Izčrpavanje OLFM4 gena zavira rast celic in poveča preobčutljivost vodikovega peroksida in faktor tumorske nekroze-alfa inducirane-apoptoze v želodčni rak cells

izčrpavanje OLFM4 gena zavira rast celic in poveča preobčutljivost vodikovega peroksida in faktor tumorske nekroze-alfa inducirane-apoptoze v želodcu rakave celice
Abstract
ozadju
Human olfactomedin 4 gena (OLFM4) je izločen glikoprotein bolj znana kot anti-apoptotske molekule GW112. OLFM4 je ugotovljeno, da je pogosto up-urejeno v mnogih vrstah človeških tumorjev, vključno z rakom želodca in so verjeli, da igrajo pomembno vlogo pri napredovanju raka želodca. Čeprav je funkcija OLFM4 navedeno v številnih raziskavah, nedavni dokazi močno kaže na celično ali tkivno tipa odvisni vlogo OLFM4 pri rasti celic in apoptoze. Cilj te raziskave je bil preučiti vlogo želodčnega raka specifično izražanje OLFM4 rasti celic in odpornost apoptoze.
Metode
OLFM4 izraz je izločajo z RNA interference v SGC-7901 in MKN45 celic. Celično proliferacijo, rast pritrdišče neodvisen, celičnega cikla in apoptozo bila označena in vitro. Tumorogenosti smo analizirali in vivo. Apoptozo in kaspaza-3 aktiviranje v odgovor na vodikov peroksid (H 2O 2) in tumorje nekrotizirajoči faktor-alfa (TNF α) je bila ocenjena v prisotnosti ali odsotnosti inhibitorja kaspaze Z-VAD-fmk.
Rezultati
odprava OLFM4 proteina, ki ga interference RNA v SGC-7901 in MKN45 celic močno zavira tumorogenosti tako in vitro in in vivo, ki ga inducira celično G1 prijetju (vse P < 0,01). OLFM4 rasklapanje ni sprožil očitno celično apoptozo, vendar večja H 2O 2 ali TNF-α inducirane apoptoze in kaspaza-3 aktivnosti (all P < 0,01). Zdravljenje Z-VAD-fmk oslabljen kaspaze-3 aktivnosti in znatno obrnilo H 2O 2 ali TNF α-inducirano apoptozo v OLFM4 rasklapanje celic (vsi P < 0,01).
Zaključek
Naša študija kaže, da izčrpavanje OLFM4 znatno zavira pojav tumorjev na raka želodca SGC-7901 in MKN45 celic. Blokiranje OLFM4 izraz lahko senzibilizirati želodčne rakave celice H 2O 2 ali TNF α zdravljenje s povečanjem kaspazo-3 odvisno apoptozo. Kombinacija strategija temelji na OLFM4 zdravljenju inhibicije in proti raku drog lahko zagotovi terapevtski potencial v želodcu intervencije raka.
Ključne besede
rak želodca Olfactomedin 4 RNA rasti poseg apoptoza celic Odpornost ozadju
Human OLFM4 (olfactomedin 4, znan tudi kot HGC-1, GW112), prvotno imenovano človeški klonirano iz mieloidnih prekurzorskih celic, po stimulaciji granulocitne kolonije stimulirajoči faktor [1], ki je izločen glikoprotein bolj znana kot anti-apoptotični molekulo GW112 [2, 3]. OLFM4 običajno izražena v kostnem mozgu, prostate, tankega črevesja, želodca, debelega črevesa in trebušne slinavke [1, 4]. Kasneje, povečana OLFM4 vrednosti so bile ugotovljene tudi v kripti epitela vnetega debelega sluznici vnetne črevesne bolezni [5] in želodčnih biopsije, okuženih z bakterijo Helicobacter pylori [6, 7]. Nedavno je bil pripravljen regulirano OLFM4 izraz opisano v pljučih in dojkah [8], prostate [3], želodčni [3, 9], in raka trebušne slinavke [8, 9] kot tudi v debelem črevesu adenomov [10-14].
predlagano je bilo, da je OLFM4 sodeluje pri celičnem procesu, kot so apoptoze in tumorske rasti [2]. Čeprav je bila celična funkcija OLFM4 preiskati, ti rezultati niso vedno sovpadata. Čezmernim OLFM4 Dokazano je, da se olajša miške prostate tumor Tramp-C1 rast celic v singenskih miši C57 /BL6 [2], vendar zavira raka prostate PC-3 proliferacijo celic človeškega [15]. Poleg tega, kar je regulirano OLFM4 pokazala močan anti-apoptotske dejavnost miška limfnega venska endotelijskih Švec celic in človeškega adenokarcinom HeLa celic [1, 2], ker nedavne ugotovitve predlagal proapoptotičnih učinek OLFM4 človeških mieloične levkemije HL-60 celic [16 ]. Dokazi iz teh študij jasno kaže, da se lahko vloge OLFM4 pri nadzoru celične rasti in apoptozo odvisna od vrste celic ali tkiva [10, 13-15]. Do danes pa je bil objavljen zelo skopi podatki v zvezi z vlogo OLFM4 pri rasti celic in apoptoze profilov želodca rakavih celic.
