Ehtyminen OLFM4 geenin estää solujen kasvua ja lisää herkistyminen vetyperoksidia ja tuumorinekroositekijä-alfa indusoi-apoptoosin mahasyövän soluissa

Ehtyminen OLFM4 geenin estää solujen kasvua ja lisää herkistyminen vetyperoksidia ja tuumorinekroositekijä-alfa indusoi-apoptoosin mahasyövän soluissa
Abstract
tausta
Human olfactomedin 4 (OLFM4) geeni on erittyvä glykoproteiini yleisemmin tunnettu anti-apoptoottisen molekyylin GW112. OLFM4 on todettu olevan usein säädelty monenlaisissa ihmisen kasvaimissa kuten mahasyövän ja sen uskottiin pelata merkittävä rooli etenemistä mahasyövän. Vaikka toiminta OLFM4 on osoitettu monissa tutkimuksissa, viimeaikaiset todisteet vahvasti siihen solun tai kudoksen tyyppi riippuvainen rooli OLFM4 solujen kasvun ja apoptoosin. Tutkimuksen tavoitteena on tutkia roolia mahasyövän-erityinen ilmaisu OLFM4 solujen kasvun ja apoptoosin vastus. Tool Menetelmät
OLFM4 ilmentyminen oli eliminoitu RNA häiriöitä SGC-7901 ja MKN45 soluja. Solujen lisääntyminen, ankkurointi riippumattoman kasvun, solukierron ja apoptoosin leimasi in vitro. Tuumorigeenisyystesti analysoitiin in vivo. Apoptoosin ja kaspaasi-3 aktivaatio vasteena vetyperoksidin (H 2O 2) tai tuumorinekroositekijä-alfa (TNF-α) arvioitiin läsnä ollessa tai puuttuessa kaspaasiestäjä Z-VAD-fmk.
tulokset
poistaminen OLFM4 proteiinin RNA häiriöitä SGC-7901 ja MKN45 solujen estää merkittävästi kasvainten muodostumiseen sekä in vitro että in vivo induktioon solun G1 pidätys (kaikki P < 0,01). OLFM4 Knockdown ei laukaissut ilmeinen solujen apoptoosin, mutta kasvoi H 2O 2 tai TNF α aiheuttama apoptoosin ja kaspaasi-3: n aktiivisuuden (kaikki P < 0,01). Hoito Z-VAD-fmk heikennettyjä kaspaasi-3: n aktiivisuuden ja merkittävästi kääntänyt H 2O 2 tai TNF α aiheuttama apoptoosin OLFM4 taintumisen soluissa (kaikki P < 0,01).
Päätelmä
Tutkimuksemme osoittaa, että ehtyminen OLFM4 merkittävästi estää kasvainten muodostumiseen ja mahasyövän SGC-7901 ja MKN45 soluja. Esto OLFM4 ilme voi herkistää mahalaukun syöpäsolujen H 2O 2 tai TNF α hoitoa lisäämällä kaspaasi-3-riippuvaisten apoptoosin. Yhdistelmä perustuva strategia OLFM4 estoon ja syöpälääkkeiden hoito voi tarjota terapeuttista potentiaalia mahasyövässä intervention.
Avainsanat
Mahasyöpää Olfactomedin 4 RNA-interferenssi Cell kasvun apoptoosin resistenssin tausta
Human OLFM4 (olfactomedin 4, joka tunnetaan myös HGC-1, GW112), alun perin nimeltään ihmisen kloonattu myelooinen esiastesoluista jälkeen granulosyyttipesäkkeitä stimuloiva tekijä stimulaatio [1], on erittyvä glykoproteiini, joka tunnetaan paremmin nimellä anti-apoptoottisten molekyylin GW112 [2, 3]. OLFM4 ekspressoidaan normaalisti luuytimessä, eturauhasessa, ohutsuolessa, mahalaukussa, paksusuolen ja haiman [1, 4]. Myöhemmin lisääntynyt OLFM4 tasot havaittiin myös kryptassa epiteelin tulehtunut paksusuolen limakalvon tulehduksellisten suolistosairauksien [5] ja mahalaukun koepaloja tartunnan Helicobacter pylori [6, 7]. Viime aikoina sääteli OLFM4 ilmentyminen on kuvattu keuhko- ja rinta- [8], eturauhasen [3], mahalaukun [3, 9] ja haiman syövät [8, 9] sekä peräsuolen adenoomien [10-14].
