Kiürülése OLFM4 gén gátolja a sejtnövekedést és növeli a szenzitizáció hidrogén-peroxid és a tumor nekrózis faktor-alfa által indukált-apoptózist gyomorrák cells

kiürülése OLFM4 gén gátolja a sejtnövekedést és növeli a szenzitizáció hidrogén-peroxid és a tumor nekrózis faktor-alfa által indukált-apoptózist gyomor- rákos sejtek
Abstract
alapon
emberi olfactomedin 4 (OLFM4) gén egy szekretált glikoprotein ismertebb nevén az anti-apoptotikus molekula GW112. OLFM4 kiderül, hogy gyakran up-szabályozott sokféle emberi tumorok, beleértve a gyomorrákot, és azt hitték, hogy fontos szerepet játszanak a progresszió gyomorrák. Bár a funkciója OLFM4 már jelzett számos tanulmány, újabb bizonyítékok erősen azt sugallja, egy sejt vagy szövet típusától függő szerepét OLFM4 a sejtnövekedés és apoptózis. A vizsgálat célja az, hogy megvizsgálja a szerepe a gyomorrák-specifikus expressziója OLFM4 a sejtek növekedését és az apoptózis ellenállás. Katalógusa módszerek katalógusa OLFM4 kifejezést kiküszöbölhető RNS interferencia SGC-7901 és MKN45 sejteket. Sejtburjánzást, rögzítés-független növekedés, sejtciklus és apoptózis jellemeztük in vitro. Tumorgenézisre elemeztük in vivo. Az apoptózis és a kaszpáz-3 aktiválását, válaszul a hidrogén-peroxid (H 2 O 2), vagy a tumor nekrózis faktor-alfa (TNF α) vizsgálatát jelenlétében vagy távollétében kaszpáz inhibitor Z-VAD-FMK.
Eredmények katalógusa eltávolításáról OLFM4 fehérje RNS interferencia SGC-7901 és MKN45 sejtek jelentősen gátolja tumorgenézisre in vitro és in vivo indukciója sejt G1 (összes P < 0,01). OLFM4 knockdown nem váltotta ki nyilvánvaló sejt apoptózist, de fokozott H 2 O 2 vagy TNF α-indukálta apoptózis és a kaszpáz-3 aktivitás (összes P < 0,01). Kezelés Z-VAD-FMK gyengített kaszpáz-3 aktivitás és jelentősen megfordította a H 2 O 2 vagy TNF α-indukált apoptózist OLFM4 akciós sejtekben (minden P < 0,01).
Következtetés
a tanulmány azt sugallja, hogy kimerülése OLFM4 jelentősen gátolja tumorgenézisre a gyomorrák SGC-7901 és MKN45 sejteket. Blokkoló OLFM4 kifejezés érzékennyé teheti gyomorrák sejtek H 2 O 2 vagy TNF α kezelés növeli a kaszpáz-3-függő apoptózis. A kombinált alapuló stratégia OLFM4 gátlás és rákellenes gyógyszerek kezelés rendelkezhetnek terápiás potenciállal gyomorrák beavatkozást.
Kulcsszavak
Gyomorrák Olfactomedin 4 RNS-interferencia Cell növekedés Apoptózis ellenállás alapon
Emberi OLFM4 (olfactomedin 4, más néven hGC-1, GW112), amelyet eredetileg nevezett humán klónozott mieloid prekurzor sejtek után granulocita kolónia-stimuláló faktor stimuláció [1], egy szekretált glikoprotein ismertebb nevén az anti-apoptotikus molekula GW112 [2, 3]. OLFM4 normálisan expresszálódik a csontvelőben, a prosztata, a vékonybél, a gyomor, a vastagbél és a hasnyálmirigy [1, 4]. Ezt követően, a megnövekedett OLFM4 szinteket is találtak a kripta epithelium gyulladt vastagbél-nyálkahártya gyulladásos bélbetegségek [5], és a gyomor biopsziák fertőzött Helicobacter pylori [6, 7]. Újabban felülszabályozott OLFM4 expresszióját leírták a tüdő és emlő [8], prosztata [3], gyomorrák [3, 9] és hasnyálmirigyrákban [8, 9], valamint a kolorektális adenoma [10-14].
Azt javasolták, hogy a OLFM4 részt vesz sejtes folyamat, mint az apoptózis és a tumornövekedést [2]. Bár a celluláris funkciója OLFM4 vizsgálták, ezek az eredmények nem mindig egybeesik. Overexpressziója OLFM4 kimutatták, hogy megkönnyítse egér prosztata tumor Tramp-C1 sejtek növekedése szingenikus C57 /BL6 egerek [2], de gátolják a humán prosztata rák PC-3 sejtek szaporodását [15]. Ezen túlmenően, akár szabályozott OLFM4 mutatott erős anti-apoptotikus aktivitás egér limfoid véna endoteliális SVEC sejtek és humán adenokarcinóma HeLa-sejtek [1, 2], mivel a legújabb eredmények azt javasolta egy proapoptotikus hatása OLFM4 humán mieloid leukémia HL-60 sejtek [16 ]. Bizonyíték ezen vizsgálatokból származó erősen azt sugallja, hogy a szerepek a OLFM4 a sejtek növekedését kontroll és az apoptózis függhet a sejt vagy szövet típusától [10, 13-15]. A mai napig azonban nagyon korlátozott adatok betöltött szerepére vonatkozó OLFM4 a sejtnövekedést és apoptózist profilok a gyomorrák sejtek tettek közzé.
A jelen vizsgálatban elemeztük OLFM4 fehérje expressziót gyomor rákos sejtek és a normális emberi gyomornyálkahártya GES-1 sejtek Western-blottal. Plazmid felhasználásával közvetített rövid hajtű RNS-t (shRNS), gátoltuk OLFM4 expresszió a gyomorrák SGC-7901 és MKN45 sejtek megfigyelni sejtburjánzást, sejtciklus fázisban, az apoptózis in vitro és annak értékelését, hogy tumorkeltő kapacitás in vivo. Azt is kutatták a apoptózis és a kaszpáz-3 aktiválását, válaszul a citotoxikus szerek, például H 2 O 2 vagy TNF α jelenlétében vagy távollétében kaszpáz inhibitor Z-VAD-FMK között OLFM4 knockdown sejtek és HK kontroll sejtek .
módszerek
Sejttenyésztés, reagensek és egerek
Az emberi gyomor rákos sejtek BGC-823, HGC-27, SGC-7901, MKN28, MKN45 és a humán normál gyomornyálkahártya GES-1 sejteket tartottunk fenn DMEM tápközegben (GibcoBRL, Gaithersburg, MD), amely 10% magzati borjúszérumot (FBS, Gibco BRL, USA), 100 U /ml penicillint és 100 ng /ml sztreptomicint tartalmazott. H 2 O 2 és TNF-α a Sigma cégtől (St. Louis, MO), és a Z-VAD-FMK vásároltunk a Calbiochem (San Diego, CA). BALB /C nude (nu /nu) egereket (4-6 hetesek, SPF mértékben, 20 ± 3 g) vásároltunk a Laboratory Animal Center Chongqing Orvostudományi Egyetem (Chongqing, Kína). Minden kísérleti eljárás szerint végzett nemzetközileg elfogadott etikai irányelvek (NIH publikáció sem. 85-23, átdolgozott 1985). Katalógusa plazmid konstrukciók és stabil transz katalógusa shRNS közvetített RNAi plazmid (pGenesil 1,1-siOLFM4) és egy kevert kontroll plazmid (pGenesil 1,1-HK) épültek leüt az endogén OLFM4 az SGC-7901 és MKN45 sejteket. Transzfekciót követően neomicint (G418) kiválasztása, OLFM4 knock-down SGC-7901-siOLFM4, MKN45-siOLFM4 sejtek és torzított SGC-7901-HK, MKN45-HK kontroll sejteket stabilan kapott, illetőleg (részletek látható kiegészítő fájl 1: Kiegészítő adatok).
RNS extrakció és kvantitatív RT-PCR (qRT-PCR) katalógusa Teljes RNS különböző sejtekben vagy xenograftok extraháljuk az RNeasy Mini Kit (Qiagen, CA, USA), majd ezt követte a cDNS-szintézis a ReverTra Ace-α-első szál cDNS szintézis rendszer (Toyobo, Osaka, Japán), mint a korábbi leírt [17]. Kvantitatív valós idejű PCR-t 7500 valós idejű PCR-rendszer (Applied Biosystems), SYBR-zöld, mint egy fluoreszcens festék (Toyobo, Osaka, Japán) (a részleteket látható Kiegészítő fájl 1: Kiegészítő adatok). Fold génexpressziós változásokat határoztuk meg a "2 - ddCT" módszer [18].
Cell proliferációs vizsgálat in vitro és a sejtek életképességét mérés
sejtproliferációt és a sejtek életképességét mértük sejtproliferációt WST-1 kit (Roche ) a gyártó utasításai szerint. A sejt-proliferáció, sejteket oltottunk sűrűségben 1 × 10 3 sejt per lyuk egy 96 lyukú lemezekre, és növesztjük 5 napon át. Az optikai sűrűség (450 nm) értéket alkalmazásával mutattuk Microplate Reader (TACAN, Szváziföld) naponta. Minden vizsgálatot három ismétléssel végeztük. Ami a mérésére a sejtek életképességét, a sejteket (1 × 10 4 /lyuk) oltottunk 200 ul média 96 lyukú lemezeken. 12 óra elteltével inkubálás H 2 O 2 vagy TNF α kezeltük a jelzett koncentrációkban. Relatív abszorbancia mértük leírtak a sejtburjánzás.
Rögzítéstől független növekedési vizsgálat
rögzítéstől független növekedését végeztünk lágy agar, hogy tükrözze az in vitro clonogenicity. Röviden, a sejteket (5 x 10 2) minden egyes kolónia szuszpendálunk 0,3% agart, DMEM, majd szélesztjük megszilárdított agaron (0,5%) 6-lyukú lemezeken. A sejteket 2 hétig 37 ° C-on, 5% CO 2, mielőtt a kolóniák mértük. Telepek számát megszámoljuk 200 × nagyítással öt mez®kre. Minden vizsgálatot három ismétléssel végeztük.
Áramlási citometriás analízis
Áramlási citometria (FCM) analízist végeztünk, hogy értékelje a sejtciklus előrehaladását, vagy az apoptózist. (A részleteket látható Kiegészítő fájl 1: Kiegészítő adat)
Caspase assay
enzimaktivitását kaszpáz-3 és -9 mértük egy fluorometriás assay szerint egy korábban ismertetett eljárással [8].
Western blot analízis
Western-blot vizsgálatot végeztünk a korábban leírtak szerint [17]. A következő antitesteket használtuk Western blot: anti-OLFM4 (ABCAM, Cambridge, UK) és anti-β-aktin (Santa Cruz, CA, USA) A relatív mennyisége fehérjék alkalmazásával elemeztük Quantity One szoftverrel (Bio-Rad, Hercules , CA, USA), és normalizáljuk, hogy a β-aktin (részletek látható Kiegészítő fájl 1: Kiegészítő adatok).
xenograft tumor modell
még csupasz egereket négy csoportra osztjuk véletlenszerűen. Mindegyik csoportot injektálunk szubkután a hátán a szuszpenzió 200 ul, amely 2 × 10 6 sejt fent említett, ill. A kötet a xenograftok sorozathígítást mérjük. Az egereket leöltük 35 nap után. A xenograftok kimetszettük és lemértük. A gátlás mértékét xenograftjait számított képlet szerint: gátlási aránya (%) = 1-az átlagos testtömeg (OLFM4 leüt sejtek injekciózott csoport vagy HK kontroll sejtekben injekciózott csoport) /átlag súly (HK kontroll sejtek injekciózott csoport) × 100% -os. Ezután a tumorszövet volt kitéve teljes RNS izolálás vagy immunhisztokémiai detektálás.
Immunhisztokémiai (IHC)
OLFM4 fehérjék xenograftok analizáltuk felhasználásával IHC nyúl-anti OLFM4 (ABCAM, Cambridge, Egyesült Királyság) (a részleteket látható Kiegészítő fájl 1: Kiegészítő adatok).
Statisztika
származó adatok egymástól független kísérlet fejeztük az átlag ± SD legalább három kísérletek. Az összehasonlítást a két csoport között elemeztük kétfarkú Student t katalógusa próba vagy ANOVA, adott esetben, és p értékek < 0,05 tekintettük statisztikailag szignifikánsnak. Katalógusa Eredmények
Hatékony leüt a OLFM4 gén plazmid közvetítette siRNS gyomorrák sejtek katalógusa OLFM4 fehérje expressziós mintázatot vizsgálták gyomorrák BGC-823, HGC-27, SGC-7901, MKN28, MKN45 sejtek és a normális GES-1 kontroll sejtek (1A). OLFM4 fehérje határozottan kifejezi mindezen gyomor rákos sejteket, és GES-1 sejtekben. Különösen SGC-7901 és MKN45 sejtek expresszálták viszonylag magas szintjét OLFM4 fehérje, mint más gyomor rákos sejteket, és GES-1 sejtekben. Ezért SGC-7901 és MKN45 sejteket választottuk a további vizsgálatokhoz. 1. ábra A hatékony kiütése OLFM4 RNS interferencia gyomorrákban SGC-7901 és MKN45 sejteket. A. expressziója OLFM4 fehérje különböző gyomor rákos sejtvonalak. Expressziós profilja OLFM4 fehérje alkalmazásával analizáltuk Western-blot a β-aktin belső kontrollként. GES-1-sejteket szolgáltak normál kontroll sejteket. B. OLFM4 mRNS expresszió OLFM4 akciós sejtekben. Relatív expresszióját OLFM4 detektáltuk QRT-PCR. β-aktin használtunk belső kontrollként. Fold változások OLFM4 mRNS expressziójának meghatározását végeztük 2-ΔΔCt módszerrel. C. OLFM4 fehérje expresszió OLFM4 akciós sejtekben. OLFM4 fehérje expresszióját detektáltuk Western-blottal. p-aktin-fehérjét használtunk belső kontrollként. Képviselői három kísérlet látható. ** P < 0,01 vs. HK kontroll sejtek csoport (n = 3).
Lefelé szabályozni OLFM4 expressziós plazmid-mediált shRNS célzási OLFM4 gént stabilan leüt OLFM4 expresszió SGC-7901 és MKN45 sejteket. Amint az 1B ábra, OLFM4 mRNS-szintek szignifikánsan csökkent az SGC-7901-siOLFM4 és MKN45-siOLFM4 sejtek összehasonlítva a HK kontroll vagy szülői sejteket (P < 0,01). Ezek az eredmények tovább erősítette western blot analízis (1C). Nincs szignifikáns különbség a OLFM4 expresszió volt megfigyelhető a szülői és a HK kontroll sejtek. A szintek mRNS és fehérje a β-aktin hasonló volt a különböző csoportokat. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy egy plazmid-mediált OLFM4-siRNS lehet specifikusan és hatékonyan leüt OLFM4 szinten gyomor rákos sejtekben. Mivel az elemzés a fenti, ezért OLFM4 leüt sejtek és HK kontroll sejteket választottuk ki a további vizsgálatot.
OLFM4 knockdown gátolja a gyomorrák sejt proliferáció és rögzítéstől független növekedését in vitro
meghatározásához szerepének OLFM4 a gyomor a rákos sejtek növekedését, megvizsgáltuk a hatását OLFM4-siRNS a sejtszaporodást, 1-5 nap időpontban által WST-1 vizsgálati eljárásban. Amint azt a 2A ábra, minden két gyomor rákos sejtvonalak, a növekedés a OLFM4 leüt sejtek szignifikánsan csökkent összehasonlítva HK kontroll sejtek 3. nap (P < 0,01). Ahhoz, hogy tovább vizsgálja a jelentőségét OLFM4 tumorigenezis gyomorrák sejtek in vitro végeztünk kötött növekedés vizsgálatok és megállapították, SGC-7901 és MKN45 kifejező sejtek HK kontrollok jól nőttek lágyagarban, alkotó különálló telepeket. Ezzel szemben, a OLFM4 knockdown SGC-7901 és MKN45 sejteket mutatott drámai számának csökkenése a lágy agar telepek (P < 0,01) (2b ábra), azt mutatja, átalakítja képességeit kisebb, mint a kontroll sejtek. Ezek az adatok azt mutatták, hogy knock-down a OLFM4 gátolhatja gyomorrák sejtek szaporodását és rögzítéstől független növekedését in vitro. 2. ábra kiütése OLFM4 gátolja a SGC-7901 és MKN45 sejtek in vitro és in vivo. A. Cell növekedési görbe. Sejtek proliferációját in vitro mértük a sejtek növekedési görbe által meghatározott, megszámoljuk a sejtek számát (WST-1 vizsgálati eljárással) Az SGC-7901 sejtek (bal panel) és MKN45 sejtek (jobb panel). Az OD értéket (450 nm) megszámoltuk a jelzett napokon és bemutatott, mint az átlagos sejtszám (n = 3). B. rögzítéstől független növekedését lágy agáron. Reprezentatív képek három kísérlet mutattak (felső panel). Az adatok átlagát jelentik megszámolt telepek 200 × nagyítású 5 véletlen mezők (alsó panel). C. Az átlagos tumortérfogat szubkután injekció után a meztelen egerek HK kontroll vagy OLFM4 knockdown sejtek mértük a jelzett időpontokban. D. Képviselő daganatok képek követő 35 napon szubkután injekció jelzett sejtek. E. tumor átlagos tömege (bal panel) és gátló arány (jobb panel) a tumor xenograftok. Az adatok képviselik a tumor átlagos súlya xenograftok (átlag ± SD, n = 10). ** P < 0,01 vs. HK kontrollcsoportban.
Szaporodást gátló hatása csökkent OLFM4 gyomor tumor xenograftok
Sőt, azt is végeztünk szubkután tumor formatív assay nude egerekben, hogy értékelje a növekedés elnyomása hatását alulszabályozott OLFM4 in vivo. Meztelen egerekbe szubkután injektált OLFM4 knockdown vagy HK kontroll sejtek. Tumor térfogatot 4 nap és a tumor tömege 5 hetes mértük illetve szubkután injekció után. Amint az ábra 2C-D, akár tumor térfogata vagy a tumor tömege által termelt OLFM4 leüt SGC-7901 és MKN45 sejtek szignifikánsan csökkentette a növekedést képest tumorok előállított injektált egerekben HK ellenőrző-transzfektált sejtek (P < 0,01). A gátló aránya SGC-7901 és MKN45 leüt sejtek injekciózott csoport tumor növekedés 40,29% és 37,48% volt (ábra 2E).
További biztosítása OLFM4 kifejezést indeedly hangtompítós szubkután injekció után nude egerek, mi is értékelték OLFM4 kifejezést xenograftok használata qRT-PCR és IHC. Hasonlóképpen az in vitro, OLFM4 mRNS szinten xenograftok által termelt OLFM4 knockdown sejtek szintén jelentős csökkenést mutatott összehasonlítva HK kontroll tumorok xenograftok (P < 0,01) (3A ábra). Összhangban az eredmények a QRT-PCR, jelentős csökkenését OLFM4 fehérje is megfigyelhető volt xenograftok IHC (P < 0,01) (3B és 3C). Magasabb szürkeárnyalatos és erősebb pozitív jel DAB megjelenítés találtak xenograftok HK kontroll sejtek injekciózott csoport. Éppen ellenkezőleg, a gyenge barna festődés volt megfigyelhető tumor xenograftok a OLFM4 knockdown sejtek injekciózott csoport. Továbbá, több nagy nekrózis régióban volt megfigyelhető tumor xenograftok által termelt HK kontroll sejtek miatt gyors növekedése a HK kontroll sejtek (3B, ábra felső panel). Ezek az adatok egyértelműen azt jelzi, hogy OLFM4 kifejezés mRNS és fehérje szinten stabilan gátolta valóban in vivo. Taken együttesen mind in vitro és in vivo kísérletek arra utalnak, hogy OLFM4 knockdown gátolja a gyomor rákos sejteket. 3. ábra qRT-PCR és IHC kimutatása OLFM4 a xenograftok. A. QRT-PCR számára OLFM4 mRNS tumor xenograftok. Fold változások OLFM4 mRNS alkalmazásával határoztuk meg a 2-ΔΔCt módszerrel. p-aktin gén használtuk belső kontrollként. B. H &E festés (felső panel), és IHC számára OLFM4 fehérje (alsó panel) a tumor xenograftok. Reprezentatív képek (200 ×) jelennek meg. N, nekrózis. C. számszerűsítése elemzése OLFM4 kifejezés. Az átlagos érték mértük öt véletlenszerűen különböző területeken a mikroszkóp alatt (400 ×) az Image-Pro Plus V6.0. Az adatokat átlag ± SD. ** P < 0,01 vs. HK kontrollcsoportban.
OLFM4 knock-down késések G1-S átmenet, de nem vált ki nyilvánvaló apoptózist gyomor rákos sejtek
Tekintettel a megfigyelt gátló hatást a sejtnövekedésre in vitro és in vivo, próbálták meghatározni e fokozott apoptózis, vagy késleltetett sejtciklus progresszióját járt növekedés gátlást. Először értékelte a hatása csökkent OLFM4 sejtciklus progresszióját. Amint a 4A ábrán látható, mindkét OLFM4 knockdown SGC-7901 és MKN45 sejtek szignifikáns megnövekedett számú G1 fázisban, és csökkent a számok S fázisban, ellentétben a HK kontrollsejtek (P < 0,01). Nem volt lényeges különbség figyelhető meg a G2 /M-fázisú, jelezve, egy tipikus G1-késést a sejtciklus. 4. ábra értékelése sejtciklus eloszlása, apoptózis és a kaszpáz-3/9 aktiváció OLFM4 leüt gyomor rákos sejteket. A. Sejtciklus analízis. Változások a sejtciklus eloszlása ​​SGC-7901-HK, SGC-7901-siOLFM4 és MKN45-HK, MKN45-siOLFM4 sejteket elemeztük FCM. Az adatok átlagát jelentik százalékos sejtciklus fázisára eloszlás (n = 3). B. Cell apoptózis elemzést. Az apoptózis megbecsültük AnnexinV-PE /7-AAD festés FCM. Az adatok középértékek apoptotikus sejtek százalékos aránya (n = 3). C. A kaszpáz-3 és -9 aktiválás. A kaszpáz-3, 9 aktiválás között jelzett sejtek láthatók. ** P < 0,01 vs. HK kontroll csoport.
Annak megállapításához, hogy az apoptózis szerepet játszik a növekedés gátlás, mi következő végeztünk sejtek apoptózisát elemzést. Érdekes módon, csökkentett OLFM4 kifejezés nem vezethet jelentős változásokat apoptózis (4b ábra), ami összhangban van a sejtciklus analízis nem mutat látható sub-G1 fázisban a vizsgált sejtekben. További vizsgálatának elváltozásai apoptotikus jelek, a kaszpáz-3 /-9 aktivitást is azonosítottak kolorimetriás aktivációs vizsgálati eljárásokban. Mindkét kaszpáz-3 és -9 aktiválások nem mutatott jelentős változást követően kiütése OLFM4 az SGC-7901 és MKN45 sejtek (4C). Ezek az eredmények azt sugallják, hogy down-regulációja OLFM4 fejthet ki inhibitor hatást a sejtek növekedését szabályozó sejtciklus progresszióját nem járó apoptózist gyomor rákos sejtekben.
Deléciója OLFM4 érzékennyé gyomorrák sejtek H2O2 vagy TNF α-indukálta apoptózis
a különböző hatása H 2 O 2 vagy TNF α az apoptózis közötti OLFM4 leüt és HK kontroll sejteken is vizsgáltuk. OLFM4 leüt, vagy HK kontroll sejteket kezeltünk 10, 100 és 1000 uM H 2 O 2, vagy 5, 10 és 50 ng /ml TNF-α ill. A sejtek életképességét és apoptózist értékelték. Amint az 5A ábra-D, dózis-függő csökkenést sejtek életképességének volt megfigyelhető H 2 O 2 vagy TNF α-kezelt OLFM4 leüt sejteket. Továbbá, a kezelés 10 | iM H 2 O 2 (5A ábra-B) vagy 10 ng /ml TNF-α (5C-D) vezetett jelentős csökkenését a sejt életképességet OLFM4 knock down sejteket összehasonlítva HK kontroll sejtek (P < 0,01). Különösen érdekes az a megállapítás, hogy OLFM4 knockdown sejtek helyett HK kontroll kezelt sejtek 10 ~ 1000 uM H 2 O 2 kiállítva több kiemelkedő apoptotikus százalékok képest kezelt PBS-sel mock (P < 0,01) ( 5A ábra-B). Hasonló eredményeket is megfigyelhető a TNF α-val kezelt OLFM4 knockdown sejtek (ábra 5c-D). Más szóval, OLFM4 leüt fokozott H 2 O 2 vagy TNF α-indukált apoptózist gyomor rákos sejtekben, jelezve törlését OLFM4 készült SGC-7901 és MKN45 sejtek sokkal érzékenyebbek a kezelésére H 2O 2 vagy TNF α. 5. ábra válasza OLFM4 knockdown SGC-7901 és MKN45 sejtek apoptózis-indukáló ágensek H 2 O 2 vagy TNF α. OLFM4 knockdown és a HK kontroll sejteket kezeltük H2O2 (A és B) vagy TNF α (C és D), mint jelzett dózisban 12 órán át. A sejtek életképességét úgy mértük, WST-1 vizsgálati eljárással (A-D bal panelek), és kifejezhető az átlag OD érték (450 nm) (n = 3). A százalékos az apoptotikus sejtek határoztuk meg FCM (A-D jobb panelek) és kifejezve azt jelenti, apoptotikus százalékos (n = 3). * P < 0,05, ** P < 0,01 vs. HK kontrollcsoportban.
A kaszpáz-3 aktivitás szerepet játszik a H2O2 vagy TNF α-indukált apoptózist OLFM4 knock-down sejtek
A fenti eredmények azt mutatják, hogy leüt a OLFM4 növelheti H 2O 2 vagy TNF α-stimulált apoptózist. Ahhoz, hogy tovább ellenőrzésére, hogy a kaszpáz-3 aktiválódik a H 2 O 2 vagy TNF α indukálta apoptózist OLFM4 akciós sejtekben, mi mellett észlelt kaszpáz-3 aktiváció H 2 O 2 vagy TNF a-kezelt sejtek kolorimetriás vizsgálattal. Amint a 6a ábrán látható, a kezelés a H 2 O 2 vagy TNF α eredményezett sokkal fokozása a kaszpáz-3 aktivitás OLFM4 akciós sejtekben, mint HK kontroll sejteket (P < 0,01), ami arra utal, a kaszpáz-3 aktivitás részt vesz a H 2 O 2 vagy TNF α-indukált apoptózist OLFM4 akciós sejtekben. Annak további igazolására, hogy a H 2 O 2 vagy TNF α-indukálta apoptózis függ kaszpáz-3 aktivitás, Z-VAD-FMK, egy kaszpáz inhibitort alkalmaztunk a kezelés előtt a H 2 O 2 vagy TNF α. Előkezelése Z-VAD-FMK szignifikánsan csökkenti H 2 O 2 vagy TNF α-indukálta apoptózis, valamint a kaszpáz-3-aktivitást mindkét OLFM4 knockdown sejteket (P < 0,01) (ábra 6C-D ), ami azt jelzi, hogy a H 2 O 2 vagy TNF α indukálta apoptózis kaszpáz-3 dependens OLFM4 akciós sejtekben. 6. ábra bevonása a kaszpáz-3 aktivitást H 2 O 2 vagy TNF α-indukált apoptózist OLFM4 knockdown SGC-7901 és MKN45 sejteket. (A-B) A megnövekedett kaszpáz-3 aktivitás H2O2 vagy TNF α-kezelt OLFM4 knockdown sejtekben. OLFM4 knockdown és HK-kontroll sejteket kezeltünk 10 jiM H2O2 (A) vagy 10 ng /ml TNF-α (B) 12 órán át. A kaszpáz-3 aktivitást mértük kolorimetriás vizsgálattal és kifejezett szeres változásokat. ** P < 0,01 versus PBS mock csoport (n = 3). (C-D) Fordított sejt apoptózis kaszpáz inhibitort OLFM4 akciós sejtekben. A sejteket kezeltük H2O2 vagy TNF α egyedül a jelzett dózisokban, mint fent említettük, vagy előkezelt 20 uM Z-VAD-FMK 2H előtt H2O2 vagy TNF α kezelést. Az apoptotikus sejtek százalékát határoztuk meg FCM. Az adatok képviselik a átlag ± SD három független kísérlet során. ** P < 0,01 vs. H2O2 (C) vagy TNF α (D) kezelt OLFM4 knockdown sejtek csoportja. Katalógusa Vita katalógusa Mostanában egyre több adat bizonyította OLFM4 gyakran túlzott mértékben a sokféle emberi daganatok, így például a gyomorrák, és azt hitték, hogy döntő szerepet játszanak a fejlesztés és progressziójában gyomor karcinogenezis [19, 20]. Bár a korábbi tanulmányok kimutatták, hogy OLFM4 részt vesz az apoptózis és a tumornövekedést, a legutóbbi megfigyelések arra is utalnak, hogy a sejt vagy szövet-specifikus hatások léteznek OLFM4 gént. Viszonylag kevéssé ismert e a tumor növekedését és az apoptózis mögöttes gyomorrák-specifikus OLFM4 kifejezést. Hogy jobban megértsék ezt a szerepet a megváltozott OLFM4 humán gyomorrák, kísérleti támogatásra van szükség, hogy érvényesítse a szerepe a OLFM4 gén gyomorrákban.
Bebizonyosodott, hogy az abnormális expressziója hGC-1 lehet szabályozni a transzkripciós vagy poszttranszkripciós szinten [13]. A mi jelen működik, meg közvetlenül vizsgáltuk OLFM4 fehérje expressziós mintázatot gyomor rákos sejtekben és a normál GES-1 sejtekben. SGC-7901 és MKN45 expresszáló sejtek relatív magas OLFM4 szinteket választottunk ezen vizsgálatokra. Mivel csökkentve a célgén expressziójának genetikai úton létrehozott sejtvonalak hasznos jobb megértése, valamint annak szerepe fenntartásában malignus fenotípus különösen elemzésében gének, amelyek nélkülözhetetlenek a celluláris túlélés [21], generáltunk stabil klón medencék SGC-7901 és MKN45 kifejező OLFM4-siRNS vagy rántotta HK ellenőrzést a plazmid-alapú megközelítés siRNS és megerősítette knock-down hatékonyságát OLFM4 gén mRNS és fehérje szinten qRT-PCR és western blot.
jelen munkák azt mutatják, hogy OLFM4 játszik lényeges szerepet gyomorrák tumorogenezisben. Kiütése OLFM4 gátolja a sejtproliferációt és rögzítéstől független növekedési képesség in vitro. Xenograft tumor modellben in vivo is jelenti, hogy a csökkent OLFM4 is gátolja a tumor növekedését a humán gyomor rákos sejteket. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy OLFM4 döntő szerepet játszik a sejtproliferációban a gyomor rákos sejteket. Eredményeink azt is megfigyelték, hogy knock-down a OLFM4 nem befolyásolta az arány az apoptózis és a kaszpáz-3 és 9 aktiválások a OLFM4 knockdown sejtekben, ami arra utal, hogy az apoptózis lehet, hogy nem a mechanizmus alapjául a gátlását a tumor növekedését. Így azt feltételezik, hogy OLFM4 kifejezés nem lényeges az rákos sejtek túlélését, amely összhangban van egy nemrégiben megfigyelés, hogy a genetikai knock-out egerek OLFM4 mutatnak normális fejlődéshez és a hematopoietikus fenotípusok [17]. Ahhoz, hogy tovább jellemezzük az alapjául szolgáló mechanizmus növekedés gátlást végeztünk sejtciklus elemzési és kimutatták, hogy gátolja a OLFM4 expresszió indukált gyomor rákos sejtek felhalmozódni G1 fázisban a sejtciklus, ami arra utal, hogy a lefelé szabályozni OLFM4 fejthet ki inhibitor hatást a sejtek növekedését egy mechanizmust szabályozó sejtciklus előrehaladását nem járó apoptózist gyomor rákos sejtekben.
ellenállás a tumorsejtek az az apoptózis indukciója az egyik fő tényező felelős a hiba a sok hagyományos daganatellenes terápiák, amelyek a rákellenes szerek és a sugárzás. Ezért apoptózist kontroll a ráksejtekben a kritikus biológiai és klinikai jelentősége [22, 23]. Anti-apoptotikus aktivitás másik fontos funkciója OLFM4 gén [2]. Különösen H 2 O 2-indukált celluláris apoptózis gyengítette túlexpresszált OLFM4 egy prosztatarák sejtvonal [2]. Sőt, MKN45-sejtekről kimutatták, hogy képesek az ellenállás a TNF α-indukált apoptózis [24]. Mivel ezek a megállapítások, feltételezzük, hogy kiütése OLFM4 expresszió fokozására H 2 O 2 vagy TNF α-indukált apoptózist gyomor rákos sejtekben. Itt azt mutatta, hogy knock-down a OLFM4 hatékonyan fokozott sejt apoptózis válaszul H 2 O 2 vagy TNF α stimulálás MKN45 valamint SGC-7901 sejteket, ami arra utal, blokkoló OLFM4 növelheti a hajlamot a gyomorrák sejtek jelenléte H 2 O 2 vagy TNF α.
Mint az jól ismert, hogy a kaszpáz-3, egy kulcsfontosságú végrehajtó molekulája az apoptotikus útvonalak, kritikus szerepet játszik az apoptotikus folyamatokban különféle sejtek. Mi tovább vizsgáltuk a kaszpáz-3 aktiváció OLFM4 akciós és HK kontroll sejtek jelenlétében vagy távollétében kaszpáz inhibitor Z-VAD-FMK. Megfigyeltük, hogy a kezelés a H 2 O 2 vagy TNF alfa szignifikánsan felülszabályozott A kaszpáz-3 aktivitás OLFM4 akciós sejtekben, mint HK kontrollsejtekben míg előkezelés Z-VAD-FMK fordított kaszpáz-3 aktivitás is mint a H 2 O 2 vagy TNF α indukálta apoptózist. Az eredmények azt jelzik, hogy a H 2 O 2 vagy TNF α-indukált apoptózist OLFM4 akciós sejtekben a kaszpáz-3-függő. Alapján a jelenlegi adatok, akkor elképzelhető, hogy up-regulációját OLFM4 lehetővé gyomorrák-sejtek, hogy ellenálljon az apoptózis indukció, mivel csökkenti a hajlamot rákellenes gyógyszerek.
Valójában antagonistái OLFM4 leírták, hogy gátolja a proliferációt másokban típusú rákos sejtek, például humán hasnyálmirigyrák PANC-1-sejteket [8] és az emberi tüdő Caner SBC-1-sejteket [9]. Azonban, ellentmondásos eredményeket is megfigyelték. Csökkent OLFM4 mRNS gátolják PANC-1 sejtek szaporodásának S G2 /M fázis leállását [8], amely eltér az eredményeink mutatják késleltetett G1 fázisban előrehaladást gyomorrák. Egyes fontos részleteket (vagy okok) megmagyarázhatja ezt az eltérést. Először is, ahogy a legutóbbi vizsgálatok azt, egy sejt vagy szövet speciális szerepét OLFM4 (gyomor rákos sejteket, és a hasnyálmirigy-rák sejtek) lehet egy meggyőző magyarázatot ezt az eltérést. A leginkább figyelemre méltó az, OLFM4 kifejezés mRNS-szinten, de nem fehérje szinten PANC-1 sejtekben sikeresen mérjük RT-PCR [8] mivel a legutóbbi jelentés szerint Kim et al. azt mutatta, hogy PANC-1 sejtek nem OLFM4 mRNS expresszióját [25], jelezve, az expressziós mintázata és szerepe OLFM4 gén PANC-1 sejtekben van szüksége további megerősítést.
ellenére OLFM4 hangtompító kimutatták, hogy gátló hatással a sejtnövekedésre és a csökkent ellenállás H 2 O 2 vagy TNF α kezelés gyomorrák-sejtek, akkor nem eliminálódik, hogy más mechanizmusok is szabályozzák OLFM4 és hozzájárul a növekedés gátlás és apoptózis vezérlő jelzés, figyelembe véve az áthallás a hálózat .

• Epidermális növekedési faktor receptor szerkezeti változásokat hozott gyomorrák
• Kifejezések a COX-2 és a VEGF-C gyomorrák: korrelációt lymphangiogenesis és prognosztikai jelentősége