V tej študiji smo analizirali OLFM4 beljakovin izraz v želodčnih rakavih celic in normalne človeške želodčne epitelnih GES-1 celice po zahodni blot. Uporaba-plazmid posreduje kratek Ostra RNA (shRNA), smo zaviral OLFM4 izraz na raka želodca SGC-7901 in MKN45 celice opazovati proliferacije celic, fazo celičnega cikla, apoptoza in vitro ter oceni tumorogeno zmogljivosti in vivo. Prav tako smo raziskali apoptozo in kaspazo-3 aktivacije kot odziv na citotoksičnih snovi, kot so H 2O 2 ali TNF α v prisotnosti ali odsotnosti inhibitorja kaspaze Z-VAD-fmk med OLFM4 rasklapanje celicami in kontrolnih celic HK .
Metode
celične kulture, reagenti in miši
človeški raka želodca celice BGC-823, HGC-27, SGC-7901, MKN28, MKN45 in človekove normalne želodca epitelijskih GES-1 celice ohranijo DMEM medij (GibcoBRL, Gaithersburg, MD), ki vsebuje 10% fetalni goveji serum (FBS, GibcoBRL, USA), 100 U /ml penicilina in 100 ug /ml streptomicina. H 2O 2 in TNF-α smo dobili od Sigma (St. Louis, MO) in Z-VAD-fmk smo kupili iz Calbiochem (San Diego, CA). BALB /C nude (nu /nu) miši (stari 4-6 tednov, SPF stopnja, 20 ± 3 g) smo dobili od laboratorijske Center živali Chongqing medicinske univerze (Chongqing, Kitajska). Vsi postopki so bili izvedeni v skladu z mednarodno sprejetimi etičnimi smernicami (objava NIH št. 85-23, popravljen 1985).
Plazmida konstrukti in stabilno transfekciji
shRNA posredovano RNAi plazmida (pGenesil 1,1-siOLFM4) in umešana nadzor plazmid (pGenesil 1,1-HK) je bilo zgrajenih podreti endogenega OLFM4 v SGC-7901 in MKN45 celic. Po transfekciji in neomicin (G418) izbire, OLFM4 knock-down SGC-7901-siOLFM4, MKN45-siOLFM4 celice in umešana SGC-7901-HK, kontrolne celice MKN45-HK so trajno pridobiti, oziroma (podrobnosti prikazano v dodatni datoteki 1: Dodatne podatki).
ekstrakcijo RNA in kvantitativno RT-PCR (QRT-PCR)
Celotna RNA v različnih celicah ali tumorskih ksenotransplantati smo ekstrahirali z RNeasy Mini Kit (Qiagen, CA, ZDA) in je sledila sintezo cDNK z ReverTra Ace-alfa-prvi del sinteze cDNA sistem (Toyobo, Osaka, Japonska) kot prejšnja opisano [17]. Kvantitativni PCR v realnem času je bila izvedena z 7500 realnem času sistem PCR (Applied Biosystems) z SYBR-Green kot fluorescentnim barvilom (Toyobo, Osaka, Japonska) (podatki so prikazani v dodatni datoteki 1: Dodatni podatki). Kratno spremembe v izražanju genov smo določili s pomočjo "2 - ddCT". Metodo [18]
test proliferacije celic in vitro, in sposobnosti preživetja celic merjenje
Cell orožja in sposobnosti preživetja celic smo merili z uporabo mobilnega proliferacije WST-1 kit (Roche ) v skladu z navodili proizvajalca. Za celično proliferacijo, smo celice zasejali z gostoto 1 x 10 3 celic na vdolbino 96-vdolbinami in gojena za 5 dni. Vrednost optična gostota (450 nm) je bila odkrita s pomočjo mikroplošča Reader (Tacan, Svazi) na dan. Vsak test smo izvedli v treh izvodih. Kot za merjenje preživetja celic, celice (1 x 10 4 /jamico) smo posejali v 200 ul medijev v 96-vdolbinami. Po 12 h inkubacije, H 2O 2 ali TNF α je bila obravnavana v navedenih koncentracijah. Relativne absorbance smo izmerili kot je opisano v celične proliferacije.