on ehdotettu, että OLFM4 on osallisena solu-prosessi, kuten apoptoosin ja kasvaimen kasvua [2]. Vaikka solujen toiminta OLFM4 on tutkittu, nämä tulokset eivät aina samanaikaisesti. Yliekspressio OLFM4 on osoitettu helpottavan hiiren eturauhassyövän Kulkuri-C1-solujen kasvuun syngeenisissä C57 /BL6-hiirissä [2], mutta estää ihmisen eturauhassyöpä PC-3-solujen lisääntymisen [15]. Lisäksi säädelty OLFM4 osoitti voimakas anti-apoptoottista aktiivisuutta hiiren lymfoidisissa laskimon endoteelisolujen SVEC solut ja ihmisen adenokarsinooman HeLa-soluissa [1, 2], kun taas viimeaikaisten havaintojen ehdotti proapoptoottiset vaikutus OLFM4 ihmisen myelooista leukemiaa HL-60-solujen [16 ]. Todisteet Näistä tutkimuksista viittaa vahvasti siihen, että roolit OLFM4 solujen kasvun säätelyssä ja apoptoosin voivat riippua solun tai kudoksen tyyppi [10, 13-15]. Tähän mennessä on kuitenkin hyvin niukasti tietoa roolista OLFM4 solun kasvun ja apoptoosin profiilit mahalaukun syöpäsolujen on julkaistu.
Tässä tutkimuksessa kartoitettiin OLFM4 proteiinin ilmentymistä mahasyövässä soluissa ja normaalin ihmisen mahalaukun epiteelin GES-1-soluissa western-blottauksella. Käyttäen plasmidia välittämä lyhyt hiusneula-RNA (shRNA), me esti OLFM4 ilmaisun mahasyövän SGC-7901 ja MKN45 solujen tarkkailla solujen lisääntymistä, solusyklin vaihe, apoptoosin in vitro ja arvioida sen tuumorigeenisia kapasiteetti in vivo. Olemme myös tutkineet apoptoosia ja kaspaasi-3-aktivaation vasteena sytotoksisille aineille, kuten H 2O 2: n tai TNF α läsnä ollessa tai puuttuessa kaspaasiestäjä Z-VAD-fmk välillä OLFM4 pudotus solujen ja HK kontrollisolujen . Tool menetelmät
Soluviljely, reagenssit ja hiiret
ihmisen mahalaukun syöpäsolut BGC-823, HGC-27, SGC-7901, MKN28, MKN45 ja ihmisen normaalia mahalaukun epiteelin GES-1-soluja ylläpidettiin DMEM (GibcoBRL, Gaithersburg, MD), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS, GibcoBRL, USA), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. H 2O 2 ja TNF-α saatiin Sigma (St. Louis, MO) ja Z-VAD-fmk hankittiin Calbiochem (San Diego, CA). BALB /C nude (nu /nu) hiirten (4-6 viikon ikäisiä, SPF aste, 20 ± 3 g) hankittiin Laboratory Animal Center of Chongqing Medical University (Chongqing, Kiina). Kaikki menetelmät suoritettiin kansainvälisesti hyväksyttyjen eettisten ohjeiden (NIH julkaisu no. 85-23, tarkistettu 1985).
Plasmidikonstrukteja ja vakaa transfektio
shRNA välittämää RNAi-plasmidia (pGenesil 1,1-siOLFM4) ja sekoitetun ohjaus plasmidi (pGenesil 1,1-HK) rakennettiin kaataa endogeenisen OLFM4 in SGC-7901 ja MKN45 soluja. Transfektion jälkeen ja neomysiiniä (G418) valinta, OLFM4 knock-down SGC-7901-siOLFM4, MKN45-siOLFM4 solujen ja salattu SGC-7901-HK, MKN45-HK ohjaus solut stabiilisti saatiin, vastaavasti (yksityiskohdat esitetty Additional tiedosto 1: Täydentävä data).
