilazione aberrante di DAPK e CDH1 nella mucosa gastrica non-cancerosa
• tricobezoario insolito dello stomaco e l'intestino: un caso clinico