Anchorage-neodvisnega testa rasti
Anchorage neodvisen rast je bila izvedena na mehki agar odražajo vitro clonogenicity. Na kratko, celice (5 x 10 2) iz vsake kolonije smo suspendirali v 0,3% agarja v DMEM in nato nanese na strjeni agar (0,5%) v 6 vdolbinami jedi. Celice inkubiramo 2 tedna pri 37 ° C v 5% CO 2, preden smo izmerili kolonije. Število kolonij je preštetih pri 200-kratni povečavi pet naključnih polj. Vsak test je bil izveden v treh izvodih.
Pretočno citometrijo analizo
pretočno citometrijo bila analiza (FCM), opravljene za oceno napredovanja cikel celic ali apoptozo. (Podrobnosti prikazano v dodatni datoteki 1: Dodatne informacije)
kaspazne vsebnosti
encimske aktivnosti kaspaze-3 in -9 smo merili z uporabo fluorometrične testa po postopku prej opisanem [8]
Western blot analizo.
Western blot je bila izvedena kot prej [17] opisano. Naslednja protitelesa so bila uporabljena za Western blotting-om: anti-OLFM4 (Abcam, Cambridge, Velika Britanija) in anti-β-aktina (Santa Cruz, CA, ZDA) smo analizirali relativna količina beljakovin uporabi količina ena programska oprema (Bio-Rad, Hercules , CA, ZDA) in normalizirana tisti beta-aktina (podrobnosti so prikazane v dodatni datoteki 1:. Dopolnilni podatki)
ksenotransplantskih modela tumor
so Štirideset golih miši razdelili v štiri skupine naključno. Vsaka skupina injiciramo subkutano v hrbtu s suspenzijo 200 ul vsebujejo 2 x 10 zgoraj omenjeno 6 celic oz. Obseg presadkov je serijsko izmeriti. Miši smo usmrtili po 35 dneh. V ksenotransplantati so izrezali in stehtali. Stopnje inhibicijo presadkov so bile izračunane po formuli: stopnjo inhibicije (%) = 1-pomeni težo (OLFM4 podreti celice vbrizgom skupina ali nadzora HK celice-vbrizga skupina) /povprečne teže (HK kontrolnih celicah, vbrizgali skupino) × 100%. Nato je bil tumor tkivo pod popolno izolacijo RNA ali odkrivanje imunohistokemični.
Imunohistokemija (IHC)
OLFM4 beljakovine v tumorskih presadkov so bili analizirani z imunohistokemijo, z uporabo kunčjega anti OLFM4 (Abcam, Cambridge, Združeno kraljestvo) (podatki prikazani v Dodatna datoteka 1:. Dodatni podatki)
Statistika
podatki neodvisnimi poskusi so bili izraženi kot povprečje ± SD vsaj tri poskuse. Primerjave med skupinami smo analizirali s dvorepe Študentske t
-test ali ANOVA, kot je primerno, in p vrednosti < 0.05 naj bi bile statistično značilne.
Rezultati
učinkovito podreti od OLFM4 gena stranskih plazmida posredovane siRNA v želodcu rakavih celic
OLFM4 protein izraz vzorec je bil preiskan v raka želodca BGC-823, HGC-27, SGC-7901, MKN28, MKN45 celice in normalne GES-1 nadzorni celice (Slika 1A). OLFM4 beljakovin zagotovo izraža v vseh teh želodčne rakavih celic in celic GES-1. Zlasti SGC-7901 in MKN45 celice izražena relativno visoki ravni OLFM4 beljakovin kot druge želodčne rakavih celic in ges-1 celic. Zato so bili SGC-7901 in MKN45 celice izbrana za nadaljnji študij. Slika 1 Učinkovito rasklapanje od OLFM4 s RNA interference na raka želodca SGC-7901 in MKN45 celic. A. Izražanje OLFM4 proteina v različnih želodčnih raka celičnih linij. Izražanje profil OLFM4 proteina smo analizirali z metodo Western blot z beta-aktina kot notranje kontrole. Celice GES-1 so služila kot normalnih kontrolnih celic. B. OLFM4 mRNA izraz v OLFM4 rasklapanje celicah. Relativna izraz OLFM4 odkril QRT-PCR. β-aktin uporabimo kot notranjo kontrolo. Kratno spremembe OLFM4 ekspresijo mRNA smo določili z uporabo metode 2-ΔΔCt. C. OLFM4 protein izraz v OLFM4 rasklapanje celicah. OLFM4 protein izraz ni bilo mogoče zaznati zahodni blot. beta-aktina protein uporabimo kot notranjo kontrolo. Predstavniki treh poskusih prikazani. ** P < 0,01 vs HK kontrolnih celicah skupine (n = 3).