RNA ja kvantitatiivinen RT-PCR: llä (qRT-PCR) B Kokonais-RNA eri soluissa tai tuumoriksenografteja uutettiin käyttämällä RNeasy Mini Kit (Qiagen, CA, USA), ja sitä seurasi cDNA-synteesi käyttäen ReverTra Ace-α-ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi-järjestelmän (Toyobo, Osaka, Japani) kuin edellinen on kuvattu [17]. Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR suoritettiin käyttäen 7500 reaaliaikainen PCR-järjestelmä (Applied Biosystems) ja SYBR-Green kuten fluoresoiva väri (Toyobo, Osaka, Japani) (yksityiskohdat esitetään Additional tiedosto 1: Täydentävä data). Kertamuutoksia geenien ilmentyminen määritettiin käyttäen "2 - ddCT" -menetelmä [18].
Soluproliferaatiomääritys in vitro ja solujen elinkelpoisuuden mittausta
Solujen lisääntyminen ja solujen elinkelpoisuus mitattiin käyttäen Cell leviämisen WST-1 Kit (Roche ) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Solun proliferaatiota, solut siirrostettiin tiheyteen 1 x 10 3 solua per kuoppa 96-kuoppalevyille ja kasvatettiin 5 päivää. Optinen tiheys (450 nm) arvo havaittiin käyttäen mikrolevylukijaa (TACAN, Swazimaa) päivässä. Kukin määritys suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Koska mittaus solujen elinkykyä, soluja (1 x 10 4 /kuoppa) ympättiin 200 ui elatusainetta 96-kuoppaisilla levyillä. 12 tunnin kuluttua inkuboinnin H 2O 2 tai TNF α käsiteltiin ilmoitettuina pitoisuuksina. Suhteellinen absorbanssi mitattiin kuvatulla tavalla solujen lisääntymisen.
Anchorage riippumattoman kasvun määrityksessä
Anchorage riippumattoman kasvun suoritettiin pehmytagar pohtimaan in vitro kyky muodostaa klooneja. Lyhyesti, solut (5 x 10 2) kustakin pesäkkeen suspendoitiin 0,3% agar DMEM ja sitten maljattiin jähmettynyt agar (0,5%) 6-kuoppaisilla ruokia. Soluja inkuboitiin 2 viikkoa 37 ° C: ssa 5% CO 2 ennen pesäkkeiden mitattiin. Pesäkkeiden määrä laskettiin 200 x suurennus viiden satunnaisen kenttiä. Kukin määritys suoritettiin kolmena rinnakkaisena.
Virtaussytometrianalyysi
Virtaussytometria (FCM) analyysi suoritettiin arvioimaan solusyklin etenemisen tai apoptoosin. (Yksityiskohdat esitetty Muihin tiedosto 1: täydentävä data) B-kaspaasi-määritys
entsyymiaktiivisuus kaspaasi-3 ja -9 mitattiin käyttämällä fluorometrisen määrityksen mukaisesti edellä kuvatun menetelmän [8].
Western blot -analyysi
Western-blottaus suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [17]. Seuraavia vasta-aineita käytettiin Western blotting: anti-OLFM4 (Abcam, Cambridge, UK) ja anti-β-aktiini (Santa Cruz, CA, USA) suhteellinen määrä proteiineja analysoitiin käyttäen Määrä Yksi ohjelmisto (Bio-Rad, Hercules , CA, USA) ja normalisoitu kuin β-aktiini (yksityiskohdat esitetty Additional tiedosto 1: täydentävä data).
