Déplétion du gène OLFM4 inhibe la croissance cellulaire et augmente la sensibilisation au peroxyde d'hydrogène et de facteur de nécrose tumorale-alpha induit l'apoptose dans les cellules cancéreuses gastriques

Déplétion du gène OLFM4 inhibe la croissance cellulaire et augmente la sensibilisation au peroxyde d'hydrogène et de facteur de nécrose tumorale-alpha induit l'apoptose dans les cellules cancéreuses gastriques
fond
humain Résumé olfactomédine 4 (OLFM4), le gène est une glycoprotéine sécrétée plus communément connu en tant que molécule anti-apoptotique GW112. OLFM4 se révèle souvent régulé à la hausse dans de nombreux types de tumeurs humaines, y compris le cancer gastrique et il a été considéré jouer un rôle important dans la progression du cancer gastrique. Bien que la fonction de OLFM4 a été indiqué dans de nombreuses études, des données récentes suggèrent fortement une cellule ou d'un tissu dépendant du type de rôle OLFM4 dans la croissance cellulaire et l'apoptose. Le but de cette étude est d'examiner le rôle de l'expression spécifique du cancer gastrique de OLFM4 dans la croissance cellulaire et la résistance à l'apoptose.
Méthodes
OLFM4 expression a été éliminé par l'interférence ARN dans SGC-7901 et les cellules MKN45. La prolifération cellulaire, la croissance indépendante de l'ancrage, le cycle cellulaire et l'apoptose ont été caractérisées in vitro. On a analysé la tumorigénicité in vivo. L'apoptose et de caspase-3 activation en réponse au peroxyde d'hydrogène (H 2 O 2) ou de facteur de nécrose tumorale alpha (TNF α) ont été évaluées en présence ou en l'absence d'un inhibiteur de la caspase Z-VAD-fmk.
Résultats
L'élimination des protéines OLFM4 par l'interférence d'ARN dans SGC-7901 et les cellules MKN45 inhibe de manière significative la tumorigénicité in vitro et in vivo par l'induction de la cellule G1 arrêt (tous les P < 0,01). OLFM4 effet de choc n'a pas déclenché l'apoptose cellulaire évidente, mais a augmenté H 2 O 2 ou de TNF α-apoptose induite et activité caspase-3 (tous les P < 0,01). Traitement de Z-VAD-fmk atténuée activité caspase-3 et inversé de manière significative la H 2O 2 ou TNF apoptose dans les cellules knockdown OLFM4 induite par α-(tous P < 0,01).
Conclusion
Notre étude suggère que l'épuisement des OLFM4 inhibe de manière significative la tumorigénicité du cancer gastrique SGC-7901 et les cellules MKN45. Blocage OLFM4 expression peut sensibiliser les cellules de cancer gastrique à H 2O 2 ou TNF α traitement en augmentant la caspase-3 apoptose dépendante. Une stratégie de combinaison basée sur OLFM4 traitement inhibition et médicaments anticancéreux peut fournir un potentiel thérapeutique dans l'intervention de cancer de l'estomac.
Mots-clés
cancer gastrique olfactomédine 4 ARN OLFM4 humain
croissance interférence cellulaire Apoptose résistance Background (olfactomédine 4, également connu sous le nom hGC-1, GW112), initialement appelé humain clone à partir de cellules précurseurs myéloïdes après stimulation des granulocytes facteur de stimulation des colonies [1], est une glycoprotéine sécrétée plus communément connu en tant que molécule anti-apoptotique GW112 [2, 3]. OLFM4 est normalement exprimé dans la moelle osseuse, de la prostate, l'intestin grêle, de l'estomac, du côlon et du pancréas [1, 4]. Par la suite, l'augmentation des niveaux OLFM4 ont également été trouvés dans l'épithélium de la crypte de la muqueuse du côlon enflammé des maladies inflammatoires de l'intestin [5] et dans les biopsies gastriques infectés par Helicobacter pylori [6, 7]. Plus récemment, l'expression régulée à la hausse OLFM4 a été décrite dans le poumon et du sein [8], de la prostate [3], de l'estomac [3, 9] et les cancers du pancréas [8, 9], ainsi que dans les adénomes colorectaux [10-14].
Il a été suggéré que OLFM4 est impliquée dans le processus cellulaire, tels que l'apoptose et la croissance tumorale [2]. Bien que la fonction cellulaire de OLFM4 a été étudiée, ces résultats ne sont pas toujours confondus. La surexpression de OLFM4 a été montré pour faciliter la tumeur de la prostate TRAMP-C1 croissance des cellules de souris chez les souris C57 /BL6 syngéniques [2], mais inhiber le cancer de la prostate PC-3 prolifération cellulaire humaine [15]. En outre, régulée à la hausse OLFM4 a montré une forte activité anti-apoptotique dans lymphoïdes de la souris veine endothéliales cellules SVEC et adénocarcinome humain cellules HeLa [1, 2], alors que les résultats récents ont suggéré un effet pro-apoptotique de OLFM4 dans les cellules HL-60 de leucémie myéloïde humaines [16 ]. La preuve de ces études suggèrent fortement que les rôles de OLFM4 dans le contrôle de la croissance cellulaire et l'apoptose peuvent dépendre de la cellule ou un tissu de type [10, 13-15]. À ce jour, cependant, très peu de données concernant le rôle de OLFM4 dans la croissance cellulaire et les profils de l'apoptose des cellules de cancer gastrique a été publiée.
Dans la présente étude, nous avons analysé OLFM4 expression de la protéine dans les cellules de cancer gastrique et épithéliale gastrique humain normal GES-1 cellules par western blot. En utilisant l'ARN court en épingle à cheveux plasmidique (shRNA), nous inhibés OLFM4 expression dans le cancer gastrique SGC-7901 et MKN45 cellules pour observer la prolifération cellulaire, la phase du cycle cellulaire, l'apoptose in vitro et d'évaluer sa capacité tumorigène in vivo. Nous avons également étudié l'apoptose et de caspase-3 activation en réponse à des agents cytotoxiques tels que H 2 O 2 ou de TNF α en présence ou en l'absence d'un inhibiteur de la caspase Z-VAD-fmk entre les cellules knock-down OLFM4 et des cellules de contrôle HK .
Méthodes
culture cellulaire, les réactifs et les souris
Les cellules cancéreuses gastriques humaines BGC-823, HGC-27, SGC-7901, MKN28, MKN45 et épithéliales gastriques humaines normales GES-1 cellules ont été maintenues milieu DMEM (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) contenant 10% de sérum fœtal bovin (FBS, Gibco BRL, Etats-Unis), 100 U /ml de pénicilline et 100 ug /ml de streptomycine. H 2O 2 et le TNF-α ont été obtenus auprès de Sigma (St. Louis, MO) et Z-VAD-fmk a été acheté auprès de Calbiochem (San Diego, CA). nude (nu /nu) souris BALB /C (4-6 semaines, le degré de SPF, 20 ± 3 g) ont été achetés chez Laboratory Animal Center de l'Université médicale de Chongqing (Chongqing, Chine). Toutes les procédures ont été menées conformément aux lignes directrices éthiques internationalement acceptées (publication NIH no. 85-23, révisé 1985) du. Plasmide construit et transfection stable
shRNA médiation plasmidique ARNi (pGenesil 1,1-siOLFM4) et un contrôle brouillé plasmide (pGenesil 1,1-HK) ont été construits pour abattre l'OLFM4 endogène dans SGC-7901 et les cellules MKN45. Après la transfection et la néomycine (G418) sélection, OLFM4 knock-down SGC-7901-siOLFM4, les cellules MKN45-siOLFM4 et brouillés SGC-7901-HK, les cellules de contrôle MKN45-HK ont été obtenu de manière stable, respectivement (détails présentés dans le fichier supplémentaire 1: supplémentaire données).
extraction d'ARN et RT-PCR quantitative (qRT-PCR)
ARN total dans des cellules ou des xénogreffes de tumeurs diverses a été extrait en utilisant le kit RNeasy Mini (Qiagen, CA, USA), et a été suivie par la synthèse d'ADNc en utilisant le système de synthèse d'ADNc brin ReverTra As-α-premier (Toyobo, Osaka, Japon) que précédemment décrit [17]. PCR quantitative en temps réel a été réalisée en utilisant 7500 système PCR en temps réel (Applied Biosystems) avec SYBR-Green comme un colorant fluorescent (Toyobo, Osaka, Japon) (détails affichés dans les fichiers supplémentaires 1: données supplémentaires). Plier les changements dans l'expression génique ont été déterminées en utilisant le "2 - DDCT." Méthode [18]
dosage de prolifération cellulaire dans la mesure in vitro et la viabilité des cellules
la prolifération cellulaire et la viabilité cellulaire a été mesurée en utilisant prolifération cellulaire kit de WST-1 (Roche ) selon les instructions du fabricant. La prolifération cellulaire, les cellules ont été ensemencées à une densité de 1 x 10 3 cellules par puits d'une plaque 96 puits et cultivées pendant 5 jours. La valeur de densité optique (450 nm) a été détectée en utilisant le lecteur de microplaques (Tacan, Swaziland) par jour. Chaque essai a été réalisé en trois exemplaires. En ce qui concerne la mesure de la viabilité des cellules, les cellules (1 x 10 4 /puits) ont été ensemencées à raison de 200 ul de milieu dans des plaques à 96 puits. Après 12 heures d'incubation, H 2O 2 ou TNF α a été traité dans des concentrations indiquées. absorbance relative a été mesurée comme décrit dans la prolifération cellulaire.
essai de croissance indépendante de l'ancrage
croissance indépendante de l'ancrage a été effectué sur de la gélose molle pour tenir compte de la clonogénicité in vitro. En bref, les cellules (5 x 10 2) à partir de chaque colonie ont été mis en suspension dans de la gélose à 0,3% dans du DMEM puis étalées sur de la gélose solidifiée (0,5%) dans des boîtes à 6 puits. Les cellules ont été mises en incubation pendant 2 semaines à 37 ° C dans 5% de CO 2 avant que les colonies ont été mesurées. Nombre de colonies a été compté à 200 × grossissement pour cinq champs aléatoires. Chaque essai a été réalisé en trois exemplaires.
Cytométrie de flux
cytométrie de flux (FCM) L'analyse a été effectuée pour évaluer la progression du cycle cellulaire ou l'apoptose. (Détails présentés dans le fichier supplémentaire 1: données supplémentaires)
Caspase dosage
activité enzymatique de la caspase-3 et -9 a été mesurée en utilisant un dosage fluorométrique selon un procédé décrit précédemment [8]
analyse par Western blot.
par Western blot a été effectuée comme décrit précédemment [17]. Les anticorps suivants ont été utilisés pour western blot: anti-OLFM4 (Abcam, Cambridge, Royaume-Uni) et anti-β-actine (Santa Cruz, CA, USA) La quantité relative des protéines a été analysée à l'aide Quantité Un logiciel (Bio-Rad, Hercules , CA, USA) et normalisée à celle de la β-actine (détails affichés dans les fichiers supplémentaires 1:. xénogreffe tumorale modèle de données supplémentaire)
Fourty souris nues ont été divisés en quatre groupes au hasard. Chaque groupe a été injecté par voie sous- cutanée dans le dos avec la suspension de 200 ul contenant 2 x 10 6 cellules mentionnées ci-dessus, respectivement. Le volume de xénogreffes a été mesuré en série. Les souris ont été sacrifiées au bout de 35 jours. Les xénogreffes ont été excisées et pesées. Les taux de xénogreffes d'inhibition ont été calculés selon la formule: taux d'inhibition (en%) = 1-poids moyen (OLFM4 knock down cellules injectées groupe ou de contrôle HK cellules injecté groupe) /poids (groupe contrôle HK cellules-injecté) signifie × 100%. Ensuite, le tissu tumoral a été soumis à l'isolement de l'ARN total ou une détection immunohistochimique.
Immunohistochimie (IHC)
OLFM4 protéines dans les xénogreffes tumorales ont été analysés par IHC en utilisant lapin anti OLFM4 (Abcam, Cambridge, Royaume-Uni) (détails représentés sur fichier supplémentaire 1:. des données supplémentaires) les données de Statistique
d'expériences indépendantes ont été exprimées par la moyenne ± écart-type d'au moins trois expériences. Les comparaisons entre les groupes ont été analysés par t de Student à deux queues
-test ou ANOVA, le cas échéant, et les valeurs de p < 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives de. Résultats
frappe efficace vers le bas du gène OLFM4 par siRNA plasmidique dans les cellules de cancer gastrique
OLFM4 expression de la protéine modèle a été étudié dans le cancer gastrique BGC-823, HGC-27, SGC-7901, MKN28, MKN45 et des cellules de contrôle des GES-1 normaux (Figure 1A). protéines OLFM4 exprime certainement dans toutes ces cellules de cancer gastrique et GES-1 cellules. En particulier, SGC-7901 et les cellules MKN45 exprimées par rapport à haut niveau protéique OLFM4 que d'autres cellules cancéreuses gastriques et les cellules de GES-1. Par conséquent, SGC-7901 et les cellules MKN45 ont été choisis pour des études ultérieures. Figure 1 knockdown efficace de OLFM4 par interférence ARN dans le cancer gastrique SGC-7901 et les cellules MKN45. A. Expression de la protéine OLFM4 dans diverses lignées cellulaires de cancer gastrique. Profil d'expression de la protéine OLFM4 a été analysée par transfert de Western avec des β-actine comme contrôle interne. GES-1 cellules ont été servis sous forme de cellules normales de contrôle. expression B. OLFM4 ARNm dans les cellules knockdown OLFM4. Expression relative de OLFM4 a été détectée par qRT-PCR. β-actine a été utilisée comme contrôle interne. Plier changements dans l'expression de l'ARNm OLFM4 ont été déterminées en utilisant la méthode 2-ΔΔCt. C. OLFM4 l'expression des protéines dans les cellules knock-down OLFM4. OLFM4 expression de la protéine a été détectée par western blot. la protéine ß-actine a été utilisée comme contrôle interne. Les représentants de trois expériences sont présentés. ** P < 0,01 vs HK groupe cellules témoins (n ​​= 3). Comment faire pour réguler vers le bas l'expression OLFM4, un shRNA ciblage génique OLFM4 de médiation plasmidique a été construit pour frapper de manière stable vers le bas l'expression OLFM4 dans SGC-7901 et les cellules MKN45. Comme on le voit sur la figure 1B, les niveaux d'ARNm OLFM4 ont été considérablement réduits dans SGC-7901-siOLFM4 et les cellules MKN45-siOLFM4 par rapport à leur contrôle HK ou cellules parentales (P < 0,01). Ces résultats ont été confirmées par une analyse par transfert de Western (figure 1C). Aucune différence significative dans l'expression OLFM4 a été observée entre les cellules de contrôle parental et HK. Les niveaux d'ARNm et de protéines pour la β-actine étaient similaires entre les différents groupes. Ces résultats suggèrent qu'une plasmidique OLFM4-siRNA peut spécifiquement et efficacement tomber niveau OLFM4 dans les cellules de cancer gastrique. Compte tenu de l'analyse indiquée ci-dessus, donc, OLFM4 abattre des cellules et des cellules de contrôle HK ont été choisis pour une enquête plus approfondie.
OLFM4 knockdown inhibe gastrique la prolifération des cellules cancéreuses et la croissance indépendante de l'ancrage in vitro
Pour déterminer le rôle de OLFM4 dans l'estomac la croissance des cellules cancéreuses, nous avons étudié l'effet de OLFM4-siRNA sur la croissance cellulaire au point de temps 1-5 jours par WST-1 essai. Comme on le voit sur la figure 2A, dans toutes les deux lignées cellulaires de cancer gastrique, la croissance des cellules OLFM4 knock down a été significativement réduite par rapport aux cellules témoins HK de 3 jours (P < 0,01). Pour examiner davantage l'importance de OLFM4 dans la tumorigenèse des cellules de cancer gastrique in vitro, nous avons réalisé des essais de croissance indépendante de l'ancrage et trouvé SGC-7901 et les cellules exprimant MKN45 contrôles HK se sont bien développées dans la gélose molle, formant colonies distinctes. En revanche, OLFM4 knock-down CGT-7901 et les cellules MKN45 présentaient une réduction considérable du nombre de colonies agar mou (P < 0,01) (figure 2B) illustrant la transformation des capacités inférieures à celles des cellules témoins. Ces données indiquent que knock-down de OLFM4 gastrique pourrait inhiber la prolifération des cellules cancéreuses et la croissance indépendante de l'ancrage in vitro. La figure 2 knockdown de OLFM4 inhibe la croissance de la CGT-7901 et des cellules MKN45 in vitro et in vivo. A. courbe de croissance cellulaire. La prolifération cellulaire in vitro a été évaluée par la courbe de croissance cellulaire, tel que déterminé en comptant le nombre de cellules (WST-1 essai) dans les cellules CGT-7901 (panneau de gauche) et des cellules MKN45 (panneau de droite). La valeur de la DO (450 nm), on a compté les jours indiqués et présentée comme le nombre moyen de cellules (n = 3). B. croissance indépendante de l'ancrage dans la gélose molle. Des images représentatives de trois expériences ont été présentés (panneau supérieur). Les données représentent le nombre moyen de colonies comptées à 200 × grossissement pour 5 champs aléatoires (panneau inférieur). C. Le volume moyen de la tumeur après l'injection sous-cutanée de souris nude avec contrôle HK ou cellules knockdown OLFM4 a été mesurée au niveau des points de temps indiqués. D. Représentant Tumeurs images à 35 jours après l'injection sous-cutanée de cellules indiquées. poids E. moyenne de la tumeur (panneau de gauche) et le taux d'inhibition (panneau de droite) dans les xénogreffes tumorales. Les données représentent le poids moyen de xénogreffes de tumeur (moyenne ± écart-type, n = 10). ** P < 0,01 vs HK groupe témoin.
Effet de la croissance inhibitrice diminué OLFM4 dans les xénogreffes de tumeurs gastriques
En outre, nous avons également procédé à dosage formative de la tumeur sous-cutanée chez la souris nude pour évaluer l'effet de suppression de la croissance des régulé à la baisse OLFM4 in vivo. Les souris nues ont été injection sous-cutanée OLFM4 knockdown ou des cellules de contrôle HK. Les volumes des tumeurs par poids de la tumeur 4 jours et à 5 semaines ont été mesurées respectivement après l'injection sous-cutanée. Comme cela est représenté sur la figure 2C-D, si le poids du volume de la tumeur ou d'une tumeur produite par OLFM4 knock down SGC-7901 et les cellules MKN45 ont réduit de manière significative la croissance par rapport à des tumeurs produites chez les souris injectées avec des cellules HK de contrôle transfectées (P < 0,01). Le taux d'inhibition du SGC-7901 et MKN45 abattre les cellules injectées groupe sur la croissance tumorale était de 40,29% et 37,48% respectivement (figure 2E).
Pour assurer encore l'expression OLFM4 est indeedly taire après l'injection sous-cutanée de souris nues, nous avons également évalué OLFM4 expression dans des xénogreffes de tumeur en utilisant qRT-PCR et IHC. De la même in vitro, au niveau OLFM4 ARNm dans des xénogreffes de tumeurs produites par les cellules knock-down OLFM4 a également montré une diminution significative par rapport aux tumeurs témoins HK xénogreffes (P < 0,01) (figure 3A). En accord avec les résultats de la qRT-PCR, une réduction significative de la protéine OLFM4 a également été observée dans les xénogreffes de tumeurs par IHC (P < 0,01) (figure 3B et 3C). Supérieur échelle de gris et un signal plus fort positif en DAB visualisation ont été trouvées dans des xénogreffes de tumeur du groupe contrôle HK cellules-injecté. Au contraire, une faible coloration brune a été observée dans des xénogreffes de tumeur du groupe knockdown OLFM4 cellules-injecté. En outre, plus grande région de la nécrose a été observée dans les xénogreffes de tumeurs produites par les cellules témoins HK en raison d'une croissance rapide des cellules témoins HK (panneau supérieur figure 3B). Ces données ont donné une forte indication que OLFM4 expression à l'ARNm et des protéines sont de manière stable inhibée en effet in vivo. Pris collectivement, à la fois in vitro et in vivo suggèrent que le knock-down OLFM4 inhibe la croissance des cellules cancéreuses gastriques. Figure 3 Détection qRT-PCR et IHC de OLFM4 dans les xénogreffes tumorales. A. qRT-PCR pour OLFM4 ARNm dans des xénogreffes de tumeur. Plier les changements dans OLFM4 ARNm ont été déterminées en utilisant la méthode 2-ΔΔCt. gène de la ß-actine a été utilisée comme contrôle interne. B. H & coloration (panneau supérieur) E et IHC pour OLFM4 protéines (panneau inférieur) dans les xénogreffes tumorales. Des images représentatives (200 ×) sont présentés. N, nécroses. C. Analyse Quantification d'expression OLFM4. La valeur moyenne a été mesurée à partir de cinq champs au hasard différents sous le microscope (400 ×) en utilisant le PLUS V6.0 Image-Pro. Les données ont été exprimées en moyenne ± écart-type. ** P < 0,01 par rapport au groupe témoin HK.
OLFM4 knock-down retards transition G1 à S, mais ne déclenche pas l'apoptose évidente dans les cellules de cancer gastrique
Compte tenu de nos effets inhibiteurs observés sur la croissance cellulaire in vitro et in vivo, nous avons cherché à déterminer si l'apoptose accrue ou à la progression du cycle cellulaire retardée a été associée à l'inhibition de la croissance. Nous avons évalué l'effet de la première diminution OLFM4 sur la progression du cycle cellulaire. Comme on le voit sur la figure 4A, à la fois OLFM4 knock-down CGT-7901 et les cellules MKN45 ont montré une augmentation des nombres significatifs dans la phase G1 et le nombre a diminué dans la phase S, par contraste avec les cellules de HK de commande (P < 0,01). Aucune différence significative n'a été observée dans le G2 /M en phase, ce qui indique un retard typique G1 du cycle cellulaire. Figure 4 Evaluation de la distribution du cycle cellulaire, des cellules apoptotiques et la caspase 3/9 activation OLFM4 abattre les cellules cancéreuses gastriques. A. Analyse du cycle cellulaire. Changements dans la distribution du cycle cellulaire du SGC-7901-HK, SGC-7901-siOLFM4 et MKN45-HK, les cellules MKN45-siOLFM4 ont été analysées par la FCM. Les données représentent le pourcentage moyen de distribution de phase du cycle cellulaire (n = 3). B. Analyse cellulaire de l'apoptose. L'apoptose a été estimée avec AnnexinV-PE /7-AAD coloration par la FCM. Les données représentent le pourcentage moyen de cellules apoptotiques (n = 3). C. caspase-3 et les activations -9. Caspase-3, 9 activations entre les cellules indiquées sont affichées. ** P < 0,01 par rapport au groupe témoin HK.
Pour déterminer si l'apoptose est impliquée dans cette inhibition de la croissance, nous avons ensuite effectué une analyse de l'apoptose des cellules. Fait intéressant, l'expression réduite OLFM4 ne pouvait pas conduire à des changements significatifs dans l'apoptose (figure 4B), ce qui est cohérent avec l'analyse du cycle cellulaire présentant pas de phase de sous-G1 apparente dans les cellules testées. Pour examiner davantage les altérations de signaux apoptotiques, caspase-3 /-9 activité a également été identifié par des analyses d'activation colorimétriques. Les deux caspase-3 et -9 activations ont montré aucun changement significatif après knockdown de OLFM4 dans SGC-7901 et les cellules MKN45 (Figure 4C). Ces résultats suggèrent que la régulation négative de OLFM4 peut exercer un effet inhibiteur sur la croissance cellulaire en régulant la progression du cycle cellulaire ne comportant pas l'apoptose dans les cellules cancéreuses gastriques.
Suppression de OLFM4 sensibilise les cellules cancéreuses gastriques à H2O2 ou le TNF induit l'apoptose α-
l'effet distinct de H 2O 2 ou TNF α sur l'apoptose entre OLFM4 abattre et les cellules de contrôle HK a également été étudiée. OLFM4 ou abattre les cellules témoins ont été traitées avec HK 10, 100 et 1000 pM H 2 O 2 ou 5, 10 et 50 ng /ml de TNF α, respectivement. La viabilité cellulaire et de l'apoptose ont été évalués. Comme cela est représenté sur la figure 5A-D, une diminution dose-dépendante de la viabilité des cellules a été observée dans H 2O 2 ou de TNF α traité OLFM4 cellules knock down. En outre, le traitement de 10 pM H 2 O 2 (figure 5A-B) ou 10 ml de TNFa (figure 5C-D) a entraîné une réduction significative de la viabilité des cellules dans OLFM4 cellules abattre ng /par rapport à HK les cellules témoins (P < 0,01). Un intérêt particulier est la constatation que OLFM4 cellules knockdown plutôt que des cellules de contrôle HK traités avec 10 ~ 1000 uM H 2O 2 présentaient des pourcentages apoptotiques plus importants par rapport à ceux traités avec du PBS mock (P < 0,01) ( Figure 5A-B). Des résultats similaires ont également été observés dans des cellules TNF alpha-traité OLFM4 knock-down (figure 5C-D). En d'autres termes, OLFM4 knock down amélioré H 2 O 2 ou de TNF apoptose induite par α dans des cellules de cancer gastrique, ce qui indique la suppression de OLFM4 fait SGC-7901 et les cellules MKN45 plus sensibles au traitement par H 2 O 2 ou de TNF α. Figure 5 Réponse OLFM4 knockdown CGT-7901 et les cellules MKN45 à des agents induisant l'apoptose H 2 O 2 ou le TNFa. OLFM4 effet de choc et des cellules témoins HK ont été traités avec H2O2 (A et B) ou de TNF α (C et D) sous forme de doses indiquées pendant 12 h. La viabilité cellulaire a été mesurée par WST-1 essai (panneaux de gauche A-D) et exprimée dans la valeur moyenne DO (450 nm) (n = 3). Le pourcentage de cellules apoptotiques a été déterminée par la FCM (A-D panneaux de droite) et exprimé dans le pourcentage moyen apoptotique (n = 3). * P < 0,05, ** P < apoptose 0,01 vs groupe témoin HK.
activité caspase-3 est impliquée dans H2O2 ou TNF α-induite dans OLFM4 knock-down cellules
Les résultats ci-dessus indiquent que renverser des OLFM4 pourrait augmenter H 2O 2 ou de TNF α stimulée par l'apoptose. Pour vérifier en outre si la caspase-3 est activé sous la forme H 2 O 2 ou de TNF apoptose induite par α dans les cellules knock-down OLFM4, nous avons ensuite détecté l'activation de la caspase-3 dans H 2 O 2 ou de TNF a-traité les cellules en utilisant un dosage colorimétrique. Comme on le voit sur la figure 6A, le traitement par H 2 O 2 ou de TNF α a donné lieu à beaucoup plus l'amélioration de la caspase-3 Activité à OLFM4 cellules knock-down que les cellules témoins HK (P < 0,01), suggérant une activité caspase-3 est impliqué dans la H 2O de l'apoptose 2 ou TNF α-induite dans les cellules knockdown OLFM4. Pour vérifier en outre si H 2 O 2 ou de TNF apoptose induite par α-est dépendante activité caspase-3, Z-VAD-fmk, un inhibiteur de la caspase a été utilisé avant le traitement par H 2 O 2 ou de TNF α. Pré-traitement de Z-VAD-fmk significativement atténué H 2O 2 ou TNF l'apoptose cellulaire induite par α-ainsi que activité caspase-3 dans les deux OLFM4 cellules knockdown (P < 0,01) (Figure 6C-D ), indiquant que H 2 O 2 ou de TNF α-apoptose induite par la caspase-3 est dépendante dans les cellules knock-down OLFM4. La figure 6 Implication de l'activité caspase-3 dans H 2 O 2 ou de TNF α-apoptose induite dans OLFM4 knockdown CGT-7901 et les cellules MKN45. (A-B) Augmentation activité caspase-3 dans les cellules knockdown OLFM4 a-traité H2O2 ou TNF. OLFM4 cellules knock-down et de HK-témoins ont été traitées avec 10 uM de H2O2 (A) ou 10 ng /ml de TNF α (B) pendant 12 h. Activité caspase-3 a été mesurée par dosage colorimétrique et exprimé dans les changements de pliage. ** P < 0,01 par rapport PBS groupe fictif (n = 3). (C-D) Reversed apoptose cellulaire par inhibiteur de caspases dans les cellules knockdown OLFM4. Les cellules ont été traitées avec le TNF α ou H2O2 seul avec les posologies indiquées ci-dessus mentionnée ou prétraitée avec 20 pM de Z-VAD-fmk 2 heures avant le TNF α ou H2O2 traitement. Le pourcentage de cellules apoptotiques a été déterminé par FCM. Les données représentent la moyenne ± SD de trois expériences indépendantes. ** P < 0,01 par rapport à H2O2 (C) ou TNF α (D) -Traité OLFM4 knockdown groupe cellules
. Discussion
accumulation de données récemment démontré OLFM4 est fréquemment surexprimé dans de nombreux types de tumeurs humaines, y compris le cancer gastrique, et on croyait jouer un rôle crucial dans le développement et la progression de la cancérogenèse gastrique [19, 20]. Bien que des études antérieures ont montré que OLFM4 est impliqué dans l'apoptose et la croissance tumorale, des observations récentes suggèrent également que les effets sur les cellules ou spécifiques d'un tissu peuvent exister pour le gène OLFM4. On sait relativement peu en ce qui concerne la croissance de la tumeur et l'apoptose sous-jacente OLFM4 expression spécifique du cancer gastrique. Pour obtenir une meilleure compréhension de ce rôle pour le OLFM4 altéré dans le cancer gastrique humain, support expérimental est nécessaire pour valider le rôle du gène OLFM4 dans le cancer gastrique.
Il a été montré que l'expression anormale de HGC-1 peut être régulée au niveau transcriptionnel ou post-transcriptionnel [13]. Dans nos travaux actuels, nous avons étudié directement OLFM4 modèle d'expression de la protéine dans les cellules de cancer gastrique et GES-1 des cellules normales. SGC-7901 et les cellules MKN45 exprimant des niveaux élevés de OLFM4 relatifs ont été choisis pour cette étude. Etant donné que la réduction de l'expression du gène cible par des moyens génétiques dans des lignées cellulaires établies sont utiles pour une meilleure compréhension de son rôle dans le maintien du phénotype malin en particulier dans l'analyse des gènes qui sont essentiels pour la survie cellulaire [21], nous avons généré des pools de clones stables de la CGT-7901 et MKN45 exprimant OLFM4-siRNA ou le contrôle HK brouillé par l'approche de siRNA à base de plasmide et confirmé l'efficacité knock-down du gène OLFM4 à des niveaux de ARNm et de protéines par qRT-PCR et western blot.
Nos travaux actuels montrent que OLFM4 joue un rôle essentiel dans la tumorigenèse du cancer gastrique. Knockdown de OLFM4 inhibe la prolifération cellulaire et la capacité de croissance indépendante de l'ancrage in vitro. modèle de tumeur de xénogreffe in vivo implique également une diminution OLFM4 peut inhiber la croissance tumorale des cellules cancéreuses gastriques humaines. Ces résultats indiquent que OLFM4 joue un rôle crucial dans la prolifération cellulaire des cellules cancéreuses gastriques. Nos résultats ont également observé que le knock-down de OLFM4 n'a pas influé sur le taux de l'apoptose et de la caspase-3 et 9 activations dans OLFM4 cellules knockdown, suggérant que l'apoptose pourrait ne pas être le mécanisme sous-jacent de l'inhibition de la croissance tumorale. Par conséquent, nous postulons que l'expression OLFM4 ne soit pas essentiel pour la survie des cellules cancéreuses, ce qui est conforme à une observation récente que les souris knock-génétiques pour OLFM4 montrent le développement normal et phénotypes hématopoïétiques [17]. Pour caractériser davantage le mécanisme qui sous-tend l'inhibition de la croissance, nous avons effectué une analyse du cycle cellulaire et a démontré que l'inhibition de l'expression OLFM4 induite par des cellules de cancer gastrique à accumuler dans la phase G1 du cycle cellulaire, ce qui suggère une régulation négative OLFM4 peut exercer un effet inhibiteur sur la croissance cellulaire par une progression du cycle cellulaire mécanisme de régulation ne comportant pas l'apoptose dans les cellules cancéreuses gastriques. de la résistance des cellules tumorales à l'induction de l'apoptose est l'un des principaux facteurs responsables de l'échec de nombreuses thérapies anticancéreuses classiques qui utilisent des agents anticancéreux et des radiations. Par conséquent, le contrôle de l'apoptose dans les cellules cancéreuses est d'une importance clinique et biologique critique [22, 23]. L'activité anti-apoptotique est une autre fonction importante du gène OLFM4 [2]. En particulier H 2O apoptose cellulaire 2 induite a été atténuée par OLFM4 surexprimée dans une lignée cellulaire de cancer de la prostate [2]. De plus, les cellules MKN45 ont été montré une capacité de résistance à l'apoptose induite par le TNF α-[24]. Compte tenu de ces résultats, nous émettons l'hypothèse que knockdown de l'expression OLFM4 pourrait améliorer H apoptose 2O 2 ou TNF α-induite dans les cellules de cancer gastrique. Ici, nous avons montré que le knock-down de OLFM4 effectivement amélioré l'apoptose des cellules en réponse à H 2O 2 ou TNF α stimulation MKN45 ainsi que des cellules SGC-7901, ce qui suggère le blocage OLFM4 peut augmenter la sensibilité du cancer gastrique cellules à la présence de H 2 O 2 ou de TNF α.
Comme il est bien connu que la caspase-3, une molécule dirigeant clé de la voie apoptotique joue un rôle crucial dans les processus apoptotiques dans une variété des cellules. Nous avons en outre examiné caspase-3 activation dans OLFM4 knockdown et des cellules de contrôle HK en présence ou en absence d'inhibiteur de caspase Z-VAD-fmk. Nous avons observé que le traitement de H 2O 2 ou TNF a significativement régulée à la hausse activité caspase-3 dans OLFM4 cellules knockdown que les cellules de contrôle HK alors pré-traitement avec Z-VAD-fmk inversée activité caspase-3, ainsi sous forme de H 2 O 2 ou de TNF α-apoptose induite. Les résultats indiquent que H apoptose 2O 2 ou TNF-α induite dans les cellules knock-down OLFM4 est la caspase-3 dépendante. Sur la base des données actuelles, il est concevable que régulés à la hausse OLFM4 permet aux cellules de cancer gastrique pour résister à l'induction de l'apoptose par la diminution de la sensibilité aux médicaments anticancéreux.
En fait, les antagonistes de OLFM4 ont été rapportés inhiber la prolifération d'autres types de les cellules cancéreuses telles que le cancer du pancréas PANC-1 des cellules humaines [8] et caner pulmonaire humain des cellules SBC-1 [9]. Cependant, les résultats controversés ont également été observés. Diminution de l'ARNm OLFM4 PANC-1 inhibe la prolifération des cellules en S à phase G2 /M arrêté [8], qui est différente de nos résultats montrant la progression de la phase G1 retardé dans le cancer gastrique. Certains détails importants (ou raisons) pourraient expliquer cet écart. Tout d'abord, comme des études récentes ont suggéré, un rôle cellulaire ou tissulaire spécifique de OLFM4 (cellules cancéreuses gastriques et les cellules du cancer du pancréas) peut être une explication convaincante de cet écart. Le plus remarquable est, l'expression OLFM4 au niveau de l'ARNm, mais pas le niveau de protéines dans PANC-1 des cellules a été mesurée avec succès en utilisant RT-PCR [8], alors que le rapport le plus récent de Kim et al. a montré que les cellules Panc-1 n'a pas d'expression OLFM4 ARNm [25], ce qui indique le motif d'expression et le rôle du gène OLFM4 dans PANC-1, les cellules ont besoin d'une confirmation supplémentaire.
En dépit OLFM4 silençage a été montré un effet inhibiteur sur la croissance cellulaire et diminution de la résistance à H 2 O 2 ou de TNF α traitement dans les cellules du cancer de l'estomac, il n'a pas été éliminé que d'autres mécanismes peuvent également être régulés par OLFM4 et contribue à l'inhibition de la croissance et de la signalisation de contrôle de l'apoptose, compte tenu de la diaphonie du réseau . En effet, OLFM4, un gène cible de NF-kB voie [16, 17, 25], a également montré un effet de rétroaction négatif sur l'activation de NF-kB induite par l'infection par H. pylori dans HEK 293 cellules T [6],

• le récepteur du facteur de croissance épidermique altérations structurelles dans les récepteurs du facteur de croissance épidermique cancer
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