Za navzdol regulira OLFM4 izražanja je bila-plazmid posredovano shRNA ciljanje OLFM4 gen izdelana za stabilno podreti OLFM4 ekspresijo v SGC-7901 in MKN45 celic. Kot je prikazano na sliki 1B, so bile ravni OLFM4 mRNA bistveno zmanjša v SGC-7901-siOLFM4 in MKN45-siOLFM4 celic v primerjavi z njihovim nadzorom HK ali starševskih celic (P < 0,01). Ti rezultati so potrdile tudi zahodni blot analizo (slika 1C). niso opazili pomembne razlike v OLFM4 izražanja med starševskih in HK kontrolnih celic. Stopnje mRNA in proteina za P-aktina so bili podobni med različnimi skupinami. Ti rezultati kažejo, da lahko a-plazmida posredovano OLFM4-siRNA konkretno in učinkovito podreti raven OLFM4 v želodcu rakavih celic. Glede na analizo zgoraj navedeno, torej OLFM4 podreti celice in kontrolne celice HK so bile izbrane za nadaljnjo preiskavo.
OLFM4 rasklapanje zavira proliferacijo želodčni rak celic in rast sidrišča neodvisen in vitro
Za določitev vloge OLFM4 v želodcu rast karcinom, smo raziskali vpliv OLFM4-siRNA na rast celic na 1-5 dan časovni točki, ki ga WST-1 testom. Kot je prikazano na sliki 2A, v vseh dveh želodčnih raka celičnih linij, rast OLFM4 podreti celic signifikantno zmanjšana v primerjavi s kontrolnimi HK celic iz dneva 3 (P < 0,01). Da bi še dodatno preučiti pomen OLFM4 v tumorigeneze želodca rakavih celic in vitro, smo opravili teste rasti pritrdilne neodvisen in ugotovila SGC-7901 in MKN45 celice izražajo kontrole HK tudi zrasel iz mehkega agarja, ki tvorijo različne kolonije. V nasprotju s tem, OLFM4 rasklapanje SGC-7901 in MKN45 celice razstavljena dramatično zmanjšanje števila mehkih agar kolonij (P < 0,01) (slika 2B), ki prikazuje preoblikovanje sposobnosti manjše od tistih iz kontrolnih celic. Ti podatki kažejo, da knock navzdol od OLFM4 lahko zavira proliferacijo želodčni rak celic in sidrišča neodvisen rast in vitro. Slika 2 rasklapanje od OLFM4 zavira rast SGC-7901 in MKN45 celic in vitro in in vivo. A. krivuljo rasti celic. Proliferacija celic in vitro je bila ocenjena s krivuljo rasti celic, kot je določeno s štetjem celic (WST-1 test) v SGC-7901 celic (leva plošča) in MKN45 celice (desno plošče). Vrednost OD (450 nm) smo računali na označeni dni in predstavljeni kot srednji števila celic (n = 3). B. Sidrišče neodvisna rast v mehkem agarju. Reprezentativni podobe treh poskusih so bili prikazani (zgornja plošča). Podatki predstavljajo povprečno število kolonij, preštetih pri 200-kratni povečavi 5 naključnih polj (nižja plošče). C. Povprečni volumen tumorja, potem ko je podkožna injekcija golih miših z nadzorom HK ali OLFM4 rasklapanje celic merijo po označenih časovnih točkah. D. Predstavnik tumorjev slike na 35 dni po subkutani injekciji navedenih celic. E. Povprečna teža tumor (levi panel) in zaviralni stopnja (desna plošča) v tumorskih presadkov. Podatki predstavljajo povprečje masa tumor presadkov (povprečje ± SD, n = 10). ** P < 0,01 vs. HK kontrolna skupina.
Rast-zaviralni učinek zmanjšal OLFM4 v želodčnih tumorskih presadkov
Poleg tega smo izvedli tudi podkožno tumorja formativno test pri golih miših oceniti učinek dušenje rasti navzdol regulirano OLFM4 in vivo. Nude mišim subkutano injicirali OLFM4 rasklapanje ali kontrolnih celicah Hongkonga. Obseg tumor na 4 dni in mase tumorja na 5 tednov smo izmerili sicer po subkutani injekciji. Kot je prikazano na sliki 2C-D, ali volumen tumorja ali tumorja maso proizvaja OLFM4 podreti SGC-7901 in MKN45 celice so znatno zmanjša rast v primerjavi s tumorji, proizvedenih v miših vbrizgali HK celic kontrole transfektirana (P < 0,01). Zaviralni stopnja SGC-7901 in MKN45 podreti celice vbrizgom skupina na rast tumorjev je bila 40,29% in 37,48% v tem zaporedju (slika 2E).