Vieraslajisiirteen kasvainmuoto
Fourty nude-hiiret jaettiin neljään ryhmään satunnaisesti. Kukin ryhmä ruiskutettiin ihon alle selän kanssa suspension 200 ui, joka sisälsi 2 x 10 6 solua edellä mainituista, vastaavasti. Tilavuus -ksenografteissa sarjoittain mitattiin. Hiiret tapettiin 35 päivää. Ksenograftit leikattiin irti ja punnittiin. Esto hinnat -ksenografteja lasketaan kaavalla: esto (%) = 1-keskipaino (OLFM4 kaataa solut ruiskutetaan ryhmä tai HK säätökennoja suihkutuksella ryhmä) /keskimääräinen paino (HK kontrollisoluja suihkutuksella ryhmä) × 100%. Sitten kasvainkudoksen edellytyksenä oli kokonais-RNA: eristäminen tai immunohistokemialla havaitsemiseen.
Immunohistokemia (IHC)
OLFM4 proteiinien tuumoriksenografteja analysoitiin IHC käyttäen kaniinin anti OLFM4 (Abcam, Cambridge, UK) (yksityiskohdat on esitetty Muita tiedosto 1: täydentävä data).
tilastot
tiedot itsenäisestä kokeesta ilmaistiin keskiarvona ± SD vähintään kolmen kokeen. Vertailut ryhmien välillä analysoitiin kaksisuuntaisella Studentin t
-testi tai ANOVA tarvittaessa ja p-arvot < 0,05 katsottiin olevan tilastollisesti merkitsevä.
Tulokset
tehokas knock alas OLFM4 geenin plasmidi-välitteisen siRNA mahasyövän soluissa
OLFM4 proteiinin ilmentyminen kuvio tutkittiin mahalaukun syövän BGC-823, HGC-27, SGC-7901, MKN28, MKN45 solut ja normaali GES-1 ohjaus-solujen (kuvio 1A). OLFM4 proteiini ehdottomasti ilmaisee kaikilla näillä mahalaukun syöpäsolut ja GES-1-soluissa. Erityisesti SGC-7901 ja MKN45 solut ilmaistu suhteessa korkean tason OLFM4 proteiinia kuin muut mahalaukun syöpäsolujen ja GES-1-soluissa. Näin ollen, SGC-7901 ja MKN45 solut valittiin lisätutkimuksiin. Kuva 1 Tehokas knockdovvn OLFM4 RNA häiriöitä mahasyövässä SGC-7901 ja MKN45 soluja. A. ilmentäminen OLFM4 proteiinia erilaisissa mahasyövässä solulinjoissa. Expression profile of OLFM4 proteiinia analysoitiin western blotting, jossa β-aktiini sisäisenä kontrollina. GES-1-soluja saatavilla normaalisti ohjaus soluissa. B. OLFM4 mRNA ilmaisun OLFM4 knockdown soluissa. Suhteellinen ilmentyminen OLFM4 havaittiin qRT-PCR: llä. β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. Kertainen muutokset OLFM4 mRNA: n ilmentymisen määritettiin käyttäen 2-ΔΔCt menetelmällä. C. OLFM4 proteiinin ilmentymistä OLFM4 knockdown soluissa. OLFM4-proteiinin ekspressio havaittiin Western-blottauksella. p-aktiini-proteiinia käytettiin sisäisenä kontrollina. Edustajat kolmesta kokeesta esitetään. ** P < 0,01 vs. HK kontrollisolut (n = 3).
Jotta alas-säädellä OLFM4 ilmentymistä, plasmidi-välitteisen shRNA kohdistaminen OLFM4 geeniin stabiilisti kaataa OLFM4 ilmentymisen SGC-7901 ja MKN45 soluja. Kuten kuviossa 1B on esitetty, OLFM4 mRNA-tasot olivat vähentyneet huomattavasti SGC-7901-siOLFM4 ja MKN45-siOLFM4 soluja verrattuna niiden HK ohjaus- tai emosoluista (P < 0,01). Nämä tulokset vahvistettiin lisäksi western blotting-analyysi (kuvio 1 C). Ei ole merkittävää eroa OLFM4 ilmentyminen havaittiin emo ja HK ohjaus soluja. Tasot mRNA ja proteiini varten β-aktiini oli samankaltainen eri ryhmissä. Nämä tulokset viittaavat siihen, että plasmidi-välitteisen OLFM4-siRNA voi spesifisesti ja tehokkaasti kaataa OLFM4 tason mahalaukun syöpäsoluja. Ottaen huomioon analyysi edellä siksi OLFM4 kaataa soluja ja HK ohjaus solut valittiin lisätutkimuksia varten.
