Utarmning av OLFM4 genen hämmar celltillväxt och ökar sensibilisering för väteperoxid och tumörnekrosfaktor-alfa framkallad-apoptos i magcancer cells

utarmning av OLFM4 genen hämmar celltillväxt och ökar sensibilisering för väteperoxid och tumörnekrosfaktor-alfa framkallad-apoptos i gastrisk cancerceller Bild Sammanfattning
bakgrund
Human olfactomedin 4 (OLFM4) genen är ett utsöndrat glykoprotein mer känd som anti-apoptotiska molekyl GW112. OLFM4 befinns vara ofta uppreglerat i många typer av humana tumörer inklusive magcancer och det troddes spela viktig roll i utvecklingen av magcancer. Även om funktionen av OLFM4 har angivits i många studier, tyder nya bevis starkt en cell eller vävnadstyp-beroende roll OLFM4 i celltillväxt och apoptos. Syftet med denna studie är att undersöka betydelsen av magcancer specifikt uttryck av OLFM4 i celltillväxt och apoptos motstånd.
Metoder
OLFM4 uttryck elimineras genom RNA-interferens i SGC-7901 och MKN45 celler. Cellproliferation, förankringsoberoende tillväxt, cellcykeln och apoptos karaktäriserades in vitro. Tumörbildning analyserades in vivo. Den apoptos och kaspas-3-aktivering som svar på väteperoxid (H 2O 2) eller tumörnekrosfaktor-alfa (TNF α) bedömdes i närvaro eller frånvaro av kaspas-inhibitor Z-VAD-fmk.
Resultat
elimineringen av OLFM4 protein genom RNA-interferens i SGC-7901 och MKN45 celler hämmar signifikant tumörbildning både in vitro och in vivo genom induktion av cell G1 gripande (alla P < 0,01). OLFM4 knockdown inte utlösa uppenbara cell apoptos men ökade H 2O 2 eller TNF α-inducerad apoptos och kaspas-3-aktivitet (alla P < 0,01). Behandling av Z-VAD-fmk försvagade kaspas-3-aktivitet och signifikant omvänd H 2O 2 eller TNF α-inducerad apoptos i OLFM4 knockdown celler (alla P < 0,01).
Slutsats
vår studie visar att utarmning av OLFM4 hämmar signifikant tumorigenicitet av magcancer SGC-7901 och MKN45 celler. Blockering OLFM4 uttryck kan sensibilisera gastric cancerceller till H 2O 2 eller TNF α behandling genom att öka kaspas-3-beroende apoptos. En kombination strategi baserad på OLFM4 inhibitions och anticancerläkemedel behandling kan ge terapeutisk potential vid gastric interventionscancer.
Nyckelord
Magcancer Olfactomedin fyra RNA-interferens Celltillväxt Apoptos resistens Bakgrund
Human OLFM4 (olfactomedin 4, även känd som HGC-1, GW112), ursprungligen benämnd humana klonade från myeloida prekursorceller efter granulocytkolonistimulerande faktor stimulering [1], är ett utsöndrat glykoprotein mer känd som anti-apoptotiska molekyl GW112 [2, 3]. OLFM4 uttrycks normalt i benmärg, prostata, tunntarm, mage, kolon och pankreas [1, 4]. Därefter ökade OLFM4 nivåer påträffades också i kryptan epitel av inflammerad kolonslemhinnan av inflammatoriska tarmsjukdomar [5] och i gastriska biopsier infekterade med Helicobacter pylori [6, 7]. På senare tid har uppreglerat OLFM4 uttryck beskrivits i lunga och bröst [8], prostata [3], gastric [3, 9] och pankreascancer [8, 9] liksom i kolorektala adenom [10-14].
Det har föreslagits att OLFM4 är involverad i cellulär process såsom apoptos och tumörtillväxt [2]. Även den cellulära funktionen hos OLFM4 har undersökts, gör dessa resultat inte alltid sammanfaller. Överexpression av OLFM4 har visat sig underlätta mus prostatatumör Tramp-C1 celltillväxt i syngena C57 /BL6-möss [2], men inhiberar human prostatacancer PC-3 cellproliferation [15]. Dessutom, uppreglerat OLFM4 visade en stark anti-apoptotiska aktivitet i mus lymfatisk ven endotelceller SVEC-celler och humant adenokarcinom HeLa-celler [1, 2], medan senaste resultaten föreslog en proapoptotisk effekt OLFM4 i humana myeloid leukemi HL-60-celler [16 ]. Bevis från dessa studier visar tydligt att rollerna för OLFM4 i celltillväxtkontroll och apoptos kan bero på cell- eller vävnadstypen [10, 13-15]. Till dags dato har emellertid mycket begränsade uppgifter om vilken roll OLFM4 i celltillväxt och apoptos profiler av gastric cancerceller har publicerats.
I den aktuella studien analyserade vi OLFM4 proteinuttryck i gastric cancerceller och normala humana gastrisk epitel GES-1-celler genom Western blotting. Med hjälp av plasmid-medierad kort hårnål RNA (shRNA), hämmade vi OLFM4 uttryck i magcancer SGC-7901 och MKN45 celler att observera celltillväxt, cellcykelfasen, apoptos in vitro och att bedöma dess tumörframkallande förmåga in vivo. Vi utforskade även apoptos och kaspas-3-aktivering som svar på cytotoxiska medel såsom H 2O 2 eller TNF α i närvaro eller frånvaro av kaspas-inhibitor Z-VAD-fmk mellan OLFM4 knockdown-celler och HK kontrollceller .
metoder
cellodling, reagens och möss sälja The humana gastric cancerceller BGC-823, HGC-27, SGC-7901, MKN28, MKN45 och mänskliga normala gastriska epitelceller GES-1-celler upprätthölls DMEM-medium (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS, GibcoBRL, USA), 100 U /ml penicillin och 100 | ig /ml streptomycin. H 2O 2 och TNF-α erhölls från Sigma (St. Louis, MO) och Z-VAD-fmk köptes från Calbiochem (San Diego, CA). BALB /c nakna (nu /nu) möss (4-6 veckor gamla, SPF grad, 20 ± 3 g) köptes från Laboratory Animal Center of Chongqing Medical University (Chongqing, Kina). Alla procedurer utfördes enligt internationellt accepterade etiska riktlinjer (. NIH publikation nr 85-23, reviderad 1985) Plasmid.
Konstruerar och stabil transfektion
shRNA-medierad RNAi plasmid (pGenesil 1,1-siOLFM4) och en kodad kontroll plasmid (pGenesil 1,1-HK) konstruerades för att slå ner den endogena OLFM4 i SGC-7901 och MKN45 celler. Efter transfektion och neomycin (G418) val, OLFM4 knock-down SGC-7901-siOLFM4, MKN45-siOLFM4 celler och oordning SGC-7901-HK, MKN45-HK kontrollceller stabilt erhölls respektive (detaljer visas i kompletterande fil 1: Kompletterande data).
RNA-extraktion och kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) Review Totalt RNA i olika celler eller tumörxenografter extraherades med användning av RNeasy Mini Kit (Qiagen, CA, USA), och följdes av cDNA-syntes med hjälp av ReverTra Ace-α-första sträng-cDNA-syntessystem (Toyobo, Osaka, Japan) såsom tidigare beskrivits [17]. Kvantitativ realtids-PCR utfördes med användning av 7500 realtids-PCR-system (Applied Biosystems) med SYBR-grön som ett fluorescerande färgämne (Toyobo, Osaka, Japan) (detaljer visas i kompletterande fil 1: Kompletterande data). Vika förändringar i genuttryck bestämdes med användning av "2 - ddCT". Metod [18]
cellprolifereringsanalys in vitro och cellviabiliteten mätning
cellproliferation och cellviabiliteten mättes med användning av Cellproliferation WST-1-kitet (Roche ) i enlighet med tillverkarens instruktioner. För cellproliferation, såddes celler vid en densitet av 1 x 10 3 celler per brunn i en 96-brunnsplattor och odlades under 5 dagar. Den optiska densiteten (450 nm) värde detekterades med användning av Microplate Reader (TACAN, Swaziland) per dag. Varje analys utfördes i triplikat. Som för mätning av cellviabilitet, celler (1 x 10 4 /brunn) såddes med 200 | il medium i 96-brunnars plattor. Efter 12 timmars inkubation, H 2O 2 eller TNF α behandlades i angivna koncentrationerna. Relativa absorbansen mättes såsom beskrivits i cellproliferation.
Förankringsoberoende tillväxtanalys
förankringsoberoende tillväxt utfördes på mjuk agar för att reflektera in vitro klonogenicitet. Kortfattat, celler (5 x 10 2) från varje koloni suspenderades i 0,3% agar i DMEM och plattströks sedan på stelnat agar (0,5%) i 6-brunnsplattor. Celler inkuberades under 2 veckor vid 37 ° C i 5% CO 2 innan kolonierna mättes. Antalet kolonier räknades vid 200 gångers förstoring för fem slumpmässiga fält. Varje analys utfördes i triplikat.
Flödescytometrianalys
Flödescytometri (FCM) analys utfördes för att fastställa cellcykelprogression eller apoptos. (Detaljer visas i kompletterande fil 1: Kompletterande data) katalog Caspase assay
Enzymatisk aktivitet av kaspas-3 och -9 mättes med användning av en fluorometrisk analys enligt en metod som beskrivits tidigare [8]
Western blot-analys.
Western blotting utfördes såsom beskrivits tidigare [17]. Följande antikroppar användes för Western blotting: anti-OLFM4 (Abcam, Cambridge, UK) och anti-β-aktin (Santa Cruz, CA, USA) Den relativa kvantiteten av proteiner analyserades med användning Kvantitet ett-programmet (Bio-Rad, Hercules , CA, USA) och normaliserades till den för β-aktin (detaljer visas i ytterligare en fil 1. Kompletterande uppgifter) katalog xenograft tumörmodellen
Fyrtio nakna möss delades in i fyra grupper slumpmässigt. Varje grupp injicerades subkutant i ryggen med suspensionen av 200 pl innehållande 2 × 10 6 celler ovannämnda respektive. Volymen av xenotransplantat i serie mäts. Mössen avlivades efter 35 dagar. De xenografter skars och vägdes. Hämningshastigheter xenotransplantat beräknades i enlighet med formeln: hämningsgrad (%) = 1-medelvikten (OLFM4 slå ner celler-injicerade gruppen eller HK kontrollceller-injicerade gruppen) /medelvikten (HK kontrollceller-injicerade gruppen) x 100%. Sedan tumörvävnaden var föremål för total RNA isolering eller immunohistokemi upptäckt.
Immunohistokemi (IHC) Review OLFM4 proteiner i tumörxenotransplantat analyserades med IHC med hjälp av kanin-anti OLFM4 (Abcam, Cambridge, UK) (detaljer visas i ytterligare fil 1. kompletterande uppgifter) statistik
Data från oberoende experiment uttrycktes som medelvärde ± SD av åtminstone tre experiment. Jämförelser mellan grupper analyserades med två-tailed Students t
-test eller ANOVA, i förekommande fall, och p-värden < 0,05 ansågs vara statistiskt signifikanta resultat.
Effektiv knock ned OLFM4 genen genom plasmid-medierad siRNA i gastric cancerceller
OLFM4 proteinuttrycksmönster undersöktes i magcancer BGC-823, HGC-27, SGC-7901, MKN28, MKN45 celler och normala GES-1 kontrollceller (Figur 1A). OLFM4 protein definitivt uttrycker i alla dessa gastric cancerceller och GES-1-celler. I synnerhet SGC-7901 och MKN45 celler uttryckte relativt hög nivå OLFM4 protein än andra gastric cancerceller och GES-1-celler. Därför var SGC-7901 och MKN45 celler valdes för fortsatta studier. Figur 1 Effektiv knockdown av OLFM4 av RNA-interferens i magcancer SGC-7901 och MKN45 celler. A. Expression av OLFM4 protein i olika gastric cancercellinjer. Uttrycksprofilen för OLFM4 protein analyserades med hjälp av Western blotting med β-aktin som en inre kontroll. GES-1-celler fungerade som normala kontrollceller. B. OLFM4 mRNA-expression i OLFM4 knockdown-celler. Relativa expressionen av OLFM4 detekterades genom QRT-PCR. β-aktin användes som en intern kontroll. Vika förändringar i OLFM4 mRNA-uttryck bestämdes med användning av 2-ΔΔCt metoden. C. OLFM4 proteinuttryck i OLFM4 knockdown-celler. OLFM4 protein uttryck detekterades genom western blotting. p-aktin-proteinet användes som en intern kontroll. Representanter för tre experiment visas. ** P < 0,01 vs. HK kontrollceller (n = 3).
Att nedreglera OLFM4 expression framställdes en plasmid-medierad shRNA targeting OLFM4 genen konstrueras för att stabilt slå ner OLFM4 expression i SGC-7901 och MKN45-celler. Såsom visas i figur 1B, var OLFM4 mRNA-nivåer signifikant reducerad i SGC-7901-siOLFM4 och MKN45-siOLFM4 celler jämfört med deras HK kontroll eller föräldraceller (P < 0,01). Dessa resultat bekräftades ytterligare genom western blotting-analys (Figur 1C). Ingen signifikant skillnad i OLFM4 expression observerades mellan föräldra och HK kontrollceller. Nivåerna av mRNA och protein för β-aktin var liknande bland de olika grupperna. Dessa resultat tyder på att en plasmid-medierad OLFM4-siRNA specifikt och effektivt kan slå ner OLFM4 nivå i gastric cancerceller. På grundval av undersökningen anges ovan därför OLFM4 slå ner celler och HK kontrollceller valdes för ytterligare undersökning.
OLFM4 knockdown hämmar magcancer cellproliferation och förankringsoberoende tillväxt in vitro
För att bestämma rollen av OLFM4 i gastrisk cancercelltillväxt, undersökte vi effekten av OLFM4-siRNA på celltillväxt vid 1-5 dag tid punkt genom WST-1 assay. Såsom visas i fig 2A, i alla två gastriska cancercellinjer, tillväxten av OLFM4 slå ner celler reducerades signifikant jämfört med HK kontrollceller från dag 3 (P < 0,01). För att ytterligare undersöka betydelsen av OLFM4 i tumörbildning av gastric cancerceller in vitro, genomförde vi förankringsoberoende tillväxtanalyser och hittade SGC-7901 och MKN45 celler som uttrycker HK kontroller växte väl i mjuk agar och bildar distinkta kolonier. I motsats härtill OLFM4 knockdown SGC-7901 och MKN45-celler uppvisade en dramatisk minskning av antalet mjukagar kolonier (P < 0,01) (figur 2B), som visar att transformera förmågor mindre än de hos kontrollcellerna. Dessa data indikerade att knock-down av OLFM4 kunde inhibera gastrisk cancercellproliferation och förankringsoberoende tillväxt in vitro. Figur 2 knockdown av OLFM4 hämmar tillväxten av SGC-7901 och MKN45-celler in vitro och in vivo. A. Cell tillväxtkurva. Cellproliferation in vitro bedömdes genom att celltillväxtkurvan, som bestäms genom räkning av cellantalet (WST-1-analysen) i SGC-7901-celler (vänster fält) och MKN45-celler (höger panel). OD-värdet (450 nm) räknades på motsvarande dagar och presenteras som medelcellantal (n = 3). B. förankringsoberoende tillväxt i mjuk agar. Representativa bilder av tre experiment visade (övre panelen). Data representerar det genomsnittliga antalet kolonier räknades vid 200 gångers förstoring för 5 slumpvisa fält (lägre panelen). C. medeltumörvolymen efter subkutan injektion av nakna möss med HK kontroll eller OLFM4 knockdown-celler mättes vid de angivna tidpunkterna. D. representant tumörer bilder på 35 dagar efter subkutan injektion av angivna celler. E. Mean tumörvikt (till vänster) och hämningsgrad (högra panelen) i tumörxenotransplantat. Data representerar medeltumörvikten för xenotransplantat (medelvärde ± SD, n = 10). ** P < 0,01 mot HK kontrollgruppen.
Tillväxthämmande effekt av minskad OLFM4 i mag tumörxenotransplantat
Dessutom har vi också utfört subkutan tumör formativ analys i nakna möss för att utvärdera tillväxthämning effekten av nedregleras OLFM4 in vivo. Nakna möss injicerades subkutant med OLFM4 knockdown eller HK kontrollceller. Tumörvolymer per 4 dagar och tumörvikten vid 5 veckor mättes respektive efter subkutan injektion. Såsom visas i fig 2C-D, oavsett om tumörvolymen eller tumörvikt som produceras av OLFM4 slå ner SGC-7901 och MKN45 cellerna hade signifikant reducerad tillväxt jämfört med tumörer producerade i möss som injicerats med HK kontroll-transfekterade celler (P < 0,01). Den hämmande graden av SGC-7901 och MKN45 riva celler-injicerade gruppen på tumörtillväxt var 40,29% och 37,48% respektive (Figur 2E).
För att ytterligare försäkra OLFM4 uttryck indeedly tystas efter subkutan injektion av nakna möss, vi också utvärderas OLFM4 uttryck i tumörxenotransplantat använder QRT-PCR och IHC. På liknande sätt in vitro, OLFM4 mRNA-nivån i tumörxenotransplantat som produceras av OLFM4 knockdown-celler visade också en signifikant minskning jämfört med HK kontrolltumörer xenotransplantat (P < 0,01) (figur 3A). I överensstämmelse med resultaten av QRT-PCR, signifikant reduktion av OLFM4 protein observerades också i tumörxenotransplantat med IHC (P < 0,01) (figur 3B och 3C). Högre gråskala och starkare positiv signal från DAB visualisering hittades i tumörxenotransplantat i HK kontrollceller-injicerade gruppen. Tvärtom var svag brun färgning observeras i tumörxenotransplantat i OLFM4 knockdown celler injicerade gruppen. Dessutom var mer stor nekros regionen observerats i tumörxenotransplantat produceras av HK kontrollceller på grund av en snabb tillväxt av HK kontrollceller (Figur 3B övre panelen). Dessa data gav en stark indikation på att OLFM4 uttryck vid mRNA och proteinnivåer stabilt hämmade verkligen in vivo. Fattas kollektivt, både in vitro och in vivo-experiment tyder på att OLFM4 knockdown hämmar tillväxten av gastriska cancerceller. Figur 3 QRT-PCR och IHC detektion av OLFM4 i tumörxenotransplantat. A. QRT-PCR för OLFM4 mRNA i tumörxenotransplantat. Vika förändringar i OLFM4 mRNA bestämdes med användning av 2-ΔΔCt metoden. p-aktin-genen användes som en intern kontroll. B. H & E-färgning (övre panelen) och IHC för OLFM4 protein (lägre panel) i tumörxenotransplantat. Representativa bilder (200 ×) visas. N, nekros. C. Kvantifiering analys av OLFM4 uttryck. Medelvärdet mättes från fem slumpvis olika områden under mikroskop (400 ×) med hjälp av Image-Pro Plus V6.0. Data uttrycktes som medelvärde ± SD. ** P < 0,01 mot HK kontrollgruppen.
OLFM4 knock-down förseningar G1 till S övergången men inte utlösa uppenbara apoptos i gastric cancerceller
tanke våra observerade hämmande effekt på celltillväxt in vitro och in vivo, försökte vi bestämma vare förbättrad apoptos eller fördröjd cellcykelprogression var associerat med tillväxthämning. Vi utvärderade först effekten av minskad OLFM4 på cellcykelns förlopp. Såsom visas i fig 4A, såväl OLFM4 knockdown SGC-7901 och MKN45 celler visade betydande ökade antal i G1-fasen och minskat antal i S-fas, i motsats till sina HK kontrollceller (P < 0,01). Inga signifikanta skillnader observerades i G2 /M-fas, vilket tyder på en typisk G1 fördröjning av cellcykeln. Figur 4 Bedömning av cellcykelfördelning, apoptotiska celler och kaspas-3/9 aktivering i OLFM4 slå ner gastriska cancerceller. A. Cellcykelanalys. Förändringar i cellcykelfördelning av SGC-7901-HK, SGC-7901-siOLFM4 och MKN45-HK var MKN45-siOLFM4 celler analyserades med FCM. Data representerar medelvärdet procentandel av distributionscellcykelfasen (n = 3). B. Cell apoptos-analys. Apoptos uppskattades med AnnexinV-PE /7-AAD färgning av FCM. Data representerar medelvärdet apoptotiska cell procent (n = 3). C. caspase-3 och -9 aktiveringar. Kaspas-3, är 9 aktiveringar mellan angivna celler visas. ** P < 0,01 mot HK kontrollgruppen.
Att bestämma huruvida apoptos är involverad i denna tillväxthämning, nästa utförde vi cell apoptos analys. Intressant nog kan minskas OLFM4 uttryck inte leda till betydande förändringar i apoptos (Figur 4B), vilket överensstämmer med cellcykelanalys visar någon uppenbar sub-G1-fasen i de testade cellerna. För att ytterligare undersöka förändringar av apoptotiska signaler, var kaspas-3 /-9 aktivitet också identifieras genom kolorimetriska aktiveringsanalyser. Både kaspas-3 och -9 aktiveringar visade inga signifikanta förändringar efter knockdown av OLFM4 i SGC-7901 och MKN45 celler (Figur 4C). Dessa resultat tyder på att nedreglering av OLFM4 kan utöva en hämmande effekt på celltillväxt genom att reglera cellcykelns framskridande inte omfattar apoptos i gastric cancerceller.
Radering av OLFM4 sensibiliserar gastric cancerceller till H2O2 eller TNF α-inducerad apoptos
den distinkta effekten av H 2O 2 eller TNF α på apoptos mellan OLFM4 riva och HK kontrollceller undersöktes också. OLFM4 riva eller HK kontrollceller behandlades med 10, 100 och 1000 pm H 2O 2 eller 5, 10 och 50 ng /ml TNF α respektive. Cellviabilitet och apoptos bedömdes. Såsom visas i fig 5A-D, var en dosberoende minskning i cellviabilitet observerats i H 2O 2 eller TNF α-behandlade OLFM4 slå ner celler. Vidare behandling av 10 nM H 2O 2 (figur 5A-B) eller 10 ng /ml TNF a (Figur 5C-D) har lett till en betydande minskning av cellviabilitet i OLFM4 slå ned celler jämfört med HK kontrollceller (P < 0,01). Av särskilt intresse är slutsatsen att OLFM4 knockdown celler snarare än HK kontrollceller behandlade med 10 ~ 1000 iM H 2O 2 uppvisade mer framträdande apoptotiska procentsatser i jämförelse med de som behandlats med PBS mock (P < 0,01) ( Figur 5A-B). Liknande resultat sågs också i TNF a-behandlad OLFM4 knockdown-celler (Figur 5C-D). Med andra ord, OLFM4 riva förbättrad H 2O 2 eller TNF α-inducerad apoptos i gastric cancerceller, vilket indikerar deletion av OLFM4 gjorde SGC-7901 och MKN45 celler mer känsliga för behandling av H 2O 2 eller TNF α. Figur 5 svar av OLFM4 knockdown SGC-7901 och MKN45 celler till apoptos-inducerande medel H2O 2 eller TNF-a. OLFM4 knockdown och HK kontrollceller behandlades med H2O2 (A och B) eller TNF α (C och D), såsom anges doser för 12 timmar. Cellviabilitet mättes med WST-1 assay (A-D vänstra panelen) och uttryckt i den genomsnittliga OD-värde (450 nm) (n = 3). Den procentuella andelen av de apoptotiska celler bestämdes genom FCM (A-D högra panelerna) och uttrycktes i det betyda apoptotiska procentsatsen (n = 3). * P < 0,05, ** P < 0,01 mot HK kontrollgruppen.
Kaspas-3-aktivitet är involverad i H2O2 eller TNF α-inducerad apoptos i OLFM4 knock-down celler
Ovanstående resultat indikerade att riva av OLFM4 kan öka H 2O 2 eller TNF α-stimulerad apoptos. För att ytterligare kontrollera huruvida kaspas-3 aktiveras i H 2O 2 eller TNF α-inducerad apoptos i OLFM4 knockdown celler, nästa upptäckte vi kaspas-3-aktivering i H 2O 2 eller TNF a-behandlade celler med hjälp av kolorimetrisk analys. Såsom visas i fig 6A, behandling av H 2O 2 eller TNF α resulterade i mycket mer förstärkning av kaspas-3-aktivitet i OLFM4 knockdown-celler än HK kontrollceller (P < 0,01), vilket tyder på kaspas-3-aktivitet är involverad i H 2O 2 eller TNF α-inducerad apoptos i OLFM4 knockdown-celler. För att ytterligare kontrollera huruvida H 2O 2 eller TNF α-inducerad apoptos är beroende av kaspas-3-aktivitet, Z-VAD-fmk, en kaspas-inhibitor användes innan behandlingen av H 2O 2 eller TNF α. Förbehandling av Z-VAD-fmk signifikant attenuerade H 2O 2 eller TNF α-inducerad cell apoptos samt kaspas-3-aktivitet i både OLFM4 Knockdown-celler (P < 0,01) (Figur 6C-D ), vilket indikerar att H 2O 2 eller TNF α-inducerad apoptos är kaspas-3 beroende i OLFM4 knockdown-celler. Figur 6 Medverkan av kaspas-3-aktivitet i H2O 2 eller TNF α-inducerad apoptos i OLFM4 knockdown SGC-7901 och MKN45-celler. (A-B) Ökad kaspas-3-aktivitet i H2O2 eller TNF a-behandlade OLFM4 knockdown-celler. OLFM4 knockdown och HK-kontrollceller behandlades med 10 ^ M H2O2 (A) eller 10 ng /ml TNF α (B) under 12 timmar. Kaspas-3-aktivitet mättes med användning av kolorimetrisk analys och uttrycktes i faldiga förändringar. ** P < 0,01 mot PBS mock-grupp (n = 3). (C-D) Omvänd cellapoptos genom kaspas-inhibitor i OLFM4 knockdown-celler. Cellerna behandlades med enbart H2O2 eller TNF α med angivna doser som ovan nämnts eller förbehandlas med 20 iM Z-VAD-fmk två timmar före H2O2 eller TNF α behandling. Den procentuella andelen av apoptotiska celler bestämdes genom FCM. Data representerar medelvärdena ± SD från tre oberoende experiment. ** P < 0,01 mot H2O2 (C) eller TNF α (D) -behandlade OLFM4 knockdown celler gruppdiskussioner
Nyligen ackumulera data visade OLFM4.
Ofta överuttryckt i många typer av humana tumörer, inklusive magcancer, och det ansågs spelar en avgörande roll i utvecklingen och utvecklingen av gastric cancer [19, 20]. Även om tidigare studier har visat att OLFM4 är involverad i apoptos och tumörtillväxt, aktuella observationer tyder också på att cell- eller vävnadsspecifika effekter kan existera för OLFM4 genen. Relativt lite är känt om tumörtillväxt och apoptos underliggande magcancer specifik OLFM4 uttryck. För att få en bättre förståelse för denna roll för den ändrade OLFM4 i human magsäckscancer är experimentellt stöd som krävs för att validera roll OLFM4 genen i magcancer.
Det har visat sig att onormalt uttryck av HGC-1 kan regleras på transkriptions eller posttranskriptionell nivå [13]. I våra nuvarande verk undersökte vi direkt OLFM4 proteinuttrycksmönster i mag cancerceller och normala GES-1-celler. SGC-7901 och MKN45 celler som uttrycker relativt höga OLFM4 nivåer valdes för denna studie. Sedan minska målgenuttryck på genetisk väg i etablerade cellinjer är till hjälp för en bättre förståelse för sin roll för att upprätthålla den maligna fenotypen särskilt att analysera gener som är nödvändiga för cellulär överlevnad [21], vi genererade stabila klon pooler av SGC-7901 och MKN45 uttrycker OLFM4-siRNA eller förvrängd HK kontroll av plasmid-baserad siRNA strategi och bekräftade knock-down effektivitet OLFM4 genen vid mRNA och proteinnivåer av QRT-PCR och Western blotting.
Våra nuvarande verk visar att OLFM4 spelar en viktig roll i magcancer tumörbildning. Knockdown av OLFM4 hämmar cellproliferation och förankringsoberoende tillväxtförmåga in vitro. Xenograft tumörmodell in vivo innebär också att minskade OLFM4 kan hämma tumörtillväxt av humana gastriska cancerceller. Dessa resultat indikerar att OLFM4 spelar en avgörande roll vid cellproliferation av gastriska cancerceller. Våra resultat observerade också att knock-down av OLFM4 inte påverkar graden av apoptos och kaspas-3 och 9 aktiveringar i OLFM4 knockdown celler, vilket tyder på att apoptos kanske inte mekanismen bakom hämningen av tumörtillväxt. Således har vi postulerar att OLFM4 uttryck är inte väsentlig för cancercellöverlevnad, vilket är i enlighet med en nyligen gjorda observationen att genetiska knock-out-möss för OLFM4 visar normal utveckling och hematopoietiska fenotyper [17]. För att ytterligare karakterisera mekanismen bakom tillväxthämning, utförde vi cellcykelanalys och visade att hämning av OLFM4 expression inducerad gastriska cancerceller för att ackumuleras i G1-fasen av cellcykeln, vilket antyder att nedreglerade OLFM4 kan utöva en hämmande effekt på celltillväxt genom en mekanism som reglerar cellcykelprogression inte omfattar apoptos i gastric cancerceller.
Motstånd av tumörceller till induktion av apoptos är en av de viktigaste faktorerna som är ansvariga för misslyckandet med många konventionella cancerbehandling som använder cytostatika och strålning. Därför är apoptos kontroll i cancerceller av kritisk biologisk och klinisk betydelse [22, 23]. Anti-apoptotiska aktivitet är en annan viktig funktion av OLFM4 genen [2]. I synnerhet H 2O 2-inducerad cellulär apoptos dämpas av överuttryckt OLFM4 i en prostatacancer cellinje [2]. Dessutom har MKN45-celler visat en förmåga av resistens mot TNF α-inducerad apoptos [24]. Med tanke på dessa fynd, hypotes vi att knockdown av OLFM4 uttryck kan förbättra H 2O 2 eller TNF α-inducerad apoptos i gastric cancerceller. Här visade vi att knock-down av OLFM4 effektivt förbättras cell apoptos som svar på H 2O 2 eller TNF α stimulans i MKN45 liksom SGC-7901 celler, vilket tyder på att blockera OLFM4 kan öka känsligheten för magcancer celler på närvaron av H 2O 2 eller TNF α
Eftersom det är välkänt att kaspas-3, ett nyckel verkställande molekyl av apoptotiska vägen, spelar en kritisk roll i apoptotiska processer i en mängd olika. av celler. Vi undersökte ytterligare kaspas-3-aktivering i OLFM4 knockdown och HK kontrollceller i närvaro eller frånvaro av kaspas-inhibitor Z-VAD-fmk. Vi observerade att behandling av H 2O 2 eller TNF-a väsentligt uppreglerat kaspas-3-aktivitet i OLFM4 knockdown celler än HK kontrollceller medan förbehandling med Z-VAD-fmk omvänd kaspas-3-aktivitet samt som H 2O 2 eller TNF α-inducerad apoptos. Resultaten indikerar att H 2O 2 eller TNF α-inducerad apoptos i OLFM4 knockdown-celler är caspas-3-beroende. Baserat på nuvarande data är det tänkbart att uppregleras OLFM4 möjliggör gastric cancerceller att motstå apoptosinduktion genom att minska känsligheten för läkemedel mot cancer.
I själva verket har antagonister OLFM4 rapporterats hämma tillväxten i andra typer av cancerceller såsom humana pankreascancer PANC-1-celler [8] och mänskliga lung Caner SBC-1-celler [9]. Emellertid har kontroversiella resultat också observerats. Minskade OLFM4 mRNA inhiberar PANC-1-celler proliferation genom S för att G2 /M-fas stillestånd [8], som skiljer sig från våra resultat som visar fördröjd G1-fasen framsteg i magcancer. Vissa viktiga detaljerna (eller skäl) kan förklara denna skillnad. Först, som nyligen genomförda studier föreslås, kan en cell eller vävnadsspecifik roll OLFM4 (gastric cancerceller och pankreascancerceller) vara en övertygande förklaring till denna skillnad. Det mest anmärkningsvärda är, OLFM4 uttryck på mRNA-nivå men inte proteinnivå i PANC-1 celler med framgång mäts med hjälp av RT-PCR [8], medan den senaste rapporten av Kim et al. visade att Panc-1-celler har ingen OLFM4 mRNA-expression [25], vilket indikerar expressionsmönstret och roll OLFM4 genen i PANC-1-celler behöver ytterligare bekräftelse.
Trots OLFM4 ljuddämpnings visades en hämmande effekt på celltillväxt och en minskad motståndskraft mot H 2O 2 eller TNF α behandling i gastriska cancerceller, är det inte elimineras att andra mekanismer också kan regleras genom OLFM4 och bidrar till tillväxthämning och apoptos styrsignaleringen, med tanke på överhörning av nätet .

• Epidermal tillväxtfaktorreceptor strukturella förändringar i magcancer
• Uttryck av COX-2 och VEGF-C i magcancer: korrelationer med lymfangiogenes och prognostiska konsekvenser