Za nadaljnjo Zagotavljam OLFM4 izraz je indeedly utišan po subkutani injekciji golih miših, smo tudi ocenili OLFM4 izraz v tumorskih presadkov uporabo QRT-PCR in IHC. Podobno vitro, raven OLFM4 mRNA v tumorskih presadkov jih proizvajajo OLFM4 rasklapanje celic so pokazale tudi znatno znižanje v primerjavi s HK nadzor tumorji presadkov (P < 0,01) (slika 3A). Skladni z rezultati QRT-PCR, smo opazili znatno zmanjšanje OLFM4 proteina tudi tumorskih presadkov z imunohistokemijo (P < 0,01) (slika 3B in 3C). Višje lestvice sivih tonov in močnejši pozitiven signal, ki ga DAB vizualizacijo so našli v tumorskih presadkov iz HK kontrolnih celicah injicirani skupine. Nasprotno je šibka rjavo obarvanje opazili v tumorskih presadkov po OLFM4 razgradljiv celice, vbrizganega skupino. Poleg tega je bilo več velikih nekroza regija opazili v tumorskih presadkov pridobiva s kontrolnimi HK celic zaradi hitre rasti kontrolnih HK celic (slika 3B zgornji plošči). Ti podatki, če močno kaže na to OLFM4 izražanje pri mRNA in vsebnosti beljakovin se trajno zavrla res vivo. Sprejeti skupaj, in vitro in in vivo eksperimenti kažejo, da OLFM4 razgradljiv zavira rast želodčnih rakavih celic. Slika 3 QRT-PCR in IHC odkrivanje OLFM4 v tumorskih presadkov. A. QRT-PCR za OLFM4 mRNA v tumorskih presadkov. Kratno spremembe OLFM4 mRNA smo določili z uporabo metode 2-ΔΔCt. beta-aktina gen je bil uporabljen kot notranje kontrole. B. H & E obarvanje (zgornja plošča) in IHC za OLFM4 beljakovin (nižja plošče) v tumorskih presadkov. Reprezentativni slike (200 ×) so prikazani. N nekrotizirajočega. C. Količinska analiza OLFM4 izražanja. Povprečna vrednost je bila izmerjena od petih naključno različnih področij pod mikroskopom (400 ×) z uporabo Image-Pro PLUS v6.0. Podatki so bili izraženi kot povprečje ± SD. ** P < 0,01 vs HK kontrolno skupino.
OLFM4 knock-down odloži G1 do S prehodom, vendar ne sproži očitne apoptozo v rakavih celicah želodčne PODJETJA
Glede na naše opažene zaviralni učinek na rast celic in vitro ter in vivo, smo poskušali ugotoviti ali je bila izboljšana apoptoza ali odloži napredovanje celičnega ciklusa povezano z inhibicijo rasti. Najprej smo ocenili učinek zmanjšane OLFM4 o napredovanju celičnega ciklusa. Kot je prikazano na sliki 4A, tako OLFM4 rasklapanje SGC-7901 in MKN45 celice so pokazale znatno povečanje števila v G1 fazi in zmanjšala število v S fazi, v nasprotju z njihovimi kontrolnimi celicami iz Hongkonga (P < 0,01). Ni bilo bistvenih razlik v G2 /M fazi opazili, kar kaže tipično G1 zakasnitev celičnem ciklusu. Slika 4 Ocena porazdelitve celičnega cikla, apoptotskih celic in kaspaze-3/9 aktivacije v OLFM4 podreti želodčne rakave celice. A. Analiza Celični ciklus. Spremembe v distribuciji celičnega cikla SGC-7901-HK, SGC-7901-siOLFM4 in MKN45-Hongkongu, so MKN45-siOLFM4 celice analizirali s FCM. Podatki predstavljajo srednjo odstotek fazne porazdelitve celičnega ciklusa (n = 3). B. Analiza Cell apoptoza. Apoptoza je bila ocenjena z AnnexinV-PE /7-AAD barvanjem FCM. Podatki predstavljajo srednjo apoptotske odstotek celic (n = 3). C. kaspazne-3 in -9 aktivacijo. Kaspaza-3, so prikazani 9 aktivacijo med navedenimi celicami. ** P < 0,01 vs. HK kontrolni skupini.