OLFM4 Knockdown estää mahalaukun syöpäsolujen lisääntymistä ja ankkurista riippumaton kasvu in vitro
määrittämiseksi roolin OLFM4 maha- syöpäsolujen kasvua, tutkimme vaikutus OLFM4-siRNA solun kasvu 1-5 päivän ajan pisteen WST-1 määrityksessä. Kuten kuviossa 2A on esitetty, kaikissa kaksi mahasyövän solulinjojen kasvua OLFM4 kaataa soluissa oli merkittävästi vähentynyt verrattuna HK ohjaus solujen päivänä 3 (P < 0,01). Tutkimaan edelleen tärkeyden OLFM4 että kasvainten synnyssä mahasyövän soluissa in vitro, toteutimme ankkurista riippumaton kasvu määritykset ja löysi SGC-7901 ja MKN45 solut ilmentävät HK valvontaa kasvoi hyvin pehmeä agar, muodostaen erillisiä pesäkkeitä. Sen sijaan, OLFM4 pudotus SGC-7901 ja MKN45 solujen osoitti dramaattinen väheneminen määrä pehmeässä agarissa pesäkkeiden (P < 0,01) (kuvio 2B), mikä osoittaa, muuttamalla kyvyt vähemmän kuin kontrollisoluihin. Nämä tulokset osoittivat, että knock-alas OLFM4 voi estää mahalaukun syövän solujen lisääntymisen ja ankkurista riippumaton kasvu in vitro. Kuvio 2 knockdovvn OLFM4 estää kasvun SGC-7901 ja MKN45 solujen in vitro ja in vivo. A. Solujen kasvukäyrä. Proliferaatiota in vitro arvioitiin solujen kasvua käyrä, kuten määritetty laskemalla solumäärä (WST-1-määritys) on SGC-7901-soluissa (vasen paneeli) ja MKN45 solut (oikea paneeli). OD-arvo (450 nm) laskettiin ilmoitettuihin päiviin ja esitetään keskiarvona solujen lukumäärä (n = 3). B. Anchorage riippumatonta kasvua pehmeässä agarissa. Edustavia kuvia kolmesta kokeesta näytettiin (ylempi paneeli). Tulokset edustavat keskiarvoa määrä pesäkkeiden 200 x suurennus 5 random kentät (alempi kuva). C. kasvaimen keskimääräisen tilavuuden jälkeen ihonalaisen nude-hiirten kanssa HK ohjaus tai OLFM4 Knockdown soluihin mitattiin ilmoitettuina ajankohtina. D. edustaja kasvaimia kuvia 35 päivän kuluttua ihonalaisen ilmoitettu soluja. E. kasvaimen keskipaino (vasen paneeli) ja estävä (oikea paneeli) in tuumoriksenograftien. Tulokset edustavat keskiarvoa kasvaimen paino ksenograftien (keskiarvo ± SD, n = 10). ** P < 0,01 vs. HK kontrolliryhmään.
Kasvua estävää vaikutusta väheni OLFM4 mahalaukun tuumoriksenografteja
Lisäksi meillä esiintyi myös ihonalainen kasvain formatiivista määritys nude-hiirissä arvioida kasvua vaimentava vaikutus alassäädetty OLFM4 in vivo. Nude-hiiriin injektoitiin subkutaanisti OLFM4 pudotus tai HK kontrollisoluihin. Kasvain per 4 päivää ja kasvaimen paino 5 viikkoa mitattiin vastaavasti jälkeen ihon alle. Kuten on esitetty kuviossa 2C-D, onko kasvaimen tilavuus tai kasvaimen painon tuottama OLFM4 kaataa SGC-7901 ja MKN45 solut olivat merkittävästi vähentää kasvua verrattuna kasvaimia tuotettiin hiirissä, joihin injektoitiin HK ohjaus-transfektoiduissa soluissa (P < 0,01). Inhibointimäärän on SGC-7901 ja MKN45 kaataa solut ruiskutetaan ryhmä kasvaimen kasvu oli 40,29% ja 37,48% (kuvio 2E).
Edelleen vakuuttaa OLFM4 ilmentyminen indeedly vaimennettu jälkeen ihonalaisen nude-hiirten, me myös arvioitu OLFM4 ilmentymistä tuumoriksenografteja käyttäen qRT-PCR ja IHC. Samoin in vitro, OLFM4 mRNA tasolla tuumoriksenografteja tuottaman OLFM4 Knockdown solut osoittivat myös merkittävä lasku verrattuna HK kontrollituumoreilla ksenografteja (P < 0,01) (kuvio 3A). Yhdenmukainen tulokset qRT-PCR, vähentää merkittävästi OLFM4 proteiinin havaittiin myös tuumoriksenografteja IHC (P < 0,01) (kuvio 3B ja 3C). Korkeampi harmaasävy ja vahva positiivinen signaali DAB visualisoinnin löydettiin tuumoriksenografteja HK kontrollisolujen-pistetään ryhmä. Päinvastoin, heikko ruskea värjäytyminen havaittiin tuumoriksenografteja of OLFM4 Knockdown solujen-pistetään ryhmä. Lisäksi enemmän suuria kuolion alueella havaittiin tuumoriksenografteja tuottaman HK säätökennoja takia nopean kasvun HK ohjaus soluja (kuvio 3B yläpaneeli). Nämä tiedot tarjotaan vahva osoitus siitä OLFM4 ilmentymistä mRNA ja proteiini tasoilla stabiilisti esti todellakin in vivo. Kollektiivisestikaan sekä in vitro ja in vivo kokeet viittaavat siihen, että OLFM4 pudotus estää niiden kasvun mahalaukun syöpäsoluja. Kuva 3 qRT-PCR ja IHC havaitseminen OLFM4 in tuumoriksenograftien. A. qRT-PCR OLFM4 mRNA tuumoriksenograftien. Kertainen muutokset OLFM4 mRNA määritettiin käyttäen 2-ΔΔCt menetelmällä. p-aktiini-geeni käytettiin sisäisenä kontrollina. B. H &E-värjäystä (yläpaneeli) ja IHC varten OLFM4 proteiinin (alempi paneeli) in tuumoriksenograftien. Kuvat ovat (200 x) on esitetty. N, kuolio. C. kvantifiointi analyysi OLFM4 ilmaisua. Keskimääräinen arvo mitattiin viidestä satunnaisesti eri alojen mikroskoopilla (400 x) käyttäen Image-Pro PLUS V6.0. Data ilmaistiin keskiarvona ± SD. ** P < 0,01 vs. HK kontrolliryhmään.
OLFM4 knock-down viiveitä G1-S siirtyminen mutta ei aiheuta ilmeistä apoptoosin mahalaukun syöpäsoluissa
Koska meidän havaittu estäviä vaikutuksia solujen kasvuun in vitro ja in vivo, pyrimme määrittämään onko tehostettu apoptoosin tai viivästynyt solusyklin etenemisen liittyi kasvun estäminen. Ensin arvioitiin vaikutus laski OLFM4 solusyklin etenemisen. Kuten on esitetty kuviossa 4A, sekä OLFM4 pudotus SGC-7901 ja MKN45 solut osoittivat merkittävästi lisätä numeroita G1 vaiheeseen ja laski numerot S-vaiheessa, toisin kuin niiden HK kontrollisoluja (P < 0,01). Mitään merkittäviä eroja ei havaittu G2 /M-vaiheen, osoittaa tyypillistä G1 viive solusyklin. Kuva 4 arviointi solusyklin jakelu, apoptoottisten solujen ja kaspaasi 3/9 aktivaation OLFM4 kaataa mahalaukun syöpäsoluja. A. Solusyklianalyysiä. Muutokset solusyklin jakautumista SGC-7901-HK, SGC-7901-siOLFM4 ja MKN45-HK, MKN45-siOLFM4 solut analysoitiin FCM. Tulokset edustavat keskiarvoa osuus solusyklin vaihe jakelu (n = 3). B. Solujen apoptoosin analyysillä. Apoptoosi arvioitiin anneksiiniV-PE /7-AAD värjäys FCM. Tulokset edustavat keskiarvoa apoptoottisten solujen prosenttiosuutena (n = 3). C. Kaspaasi-3 ja -9 aktivoinnit. Kaspaasi-3-, 9 aktivoinnit välillä osoitti solujen on esitetty. ** P < 0,01 vs. HK kontrolliryhmään.
Voit selvittää apoptoosin on mukana tässä kasvun estäminen, me seuraavaksi suoritetaan solun apoptoosin analyysi. Mielenkiintoista, vähensi OLFM4 ilmaisu ei aiheuta merkittäviä muutoksia apoptoosin (kuva 4B), joka on sopusoinnussa solusyklin analyysi osoittaa mitään näkyvää sub-G1 vaiheeseen testattu soluissa. Tutkimaan edelleen korjauksilla apoptoottisia signaaleja, kaspaasi-3 /-9 aktiivisuus tunnistettiin myös kolorimetrisellä aktivaatiotesteissä. Sekä kaspaasi-3 ja -9 aktivoinnit ei ilmennyt merkittäviä muutoksia jälkeen knockdovvn OLFM4 in SGC-7901 ja MKN45 soluja (kuvio 4C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että down-regulation of OLFM4 voi käyttää estävä vaikutus solujen kasvuun säätelemällä solukierron etenemisen, johon ei liity apoptoosia mahalaukun syövän soluissa.
Poistaminen OLFM4 herkistää mahalaukun syövän solujen H2O2 tai TNF α indusoiman apoptoosin
erilliset vaikutus H 2O 2 tai TNF α on apoptoosi OLFM4 kaataa ja HK ohjaus soluja tutkittiin myös. OLFM4 kaataa tai HK ohjaus soluja käsiteltiin 10, 100 ja 1000 uM H 2O 2 tai 5, 10 ja 50 ng /ml TNF α vastaavasti. Solujen elinkelpoisuus ja apoptoosin arvioitiin. Kuten kuvassa 5A-D, annoksesta riippuvaa vähenemistä solujen elinkelpoisuuden havaittiin H 2O 2 tai TNF α saaneista OLFM4 kaataa soluja. Lisäksi hoito 10pM H 2O 2 (kuvio 5A-B) tai 10 ng /ml TNF α (kuvio 5C-D) johti huomattavaan vähenemiseen solujen elinkelpoisuuden OLFM4 kaataa soluja verrattuna HK kontrollisoluja (P < 0,01). Erityisen kiinnostava on havainto, että OLFM4 Knockdown solut sijaan HK ohjaus soluja käsiteltiin 10 ~ 1000 uM H 2O 2 näytteillä näkyvämpi apoptoottisen prosentit verrattuna saaneilla PBS mock (P < 0,01) ( kuvio 5A-B). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin myös TNF α-käsiteltyjen OLFM4 pudotus soluissa (kuvio 5C-D). Toisin sanoen, OLFM4 kaataa parannettu H 2O 2: n tai TNF α-indusoitua apoptoosia in mahasyövän soluissa, mikä osoittaa, poistetaan OLFM4 valmistettu SGC-7901 ja MKN45 soluja herkempiä hoitoon H 2O 2 tai TNF α. Kuva 5 vaste OLFM4 pudotus SGC-7901 ja MKN45 solujen apoptoosia indusoivat aineet H 2 O 2 tai TNF α. OLFM4 pudotus ja HK-ohjaus soluja käsiteltiin H2O2 (A ja B) tai TNF α (C ja D), kuten annokset 12 tuntia. Solujen elinkelpoisuus mitattiin WST-1-määritys (A-D vasen paneeli) ja ilmaistaan ​​keskiarvo OD-arvo (450 nm) (n = 3). Prosenttiosuus apoptoottisten solujen määritettiin FCM (A-D oikea paneeli) ja ilmaistuna keskimääräisen apoptoottisen prosentteina (n = 3). * P < 0,05, ** P < 0,01 vs. HK kontrolliryhmään.
Kaspaasi-3-aktiivisuus osallistuu H2O2 tai TNF α aiheuttama apoptoosin OLFM4 knock-down-solut
Edellä esitetyt tulokset osoittivat, että kaataa of OLFM4 voisi lisätä H 2O 2 tai TNF α stimuloimaa apoptoosin. Edelleen ovatko kaspaasi-3 aktivoidaan H 2O 2 tai TNF α aiheuttama apoptoosin OLFM4 Knockdown soluissa, me seuraavaksi havaitaan kaspaasi-3-aktivaation H 2O 2 tai TNF a-käsitellyt solut käyttäen kolorimetristä määritystä. Kuten on esitetty kuviossa 6A, hoitoon H 2O 2: n tai TNF α johti paljon parantamiseksi kaspaasi-3-aktiivisuus OLFM4 pudotus soluja kuin HK kontrollisolut (P < 0,01), mikä viittaa siihen, kaspaasi-3-aktiivisuus on mukana H 2O 2 tai TNF α aiheuttama apoptoosin OLFM4 knockdown soluissa. Edelleen tarkistaa, H 2O 2 tai TNF α aiheuttama apoptoosin riippuu kaspaasi-3: n aktiivisuuden, Z-VAD-fmk kaspaasin estäjä käytettiin ennen hoitoon H 2O 2 tai TNF α. Esikäsittely Z-VAD-fmk merkittävästi heikennetty H 2O 2: n tai TNF α indusoiman apoptoosin sekä kaspaasi-3-aktiivisuus sekä OLFM4 knockdown-soluja (P < 0,01) (kuvio 6C-D ), mikä osoittaa, että H 2O 2: n tai TNF α: n indusoiman apoptoosin on kaspaasi-3-riippuvaista OLFM4 pudotus soluissa. Kuvio 6 osallistuminen kaspaasi-3-aktiivisuus H 2 O 2: n tai TNF α-indusoitua apoptoosia in OLFM4 pudotus SGC-7901 ja MKN45 soluja. (A-B) Lisääntynyt kaspaasi-3-vaikutuksen H2O2 tai TNF α-käsiteltyjen OLFM4 knockdown soluja. OLFM4 pudotus ja HK-ohjaus-soluja käsiteltiin 10 uM H2O2: ta (A) tai 10 ng /ml TNF-α (B) 12 tuntia. Kaspaasi-3-aktiivisuus mitattiin käyttämällä kolorimetristä määritystä ja ilmaistaan ​​kertaiseksi muutoksia. ** P < 0,01 vs. PBS mock ryhmä (n = 3). (C-D) Käänteinen solujen apoptoosin kaspaasiestäjä vuonna OLFM4 knockdown soluissa. Soluja käsiteltiin H2O2 tai TNF α yksin ilmoitetuilla annoksilla kuin edellä mainittiin tai esikäsitellä 20 uM Z-VAD-fmk 2 h ennen H2O2 tai TNF α hoitoon. Prosenttiosuus apoptoottisten solujen määritettiin FCM. Data edustaa keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. ** P < 0,01 vs. H2O2 (C) tai TNF α (D) hoidetun OLFM4 pudotus solujen ryhmä.
Keskustelu
Äskettäin kertyvät tiedot osoittivat OLFM4 usein yli-ilmentyy monentyyppisiä ihmisen kasvaimissa kuten mahasyövän, ja sen uskottiin ratkaiseva rooli kehityksessä ja etenemiseen mahasyövän [19, 20]. Vaikka aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että OLFM4 on mukana apoptoosin ja kasvaimen kasvua, Viimeaikaiset havainnot viittaavat myös siihen, että solu- tai kudosspesifisiä vaikutuksia voi olla, että OLFM4 geenin. Suhteellisen vähän tiedetään koskien kasvaimen kasvun ja apoptoosin taustalla mahasyövän erityisiä OLFM4 ilmentymistä. