NF-kappaB riippuvaisen MicroRNA-425 säätelyä edistää mahalaukun syöpäsolujen kasvua kohdistamalla PTEN upon IL-1β induktio

NF-kappaB riippuvaisen MicroRNA-425 säätelyä edistää mahalaukun syöpäsolujen kasvua kohdistamalla PTEN upon IL-1β induktio
Abstract
yli-ilmentäminen tulehdusta edistäviä sytokiini IL-1β liittyy erilaisia ​​sairauksia, kuten syöpää. Muuttaminen MikroRNA on havaittu syöpäsoluja altistetaan proinflammatoristen sytokiinien, mutta niiden tehtävä tulehdusta stressiä edelleen heikko. Tässä osoitamme, että IL-1β indusoi säätelyä miR-425, joka säätelee negatiivisesti fosfataasi ja tensin homologin ilmaisun kohdistamalla sen 3 'UTR. Lisääntyminen miR-425 riippuu IL-1β aiheuttama NF-kappaB aktivointi, joka tehostaa miR-425-geenin transkriptio upon IL-1β induktio. Näin ollen, tukahduttaminen fosfataasin ja tensin homologi, jonka miR-425 edistää mahalaukun syövän solujen proliferaatiota, joka tarvitaan suojaamaan soluja sisplatiinin indusoiman apoptoosin. Yhdessä meidän tulokset tukevat ratkaiseva rooli NF-kappaB riippuvaisen ylössäätely miR-425, joka edustaa uutta koulutusjakson tukahduttamisesta fosfataasin ja tensin homologi aktivointia ja edistää solun eloonjäämistä upon IL-1β induktio.
Avainsanat
IL-1β NF-kappaB miR-425 PTEN Mahasyöpää Background
Mahalaukun adenokarsinooma on neljäs ja viides yleisin syöpä miehillä ja naisilla, vastaavasti, maailmanlaajuisesti ja on vahvasti sidoksissa krooninen tulehdus [1]. Nyt hyvin hyväksytty, että infektio Helicobacter pylori
(H. pylori
) on merkittävä rooli puhkeamisessa krooninen tulehdus johtaa pahanlaatuisen [2]. Krooninen tulehdus vatsassa aloittaa histopatologinen etenemistä krooninen gastriitti mahalaukun surkastuminen, suoliston metaplasiaa ja lopulta mahasyövän [3]. Vaikka Helikobakteeri
infektio on erittäin yleistä, vain pieni vähemmistö (noin 1%) sairastuneiden yksilöiden kehittää mahasyöpä vuosien jälkeen. Muuttuva vastaus tähän yhteiseen taudinaiheuttaja näyttää säätelee geneettinen taipumus korkeita ekspressiotasoja proinflammatoristen sytokiinien [4].
Nukleaaritekijä kappa B (NF-kappaB) reitin on pitkään pidetty merkittävä proinflammatoristen signalointireitin, perustuu pitkälti NF-kappaB proinflammatoristen sytokiinien ja rooli NF-kappaB transkription aktivoituminen reagoivien geenien mukaan lukien sytokiinien ja kemokiinien [5]. "Kanoninen" reitti NF-kappaB aktivaatio laukaisee proinflammatoristen sytokiinien, kuten IL-1β ja yleensä johtaa aktivaatioon suhteessa tai cRel sisältäviä komplekseja [6]. NF-kappaB olemassa sytoplasmassa inaktiivisessa muodossa liittyy säätelyproteiineihin kutsutaan estäjiä KB (IKB), joista tärkein voi olla IκBα, IκBβ, ja IκBε. IκBα liittyy ohimeneviä NF-kappaB aktivointi, kun taas IκBβ on mukana jatkuva aktivointi [7]. Kuitenkin krooninen tulehdus on monimutkainen fysiologinen prosessi, ja rooli NF-kappaB tulehdusvasteeseen ei ole vielä täysin tutkittu.
Lisäksi vaikuttavat proteiinia koodaavan geenin ilmentymistä, tulehdusta stressi muuttaa myös ilmentymisen taso MikroRNA (miRNA) [8]. MikroRNA ovat luokka endogeenisiä, pieni, ei-koodaavat RNA: t, jotka säädellä negatiivisesti geenin ilmentymisen transkription jälkeisellä tasolla pääasiassa kautta sitoutuminen 3'-alueen kohde-mRNA: n, ja ne ovat tärkeitä sääntelytehtävistään valvonnassa erilaisiin fysiologisiin ja patologisia prosesseja [9, 10]. Nämä RNA: t on osoitettu olevan osallisena säätelyssä monissa solun prosessien kuten proliferaatiota, erilaistumista, ja apoptoosin [11-13]. Kuitenkin myös krooninen tulehdus säätelee miRNA ilmentymistä moduloimalla geenin transkription tai muuttamalla kopioinnin jälkeiset kypsymistä ei ole selvitetty.
Tässä työssä, huomasimme, että miR-425 induktio upon IL-1β aiheuttama tulehdus oli riippuvainen aktivointi NF-kappaB, joka parannettu miR-425-geenin transkription. Lisäksi upregulated miR-425 oli suunnattu suoraan fosfataasi ja tensin homologi (PTEN) ja säätelee negatiivisesti sen ilmaisu, joka edistää solujen eloonjäämistä, kun IL-1β induktio.
Kokeelliset menettelyt
Ethics selvitys
Kaikki näytteet saatiin potilaat, joille tehtiin leikkaus Fudanin yliopiston Shanghai Cancer Center. Protokolla hyväksyttiin Clinical Research toimikunta Fudanin yliopiston, ja tutkimus toteutettiin säännösten mukaisesti Helsingin julistuksen 1975. Vieressä normaaleissa kudoksissa leikattiin pois mahasyöpä vaurio paljain silmin ja niiden histologinen diagnoosi varmistui mikroskooppisen. Kirjallinen suostumus saatiin kaikki osallistujat mukana tutkimuksessa.
Soluviljely ja reagenssit
ihmisalkion munuais- solulinja HEK293 (ATCC® CRL-1573 ™), ihmisen rintasyöpä MDA-MB361 (ATCC ® HTB-27 ™), ihmisen mahalaukun adenokarsinoomasolulinjaan AGS (ATCC® CRL-1739 ™), SNU-1 (ATCC® CRL-5971 ™), SNU-5 (ATCC® CRL-5973 ™), SNU-16 (ATCC® CRL- 5974 ™), Hs746T (ATCC® HTB-135 ™), NCI-N87 (ATCC® CRL-5822 ™), ja KATO III (ATCC®HTB-103 ™) pidettiin DMEM: ssä, joka sisälsi 10% naudan sikiön naudan seerumin. Kaikkia solulinjoja ylläpidettiin väliaineessa, joka sisälsi penisilliiniä (100 IU /ml) ja streptomysiiniä (100 mg /ml) 37 ° C: ssa, 5% CO 2. Mirna jäljittelee ja anti-miRNA ostettiin Ambion (Austin, TX, USA). IKK-inhibiittori TPCA-1 (Cat. No. S2824), p38-MAPK-inhibiittori BIX02188 (Cat. No. S1574), ja JNK-inhibiittori SP600125 (Cat. No. S1460) ostettiin Selleckchem (Houston, TX, USA). Ihmisen rekombinantti-IL-1β ostettiin Sigma-Aldrich (Cat. Nro H6291, Shanghai, Kiina).
RNA ja reaaliaikaisen PCR
Kokonais-RNA uutettiin soluista käyttäen TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA ). Sillä microRNA analyysi, poly (A) hännät lisättiin kokonais-RNA käyttämällä poly (A) polymeraasia (Ambion, Carlsbad, CA) ennen käänteistranskriptio. MiRcute miRNA qPCR havaitseminen pakki (TIANGEN, Peking, Kiina) käytettiin kvantitoimiseksi ekspressiotasoja kypsän miR-425 mukaisesti edellyttäen protokollaa, ja GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. Reaaliaikainen PCR suoritettiin seuraavissa olosuhteissa: 95 ° C 10 m, 1 sykli; 95 ° C 10 s, 55 ° C 34 s, 40 sykliä.
Kaikki tulokset on saatu reaaliaikaisella PCR-menetelmillä, käytimme delta delta CT laskentatapana kertainen muutos geenien ilmentyminen eri ryhmien välillä. Määrä kohde (PTEN /miR-425), normalisoitu endogeeninen taloudenhoito geeni GAPDH ja suhteessa vertailunäytteeseen, saadaan seuraavasta yhtälöstä: määrä target = 2 - △△ CT.
Immunoblottausmääritys
proteiinit erotettiin 10% SDS-PAGE-geelillä ja tämän jälkeen siirrettiin PVDF-membraanille. Kun oli salvattu 5% rasvaton maito, kaivoa inkuboitiin hiiren monoklonaalisella anti-PTEN-vasta-aine (1: 500, Santa Cruz, sc-7974) ja NF-kappaB p65 Phospho (pS536) (RELA) vasta-aine (1: 10000 , EPITOMICS, Cat. #: 2220-1). IRdye-leimatut sekundääriset vasta-aineet käytettiin kvantitointiin immunoblottaus-signaalin, ja signaalit analysoitiin käyttämällä Odyssey skanneri (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA).
Lusiferaasianalyysissä
HEK293-solut ja AGS soluja transfektoitu miR-425 ja pGL3 lusiferaasireportterista konstrukteja kätkeminen miR-425 kohdesekvenssiä. 24 tunnin kuluttua, toiminta tulikärpäsen lusiferaasi ja Renilla lusiferaasin solulysaateissa mitattiin Dual-lusiferaasimäärityssysteamiä (Promega, Madison, WI, USA). Lusiferaasin transkription reportterimääritys, miR-425-geenin promoottorisekvenssit (WT tai sivusto poistetaan) kloonattiin promoottorialueen pGL3-Basic vektori, ja lusiferaasin aktiivisuus mitattiin edellä kuvatulla tavalla.
Kromatiini immunosaostuksella (ChIP)
Lyhyesti, käsiteltyjen solujen oli silloitettu 1% formaldehydiä, murtunut ja keskimääräinen koko on 400 bp ja sen jälkeen immunosaostettiin vasta-aineita NF-kappaB (Santa Cruz, sc-166588). Siru-PCR-alukkeet suunniteltiin monistamaan promoottorialueet sisältävät otaksutun NF-kappaB sitoutumiskohtien miR-425, kuten on esitetty. Positiivinen kontrollivasta-aine (RNA-polymeraasi II) ja negatiivinen kontrolli ei-immuuni-lgG käytettiin tehokkuuden osoittamiseksi, että reagensseja (Epigentek Group Inc, P-2025-48). Immunosaostettiin DNA puhdistetaan, vapautetaan, ja eluoitiin. Eluoitu DNA: ta voidaan käyttää loppupään sovelluksiin ChIP-PCR: llä. Kertainen rikastus (FE) laskettiin käyttäen suhdetta monistuksen tehokkuudesta ChIP näytteen, että ei-immuuni-lgG: llä. Monistuksen tehokkuus polymeraasi RNA II: ta käytettiin positiivisena kontrollina. FE% = 2 (IgG CT - Näyte CT) x 100%.
Soluproliferaatiomääritys
soluproliferaation määritys suoritettiin käyttäen Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japani) mukaisesti valmistajan ohjeita. Ennen kuin lisättiin CCK-8, solut pestiin lämpimällä elatusaineet pyörittämällä levyä 500 rpm 3 m ja sen jälkeen heitetään supernatantti.
Cell apoptoosimäärityksessä
syövän solut otettiin talteen ja suspendoitiin uudelleen 500 ui sitomispuskuria. Solususpensio (100 ui) inkuboitiin 5 ui anneksiini-V: n ja propidiumjodidin huoneen lämpötilassa 20 minuuttia. Värjätyt solut analysoitiin fluoresoivalla soluerottelulla (FACS) käyttäen BD LSR II virtaussytometrialla.
Solusyklianalyysiä
varten virtaussytometria-analyysi, solut trypsinoitiin ja kiinnitettiin 70% etanolilla yön yli. Sitten soluja inkuboitiin 0,5 ml propidiumjodidia liuosta, joka sisälsi 25 ug ml -1 RNaasi 15 minuuttia 37 ° C: ssa ja mitataan.
Mouse kokeissa
NCI-N87-soluja (3 x 10 6) injektoitiin oikeaan kylkiin, joilta puuttuu kateenkorva nu /nu-hiirissä. Viikon kuluttua injektiot, hiiret, joilla on vastaavat kokoinen kasvaimia, hoidettiin 4 viikkoa anti-miR-425. Anti-miR-425 (2 nmol) injektoitiin suoraan kasvaimia kahdesti viikossa 4 viikon ajan.
Tilastollinen analyysi
Tulokset on esitetty keskiarvoina ± SEM, ja tiedot analysoitiin Studentin t-testiä. Arvoa p
< 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.
Tulokset
IL-1β hoito indusoi miR-425 ilmaisu
Luonnehtia miRNA vastuussa IL-1β induktio, me profiloitu miRNA ilmentymistä PBS-käsiteltyjen AGS soluista ja IL-1β indusoimaan AGS soluihin käyttäen Exiqon miRCURY ™ LNA Array System (v.14.0). Mirna tasot erosivat suuresti välillä PBS-käsitellyn ryhmän ja IL-1β aiheuttama ryhmä, kuten on esitetty lämpöä kartan kuviossa 1A. Niistä 1891 sieppauskoettimien, 46 miRNA oli differentiaalisesti ilmaistut IL-1β aiheuttama AGS soluissa verrattuna pariksi PBS-käsiteltyjen AGS soluissa; Näiden miRNA, 29 lisättiin ja 17 määrä väheni IL-1β-indusoidun AGS-soluja (taulukko 1), mikä osoittaa, että tietty miRNA kuvio liittyy IL-1β induktio. Kuvio 1 häiriöstä miRNA ihmisen AGS soluissa, joita käsiteltiin IL-1β. (A) Ihmisen AGS-soluja käsiteltiin IL-1β (10 ng /ml) [14], ja 24 tuntia myöhemmin, miRNA ilmentymisen profiili analysoitiin microarray-teknologiaa. Lämpö kartta kaavio tuottama ilman valvontaa klustereiden analyysi 46. merkittävästi väärin säädellystä miRNA. Punainen osoittaa ylössäätely; vihreä valo osoittaa downregulation. (B) Lisääntyvät miR-425 36 kasvain näytteissä suhteessa niiden tasot Hyväksytty viereisten normaaleissa kudoksissa mitattuna reaaliaikaisella PCR: llä. Normaali: viereisten normaaleissa kudoksissa. (C) Expression taso miR-425 tutkittiin reaaliaikaisella PCR: llä useissa mahalaukun syövän solulinjojen ja kuusi normaalia mahalaukun limakalvon soluissa.
Taulukko 1 Huomattava dysregulaatio miRNA
yli-ilmentyy IL-1β indusoidun-AGS-soluja
miRNA
kertaluokkamuutos
p arvo
HSA-miR-425
12,36
0.00
hsa-miR-584
11.03
0.01
hsa-miR-31
8.12
0.00
hsa-miR-155
6.22
0.00
hsa-let-7i
5.55
0.00
hsa-miR-21
5.11
0.00
hsa-miR-335
4.89
0.01
hsa-miR-191
4.73
0.03
hsa-miR-519d
4.37
0.02
hsa-miR-520d-5p
3,95
0.00
hsa-miR-331
3.67
0.01
hsa-miR-142
3.45
0.01
hsa-miR-518a-5p
3.28
0.01
hsa-miRPlus-F1231
3.11
0.01
hsa-miR-2113
2.94
0.02
hsa-miR-196a*
2.88
0.02
hsa-miR-1304
2.78
0.02
hsa-miR-185
2.65
0.01
hsa-let-7a
2.61
0.00
hsa-miR-130
2.52
0.02
hsa-miR-1280
2.50
0.01
hsa-miR-222
2.47
0.01
hsa-let-7c
2.43
0.00
hsa-miR-602
2.31
0.00
hsa-miR-548e
2.31
0.03
hsa-miR-32
2.27
0.04
hsa-miR-181a
2.24
0.02
hsa-miR-7
2.13
0.00
hsa-miR-21*
2.06
0.00
Ali-ilmentynyt IL-1β aiheuttama-AGS solujen
miRNA
kertaluokkamuutos
p-arvo
hsa-miR-143
0.06
0.02
hsa-miR-200
0.08
0.01
hsa-miR-451
0.13
0.01
hsa-miR-144
0.17
0.00
hsa-miR-363
0.20
0.01
hsa-miR-637
0.25
0.03
hsa-miR-153
0.39
0.01
hsa-miR-139
0.39
0.00
hsa-miR-617
0.42
0.01
hsa-miR-1915
0.43
0.00
hsa-miRPlus-F1153
0.45
0.00
hsa-miR-381
0.46
0.00
hsa-miR-145
0.47
0.02
hsa-miR-659
0.47
0.03
hsa-miR-125b
0.48
0.00
hsa-miR-183*
0.49
0.00
hsa-miR-638
0.49
0.01
*: Kun kaksi kypsä miRNA peräisin eri käsivarsiin saman ennalta miRNA, asteriski nimen jälkeen indikoi miRNA ilmaistaan ​​matalalla tasolla suhteessa miRNA vastakkaiseen käsivarteen hiusneula.
Näistä miRNA, asennuspalveli- 425 oli pisimmälle voimistuvan kun IL-1β induktio. Käyttäen reaaliaikaista PCR-analyysiä, analysoimme miR-425 ilmentymistä 36 pariksi näytteistä (kasvain ja viereisten normaaleissa kudoksissa samasta potilaasta). Löysimme huomattavasti korkeampi miR-425 ilmentymisen kasvain näytteissä suhteessa tasolle viereiseen normaaleissa kudoksissa (p
< 0,0001) (kuvio 1 B). Tutkimme ilmentymistaso miR-425 joukko mahasyövän solulinjojen ja kuusi normaalit mahalaukun limakalvon soluissa. Kuten kuviossa 1C, poimimme AGS solut alassäädetty miR-425 ja NCI-N87 solujen säädelty miR-425 jatkotutkimuksiin. Vaikka aktivoituminen miR-425 on raportoitu olevan merkittävä vaikutus syövän taudin alkamisen ja etenemisen syöpäsolujen vähentämällä ilmaus laaja geenien [15], rooli miR-425 ihmisen syövissä ei ole selvitetty . Siksi valitsimme miR-425 jatkotutkimuksiin.
Ilmentäminen PTEN säätelee negatiivisesti miR-425
Tunnistaa tavoitteiden miR-425, käytimme yleisesti käytetty algoritmi, miRecords (http: //mirecords . biolead. org /), joka on integroitu resurssi eläinten miRNA-kohde vuorovaikutusta. Tarkkuuden lisäämiseksi tämän ennustuksen, geenejä, jotka ennustivat vähintään viisi yhdestätoista tietokantojen (Diana, microinspector, Miranda, mirtarget2, mitarget, nbmirtar, pictar, pita, rna22, rnahybrid ja targetscan) valittiin otaksuttu tavoitteita. Näistä otaksuttu tavoitteita miR-425, geeni ontologian analyysi paljasti, että ekspressiotasot 9 kandidaattigeenejä muutettiin; joten tämä muutos voitaisiin edistää pahanlaatuiseen fenotyyppiin. Käyttäen 3 'UTR lusiferaasireportteri- määrityksissä, olemme havainneet, että yli-ilmentyminen miR-425 esti merkittävästi lusiferaasiaktiivisuus HEK293-soluissa ja AGS solut, jotka ekspressoivat villityypin PTEN 3' UTR toimittaja (kuvio 2A). Olemme vahvistaneet, että PTEN on otaksuttu välittömänä kohteena miR-425. Havainnollistaa spesifisyyden miR-425, olemme osoittaneet, että anti-miR-425 nimenomaan poistettiin esto lusiferaasin aktiivisuuden aiheuttama miR-425 HEK293-soluissa ja NCI-N87-soluja (kuvio 2B). Mutaatiot miRNA sitoutumiskohdat (kuvio 2C) sulatettu rakenteiden reagoimatta miR-425 induktio (kuvio 2D), joka edelleen varmistaa, että PTEN geeni on välittömänä kohteena miR-425. Kuvio 2 miR-425 suoraan suunnattu PTEN. (A) Reporter määritys HEK293-soluissa ja AGS transfektoitujen solujen miR-425 ja konstrukteja, jotka sisälsivät lusiferaasia cDNA fuusioituna 3 'UTR: t ennustetun Ehdokaskohteiden (keskiarvo ± SEM). (B) Effects of anti-miR-425 lusiferaasiaktiivisuus lusiferaasin konstruktien fuusioitunut 3 'UTR: t PTEN HEK293-soluissa ja NCI-N87-solut (keskiarvo ± SEM). (C, D) Reporter määrityksessä HEK293-soluissa ja AGS transfektoitujen solujen lusiferaasin konstruktien kuljettavat PTEN 3 'UTR: t, joissa mutaatiot miR-425-sitoutumiskohtia (keskiarvo ± SEM). (E) HEK293-solut ja AGS-solut transfektoitiin lusiferaarikonstrukti kuljettavat villityypin PTEN 3 'UTR (LUC-WT) tai konstruktin kuljettaa mutatoitu PTEN 3' UTR (LUC-Mut). 24 tunnin kuluttua solut käsiteltiin IL-1β, ja lusiferaasiaktiivisuus kvantifioidaan 24 h käsittelyn jälkeen. (F) Western blot ja RT-PCR osoittaa PTEN-proteiinin tasot ja mRNA tasot AGS soluissa kuluttua 48 h miR-425 transfektiota. (G) AGS-solut transfektoitiin anti-miR-425, ja 24 tuntia myöhemmin, solut joko jätettiin käsittelemättä tai niitä käsiteltiin IL-1β ja sen jälkeen kerättiin 24 tuntia käsittelyn jälkeen. Kokosolulysaateille immunoblotattiin PTEN-vasta-aineita. (H) NCI-N87-solut transfektoitiin anti-miR-425 ja kerättiin 24 tuntia käsittelyn jälkeen. Kokosolulysaateille immunoblotattiin PTEN-vasta-aineita. (I) AGS-solut transfektoitiin plasmidilla vain avoimen lukukehyksen sekvenssi PTEN (PTEN-CDS). 24 tunnin kuluttua solut käsiteltiin IL-1β tai miR-425. Kokosolulysaateille suoritettiin immunoblottauksella sen jälkeen, kun 24 tunnin hoidon jälkeen. (* P < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001).
Lisäksi mutaatio miR-425 kohdesekvenssin myös merkittävästi heikennetty IL-1β aiheuttama tukahduttamisesta PTEN 3 'UTR lusiferaasireportterista aktiivisuus HEK293-soluissa ja AGS soluja (kuvio 2E). Yli-ilmentymisen miR-425 riitti downregulate PTEN ilmaisua sekä proteiinin ja mRNA tasot AGS soluissa (kuvio 2F). Siten IL-1β aiheuttama PTEN tukahduttaminen pelastettiin ilmaisemalla anti-miR-425 AGS soluissa (kuvio 2G). Anti-miR-425 pystyi säätää ylös PTEN ilmentymistä NCI-N87 soluja ilman IL-1β stimulaation (kuvio 2 H).
Tuloksemme myös, että 3 'UTR vaaditaan miR-425 välittämä PTEN downregulation koska ilmaus PTEN koodaavan alueen konstruktio (PTEN-CDS) oli herkkä miR-425 yli-ilmentymisen ja IL-1β induktioon AGS soluissa (kuvio 2I). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että miR-425 on keskeisessä asemassa tukahduttaa PTEN ilmaisun kohdistamalla sen 3 'UTR upon IL-1β induktio.
IL-1β aiheuttama NF-kappaB aktivoitumista tarvitaan miR-425 induktio
määrittämiseksi mekanismi, joka osallistuu miR-425 transactivation upon IL-1β induktio, tutkimme vaikutus eri estäjät mir-425 induktio IL-1β-käsiteltyjen AGS soluissa. IL-1β-indusoidun miR-425 säätelyä merkittävästi inhiboi IKK-inhibiittori TPCA-1, mutta ei p38-MAPK-inhibiittori BIX02188 tai JNK-inhibiittori SP600125 (kuvio 3A). Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että IKK on olennainen kinaasi tarvitaan NF-kappaB signalointia; Siksi tämä tulos osoitti kriittinen rooli NF-kappaB signaloinnin säätelyssä miR-425 transkriptio upon IL-1β induktio. Kuvio 3 IKK aktivoitumista tarvitaan induktioon miR-425 vasteena IL-1β induktio. (A) AGS-soluja käsiteltiin IL-1β: n läsnä että IKK-inhibiittori TPCA-1, p38-MAPK-inhibiittori BIX02188 ja JNK-inhibiittori SP600125. Kypsät miR-425 ilmentymistä 12 h käsittelyn jälkeen kvantifioitiin reaaliaikaisella PCR: llä. Kannen muutos suhteessa miR-425 ilmentymistä (miR-425 /U6) oli normalisoitu havaittu PBS-käsitellyissä soluissa. (B) ekspressio ensisijainen miR-425 (pri-miR-425) analysoitiin reaaliaikaisella PCR: llä, kuten A. (C) Ilmaus tasot NF-kappaB proteiini ja pri-miR-425 analysoitiin reaali PCR in AGS soluissa käsitelty siRNA NF-kappaB. (D) AGS-soluja käsiteltiin kemian estäjiä tai siRNA NF-kappaB. Solulysaatit saatiin 24 tunnin kuluttua IL-1β hoidon ja immunoblotattu PTEN vasta-aineita. (E) Western blot analyysi fosforyloidun NF-kappaB p65 (seriini 536). (F) Ilmaisu tasot NF-kappaB proteiini ja pri-miR-425 analysoitiin reaaliaikaisella PCR NCI-N87 soluissa käsitelty siRNA NF-kappaB. (* P < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001).
Tasaisen, induktio pri-miR-425, kun IL-1β hoidon estettiin merkittävästi läsnä on IKK-inhibiittorin tai siRNA NF-kappaB (kuvio 3B ja C). Havaitsimme myös, että IL-1β aiheuttama PTEN tukahduttaminen on vaimennettu läsnä ollessa IKK estäjän tai siRNA NF-kappaB (kuvio 3D). Sen määrittämiseksi, onko NF-kappaB aktiivisuus oli läsnä AGS soluissa, joita käsiteltiin IL-1β, käytimme western blot tason määrittämiseksi fosforyloidun NF-kappaB p65 (seriini 536). Fosforyloidun NF-kappaB p65 (seriini 536) oli korkea AGS soluissa, joita käsiteltiin IL-1β (10 ng /ml; 24 tuntia) (kuvio 3E). Lisäksi hiljentäminen NF-kappaB esti miR-425 ilmentymistä NCI-N87 soluja ilman IL-1β käsittely (kuvio 3F). Nämä tulokset viittaa siihen, että IKK-riippuvaisen NF-kappaB aktivaation upon IL-1β hoitoa tarvitaan PTEN downregulation, todennäköisimmin kautta tehostaminen miR-425 transkriptio.
Sen määrittämiseksi, NF-kappaB suoraan säätelee miR-425 transkriptio, me analysoi ylävirran sekvenssit miR-425 käyttämällä WeightMatrix kirjasto (matrixTFP60.lib) ja tunnistettiin kolme mahdollista NF-kappaB sitoutumiskohdat promoottori alueella miR-425 (cut-off: matrix samankaltaisuus = 0,9 ja keskeiset samankaltaisuus = 0,95) ( kuvio 4A). Suoritimme chromatin immunosaostuksella (chip) testeissä, joissa AGS syöpäsolujen käyttäen monoklonaalisia anti-NF-kappaB vasta-aineita. Kuten on esitetty kuviossa 4B, ainoastaan ​​aluke-B miR-425 on valmistettu vahvan PCR-tuotteita, jotka ehdottivat, että NF-kappaB-proteiini muodostaa komplekseja B sitoutumiskohta miR-425-promoottori. Tulokset lusiferaasireportteri määrityksissä viittasi siihen, että mahdollinen B sitoutumiskohta miR-425-promoottori tarvitaan transaktivaatiota alavirran geenin, kun IL-1β induktion (kuvio 4A ja C). Kuva 4 NF-kappaB sitoutumiskohdat miR-425 promoottori. (A): n ominaisuudet miR-425 5 'reunustavan DNA. Ihmisen promoottorialueet miR-425 sisältävät kolmen oletetun sitoutumiskohtia NF-kappaB. (B) pelimerkin määritykset anti-NF-kappaB vasta osoittivat sitoutumisen NF-kappaB sen edistäjä miR-425 AGS soluissa. Suhteellinen occupancies NF-kappaB on merkitty pystypalkki. Pylväiden esittävät keskiarvoja kolmen itsenäisen ChIP kokeita. (C) promoottori miR-425 aktivoitiin NF-kappaB. AGS-soluja käsiteltiin NF-kappaB ja transfektoitiin osoitetuilla LUC vektorit.
Induktio miR-425 edistää solujen eloonjäämistä, kun IL-1β induktio
On osoitettu, että PTEN on yksi useimmin inaktivoidut tuumorisuppressorigeeneille. N yli-ilmentyminen PTEN eri nisäkkäiden kudosviljelmäsoluissa vaikuttaa eri prosessien kuten solujen lisääntymisen, solukuoleman ja solujen vaeltaminen [16]. Olemme myös havainneet, että estämällä PTEN laski kaspaasi-3: lla käsiteltyjen solujen IL-1β (kuvio 5A). On uskottavaa, että miR-425 induktio saattaa estää apoptoosin kautta downregulation PTENin IL-1β käsiteltyjä soluja. Itse asiassa yli-ilmentyminen miR-425 inhiboi kaspaasi-3-aktivaation sisplatiinia saaneilla AGS-solut (kuvio 5B). Lisäksi sisplatiini-käsiteltyjen AGS solujen kotransfektiolla konstruktilla, joka sisältää ainoastaan ​​PTEN koodaavan alueen (PTEN-CDS), joka on herkkä miR-425, ohittaneet antiapoptoottisten vaikutus miR-425 yliekspressio (kuvio 5C). Näin ollen transfektion anti-miR-425 AGS-soluissa merkittävästi parannettu kaspaasi-3-aktivaation ja apoptoosin vasteena IL-1β hoitoa (kuvio 5D). Lisäksi transfektio anti-miR-425 NCI-N87 solut huomattavasti korkeampia kaspaasi-3 aktivaation ja apoptoosin ilman IL-1β stimulaation (kuvio 5E). Kuva 5 miR-425 inhiboi solun apoptoosin tukahduttaa PTEN. (A). AGS-soluja käsiteltiin kontrolli (PBS) tai IL-1β. 48 tunnin kuluttua, kokosolulysaateille immunoblotattiin. (B). AGS-soluja transfektoitiin ohimenevästi negatiivinen kontrolli (miR-NC) tai miR-425 yksinään. 24 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin sisplatiinin ja kerättiin 24 tuntia käsittelyn jälkeen. Kokosolulysaateille immunoblotattiin. (C). AGS-solut transfektoitiin miR-NC, miR-425, ja PTEN-CDS kuten on osoitettu. 24 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin sisplatiinin ja kerättiin 24 tuntia käsittelyn jälkeen. Soluapoptoosia nopeus määritettiin käyttämällä virtaussytometria menetelmällä. (D). AGS-solut transfektoitiin miR-NC tai anti-miR-425. 48 tunnin kuluttua solut käsiteltiin IL-1β ja kerättiin 24 tuntia käsittelyn jälkeen. Kokosoluliuotteista immunoblotattiin mainituilla vasta-aineilla, ja apoptoosin nopeus määritettiin käyttämällä virtaussytometria menetelmällä. (E) NCI-N87-solut transfektoitiin miR-NC tai anti-miR-425. Kokosoluliuotteista immunoblotattiin mainituilla vasta-aineilla, ja apoptoosin nopeus määritettiin käyttämällä virtaussytometria-menetelmällä.
Yhdenmukaisesti sen rooli inhiboimaan kaspaasi aktivaation, ylössäätely miR-425 olennaisesti parannettu AGS solujen lisääntymistä, kun taas pro- eloonjääminen vaikutus estyi täysin kotransfektion eksogeenisen PTEN (PTEN-CDS) (kuvio 6A). Anti-miR-425 pieneni prosenttiosuus lisääntyvien solujen NCI-N87-solut (kuvio 6B). Huomasimme myös, että estämällä PTEN oli suojaava vaikutus samankaltainen kuin soluissa yli-ilmentävät miR-425 (kuvio 6C), mikä viittaa siihen, että PTEN tukahduttaminen voi olla merkittävä rooli miR-425-riippuvaisten suoja käsitellyissä soluissa IL-1β. Kuva 6 miR-425 edistää solujen lisääntymistä tukahduttaa PTEN. (A) AGS-soluja käsiteltiin PBS: llä, IL-1β, miR-NC, miR-425, ja PTEN-CDS kuten on osoitettu. 72 tunnin kuluttua solujen lisääntymistä määritettiin käyttäen edu -leimauskittiä. (B) NCI-N87-solut transfektoitiin miR-NC tai anti-miR-425. 72 tunnin kuluttua solujen proliferaatio nopeus määritettiin käyttämällä edu -leimauskittiä. (C) AGS-soluja käsiteltiin siRNA-PTEN tai miR-425. 72 tunnin kuluttua solujen lisääntymistä määritettiin käyttäen edu -leimauskittiä. (D) Valokuvia PTEN-proteiinin ekspression kasvainkudoksessa (ylempi paneeli) ja kasvaimet (alempi paneeli). (E) Kaavio näyttää painon 3 kasvainten 4 viikon jälkeen (n = 3). (F) merkittävä käänteinen korrelaatio havaitaan välillä miR-425 ja PTEN-ilmentymisen tasot mahasyövän kudoksissa (n = 52). (G) ilmentyminen tasolla PTEN on määritelty kuuden normaaleissa mahan limakalvon soluja ja mahasyövän solulinjoissa käyttäen reaaliaikaista PCR: llä. (H) malli, joka kuvaa oletetun roolit IL-1β ja miR-425 valvonnassa PTEN reitin ihmisen mahakarsinooman soluja.
Olemme tutkineet vaikutusta miR-425 kasvainten muodostumiseen in vivo. Kasvaimet käsiteltiin anti-miR-425 osoitti kohonneita PTEN-proteiinin (kuvio 6D). Lisäksi, anti-miR-425 vähensi kasvaimen paino hiirillä verrattuna miR-NC-käsitellyssä ryhmässä (kuvio 6E). Muiden kuin parametriset testit, löysimme merkittävä käänteinen korrelaatio PTEN mRNA ja miR-425 ilmentymisen mahasyövän näytteistä (kuvio 6F). Ilmentymistasojen PTEN määritettiin myös kuudessa normaalissa mahan limakalvon soluja ja mahasyövän solulinjoissa käyttäen reaaliaikaista PCR: llä. Kuten on esitetty, solut "alassäädetty" miR-425 on suurempia määriä PTEN verrattuna solulinjoissa "säädelty" miR-425 tasoa (kuvio 6G). Lopuksi todettakoon, että tulokset ovat osoittaneet, että miR-425: lla on syy-asema kohdistamalla PTEN mahalaukun syövistä.
Keskustelu
Interleukiini-1 (IL-1) on merkittävä pro-inflammatorinen sytokiini, joka tuotetaan pahanlaatuisia tai microenvironmental soluihin [17]. IL-1 toimii myös pleiotrooppinen sytokiini kasvaimien syntyyn liittyvien ja kasvaimen invasiivisuus; Siksi, se merkitsee mahdollista ehdokas modulatory sytokiiniä, joka voi kallistaa tasapainoa tulehdus ja sietää induktion antitumor vastauksista [18]. IL-1α: n ja IL-1β ovat tärkeimmät agonisteja IL-1. Niiden eritetyt muodot, IL-1α: n ja IL-1β sitoutuvat samoihin reseptoreihin ja indusoivat saman biologisten toimintojen [19]. Kuitenkin, IL-1α: n ja IL-1β eroavat eristämisen solun sisällä tai mikroympäristön [20]. IL-1β on aktiivinen vain sen erittyvän muodon ja välittää tulehdusta, joka edistää syövän syntymistä, kasvaimen invasiivisuus ja immunosuppressio [21]. Jotkut uudet anti-IL-1β aineita on käytetty kliinisissä tutkimuksissa potilailla, joilla monipuolinen sairauksia, joilla on tulehduksellinen ilmenemismuodot [22]. Parempi ymmärrys integroiva rooli IL-1β signalointireiteissä pahanlaatuinen prosessi mahdollistaa soveltamisen uusien IL-1β modulaatio lähestymistapoja syöpäpotilailla.
PTEN havaittiin tärkeänä tuumorisuppressorigeenin, että on usein mutatoitunut tai hävinnyt erilaisia ​​syöpiä [23]. Useat linjat todisteet ovat osoittaneet PTEN lipidiä fosfataasi, joka hydrolysoi 3 'fosfaatti Fosfoinositidien [24]. PTEN voi myös säädellä toiminnan seriini /treoniini-kinaasi AKT /PKB ja voi siten vaikuttaa solun eloonjäämistä signalointi [25]. UV altistuminen voi laukaista PTEN vuorovaikutus villityypin melanocortin-1-reseptorin variantit, joka suojaa PTEN peräisin WWP2 välittämän hajoamisen, mikä johtaa AKT inaktivaatiomenetelmät melanooman [26]. On olemassa useita mekanismeja sääntelyä PTEN, mukaan lukien transkriptio mRNA vakautta, microRNA kohdentaminen, käännös- ja proteiinia vakautta. PTEN on transkriptionaalisesti vaiennetaan promoottori metylaation mahakarsinoo- [27]. PTEN voi myös olla translaation säädellään asetylaatio ubiquitylation, hapetus, fosforylaatio, ja solunosasijaintia [28]. Huolimatta laajasta luonnehdinta PTEN mutaatioita ihmisen syövissä ja suhteellisen hyvä käsitys molekyyli roolit PTEN valvonnassa soluprosesseja, tiedetään vähän tilaa PTEN sääntelyn.
PTEN voidaan estää syöpäsoluja kun induktio pro-inflammatoristen sytokiinien IL-1β [29]. Stimulaation IL-1β aktivoi NF-kappaB fosforyloimalla ja hajoaminen lKB. Tämä aktivointi sallii NF-kappaB on translokoida tumaan ja transkriptionaalisesti aktivoida kohdegeenien [30]. NF-kappaB on heterodimeerinen transkription aktivaattori, joka koostuu DNA: ta sitovan alayksikön p50 ja transaktivaation alayksikön p65 [31]. Korkea endogeenisen NF-kappaB väheni ilmaus PTEN, ja PTEN ilme voitaisiin pelastaa erityisiä estämällä NF-kappaB reitin [32]. Kaikki kirjoittajat luettu ja hyväksytty lopullinen käsikirjoitus.

• Influence of IL17A polymorfismien on poikkeava metyloinnin DAPK ja CDH1 in ei-syöpä mahalaukun mucosa
• Epätavalliset trichobezoar mahan ja suolen: tapaus report