Želite ugotoviti, ali je apoptozo sodeluje pri tem zaviranja rasti, bomo naslednjič izvedli analizo celične apoptoze. Zanimivo je, da zmanjša OLFM4 izraz ni lahko privede do znatnih sprememb v apoptozo (slika 4B), kar je v skladu z analizo celičnega cikla, ki kaže vidne sub-G1 fazo testiranih celic. Da bi še dodatno preučiti spremembe apoptotskih signalov, je kaspaze-3 /-9 dejavnost opredeljena tudi s kolorimetričnimi aktiviranja testih. Oba kaspaze-3 in -9 aktivacijo ni pokazala bistvenih sprememb po rasklapanje za OLFM4 v SGC-7901 in MKN45 celic (slika 4c). Ti rezultati kažejo, da lahko dol-regulacija OLFM4 izvaja zavira rast celic, ki ureja napredovanje celičnega ciklusa ne vključuje apoptozo v želodcu rakavih celic.
Črtanje OLFM4 sensitizes želodčne rakave celice na H2O2 ali TNF-alfa inducirane apoptoze
Razpoznavna učinek H 2O 2 ali TNF α na apoptozo med OLFM4 podreti in HK kontrolnih celicah, so raziskovali tudi. OLFM4 podreti ali nadzora celice HK so bili zdravljeni z 10, 100 in 1000 LM H 2O 2 ali 5, 10 in 50 ng /ml TNF alfa oz. Cell sposobnost in apoptozo so bili ocenjeni. Kot je prikazano na sliki 5A-D, so opazili od odmerka odvisno zmanjšanje sposobnosti preživetja celic v H 2O 2 ali TNF α-obdelano OLFM4 podreti celice. Poleg tega, zdravljenje 10 mikrometrov H 2O 2 (slika 5A-B) ali 10 ng /ml TNF alfa (slika 5C-D) je privedlo do znatnega zmanjšanja sposobnosti preživetja celic v OLFM4 knock navzdol celice v primerjavi z Hongkongu kontrolne celice (P < 0,01). Posebnega pomena je ugotovitev, da OLFM4 rasklapanje celice namesto kontrolne celice HK obsevanih z 10 ~ 1000 LM H 2O 2 razstavljene vidnejše apoptotične odstotke v primerjavi s tistimi, zdravljenih s PBS mock (P < 0,01) ( slika 5A-B). Podobne rezultate so opazili tudi pri TNF-a obdelan OLFM4 rasklapanje celic (slika 5C-D). Z drugimi besedami, OLFM4 podreti okrepljeno H 2O 2 ali TNF-α povzroča apoptozo v želodčnih rakavih celicah, kar pomeni izbris OLFM4 iz SGC-7901 in MKN45 celice bolj občutljive na zdravljenje H 2O 2 ali TNF α. Slika 5 Odziv OLFM4 rasklapanje SGC-7901 in MKN45 celice do apoptoze indukcijo zastopniki H 2 O 2 ali TNF a. OLFM4 rasklapanje in kontrolne celice HK so zdravili z H2O2 (A in B) ali TNF alfa (C in D), kot je navedeno odmerki za 12 ur. viabilnost celic smo merili z WST-1 testom (A-D levo plošče) in izražen v OD vrednosti povprečne (450 nm) (n = 3). Odstotek apoptotskih celic smo določili s FCM (desno plošč A-D) in izražen v srednjem apoptotske odstotek (n = 3). * P < 0,05, ** P < 0,01 vs. HK kontrolni skupini.
Kaspazne-3 dejavnost je vključena v H2O2 ali TNF a-inducirano apoptozo v OLFM4 knock-down celice
Zgornji rezultati so pokazali, da knock navzdol OLFM4 lahko poveča H 2o 2 ali TNF α-spodbudil apoptozo. Da bi še dodatno preveriti, ali je kaspaze-3 aktivira H 2O 2 ali TNF-α inducirane apoptoze v OLFM4 rasklapanje celicah, smo poleg zaznali kaspazo-3 aktivacijo v H 2O 2 ali TNF a-obdelano celice z uporabo kolorimetričnega testa. Kot je prikazano na sliki 6A, zdravljenje H 2O 2 ali TNF α posledico veliko več povečanje kaspaza-3 aktivnosti v OLFM4 razgradljiv celicah od kontrolnih celicah HK (P 0,01), kar kaže na kaspazo-3 aktivnosti sodeluje pri H 2O 2 ali TNF α-inducirane apoptoze v OLFM4 rasklapanje celicah. Da bi še dodatno preveriti, ali H 2O 2 ali TNF-α povzroča apoptozo je odvisna od kaspaze-3 aktivnosti, Z-VAD-fmk, inhibitor kaspazne je bila uporabljena pred začetkom zdravljenja H 2O 2 ali TNF α. Predobdelava Z-VAD-fmk močno oslabljen H 2O 2 ali TNF-α inducirano celično apoptozo kot kaspaza-3 aktivnosti v obeh OLFM4 razgradljiv celic (P < 0,01) (slika 6C-D ), kar kaže, da je H 2O 2 ali TNF-α inducirano apoptozo kaspaze-3 odvisno v OLFM4 rasklapanje celicah. Slika 6 Sodelovanje kaspaze-3 aktivnosti v H 2 O 2 in TNF-α povzroča apoptozo v OLFM4 rasklapanje SGC-7901 in MKN45 celice. (A-B) Povečana kaspaze-3 aktivnosti v H2O2 ali TNF-a obdelan OLFM4 rasklapanje celic. OLFM4 rasklapanje in HK-kontrolnih celicah, smo obdelali z 10 uM H2O2 (A) ali 10 ng /ml TNF alfa (B) za 12 ur. Kaspaze-3 aktivnost smo merili z kolorimetrične testa in izražena v kratnih sprememb. ** P < 0,01 v primerjavi s PBS modelno skupino (n = 3). (C-D) reverzno celično apoptozo z zaviralcem kaspaze v OLFM4 razgradljiv celicah. Celice so bili zdravljeni samo s H2O2 ali TNF alfa z označenimi odmerkih kot je navedeno zgoraj, ali obdelamo z 20 iM Z-VAD-fmk 2 uri pred H2O2 ali TNF alfa zdravljenja. Odstotek apoptotskih celic smo določili s FCM. Podatki predstavljajo sredstva ± SD od treh neodvisnih poskusih. ** P lt; 0,01 vs. H2O2 (C) ali TNF alfa (D) zdravljene OLFM4 rasklapanje celice skupina.
Razprava
kratkim kopičijo podatki pokazali OLFM4 pogosto izraženi pri številnih vrstah človeških tumorjev, vključno z rakom želodca in so verjeli, da igrajo ključno vlogo pri razvoju in napredovanju želodca rakotvornosti [19, 20]. Čeprav so prejšnje študije pokazale, da je OLFM4 vključen v apoptozo in tumorske rasti, nedavne ugotovitve tudi kažejo, da lahko obstajajo učinki celice ali tkiva, specifične za gen OLFM4. Relativno malo znanega o tumorske rasti in apoptozo osnovnega želodčnega raka specifično OLFM4 izražanja. Da bi bolje razumeli te vloge za spremenjeni OLFM4 raka človeškega želodca, je potrebna eksperimentalna podpora za potrditev vloge gena OLFM4 raka želodca.
Pokazalo se je, da je nenormalno izraz HGC-1 se lahko uredi na transkripcijske ali posttranscriptional ravni [13]. V naših sedanjih del, smo neposredno raziskovali OLFM4 protein izraz vzorec v želodčnih rakavih celic in normalnih GES-1 celice. SGC-7901 in MKN45 celice, ki izražajo relativno visoke stopnje OLFM4 so bili izbrani za to študijo. Ker zmanjšuje ciljno izražanje genov, ki jih genetskih sredstev v trajnih celičnih linij je koristno za boljše razumevanje svoje vloge pri ohranjanju maligni fenotip zlasti v analizi genov, ki so bistvenega pomena za celično preživetje [21], smo ustvarili stabilne klon bazenov SGC-7901 in MKN45 izražanje OLFM4-siRNA ali umešana nadzor HK s pristopom siRNA, ki temelji na plazmida in potrdili knock-down učinkovitost OLFM4 gena na mRNA in koncentracije proteina s QRT-PCR in zahodni blot.
Naš sedanji dela kažejo, da ima OLFM4 bistveno vlogo pri želodčnem tumorigeneze raka. Rasklapanje od OLFM4 zavira proliferacijo in sposobnost rasti sidrišča neodvisen in vitro. Ksenogenskega vzorec tumorja in vivo, tudi pomeni, da je zmanjšala OLFM4 lahko zavirajo rast tumorjev človeških želodčnih rakavih celic. Ti rezultati kažejo, da ima OLFM4 ključno vlogo pri celično proliferacijo želodca rakavih celic. Naši rezultati opazili tudi, da knock navzdol od OLFM4 ni vplivala na stopnjo apoptoze in kaspaze-3 in 9 aktivacij v OLFM4 rasklapanje celicah, kar kaže, da apoptoza morda ne bo mehanizem temelji inhibicijo rasti tumorjev. Tako smo domnevajo, da je OLFM4 izraz ni bistvenega pomena za rakave celice preživetje, ki je v skladu z nedavno ugotovitvijo, da genetski miši knock-out za OLFM4 pokaže normalen razvoj in hemopoetičnih fenotipi [17]. Nadalje karakterizacijo mehanizem temelji inhibicijo rasti, smo izvedli analize celičnega cikla in dokaže, da inhibicija OLFM4 izražanja povzroča želodčne rakave celice na naberejo v G1 fazi celičnega cikla, kar kaže, da navzdol regulirano OLFM4 lahko deluje zaviralno vpliva na rast celic, ki jih napredovanje celičnega ciklusa mehanizem, ki ureja, ki ne vključujejo apoptozo v želodcu rakavih celic.
Odpornost tumorskih celic za indukcijo apoptoze, je eden od glavnih dejavnikov, ki so odgovorni za neuspeh številnih konvencionalnih zdravil proti raku, ki uporabljajo proti raku in sevanja. Zato je nadzor apoptozo v rakavih celicah je kritičnega biološke in kliničnega pomena [22, 23]. Anti-apoptotske aktivnosti je še ena pomembna funkcija OLFM4 gena [2]. Zlasti je H 2O 2-inducirano celično apoptozo oslabljen s prekomerno OLFM4 v prostate rak celične linije [2]. Poleg tega so bili MKN45 celice pokazale zmožnost odpora na TNF α-inducirane apoptoze [24]. Glede na te ugotovitve, smo hipotezo, da lahko rasklapanje od OLFM4 izražanja povečati H 2O 2 ali TNF α-inducirano apoptozo v želodcu rakavih celic. Tukaj smo pokazali, da knock navzdol od OLFM4 učinkovito okrepljeno apoptoza celic v odgovoru na H 2O 2 ali TNF alfa stimulacijo v MKN45 kot tudi SGC-7901 celic, ki kažejo, da blokira OLFM4 lahko poveča dovzetnost za nastanek raka želodca celice v prisotnosti H 2O 2 ali TNF α.
Kot je splošno znano, da je glavni izvršni molekula apoptotske poti, ima kaspaza-3 ključno vlogo pri apoptotičnih procesov v različnih celic. nadalje smo pregledali aktivacije kaspaze-3 v OLFM4 rasklapanje in kontrolnih celic HK v prisotnosti ali odsotnosti inhibitorja kaspaze Z-VAD-fmk. Ugotovili smo, da je obravnava H 2O 2 ali TNF a precej up-reguliran kaspazne-3 aktivnosti v OLFM4 rasklapanje celicah kot kontrolnih celic iz Hongkonga, medtem ko je predhodno zdravljenje z Z-VAD-fmk obrnil kaspaze-3 aktivnosti, kot tudi kot H 2O 2 ali TNF-alfa inducirane apoptoze. Rezultati kažejo, da je H 2O 2 ali TNF α-inducirano apoptozo v OLFM4 rasklapanje celicah kaspaze-3 odvisni. Na podlagi trenutnih podatkov, je mogoče, da se regulirano OLFM4 omogoča želodčne rakave celice, da se uprejo indukcijo apoptoze z zmanjšanjem občutljivost za proti raku drog.
V bistvu, so poročali antagonisti OLFM4 zaviral delitev v drugih vrstah rakave celice, kot so celice človeškega raka trebušne slinavke PANČ-1 [8] in celic človeških pljuč CANER SBC-1 [9]. Vendar pa je bilo opaziti tudi spornih rezultatov. Zmanjšana OLFM4 mRNA zavira PANČ-1 celice širjenje z S do G2 /M fazo prijetje [8], ki se razlikuje od naših rezultatov, ki kažejo zamudo G1 fazi napredek pri raku želodca. Nekatere pomembne podrobnosti (ali razlogi) lahko razloži to razliko. Prvič, nedavne študije kažejo, celica ali tkivo posebno vlogo OLFM4 (rak želodca celice in trebušne slinavke rakave celice) lahko prepričljiva razlaga za to neskladje. Najbolj izstopajoč je, OLFM4 izraz na ravni mRNA, ne pa raven beljakovin v celicah PANČ-1 je bil uspešno merijo z RT-PCR [8], ker zadnje poročilo Kim et al. je pokazala, da ima PANČ-1 celice ne OLFM4 mRNA izražanja [25], ki označuje izraz vzorec in vlogo OLFM4 gena v celice PANČ-1 je treba dodatno potrditev.
Kljub temu je OLFM4 dušenje prikazano na zaviralni učinek na rast celic in A zmanjšanje odpornosti proti H 2O 2 ali TNF α obravnavanja pri želodčnih rakave celice, da se ne izloča, da lahko drugi mehanizmi je treba urediti tudi OLFM4 in prispeva k zaviranju rasti in nadzor apoptoza signalizacijo, glede na presluha omrežja .

• epidermalni rastni dejavnik, receptor strukturne spremembe pri raku želodca
• Izrazi COX-2 in VEGF-C pri raku želodca: korelacije z limfangiogenezo in prognostičnih posledice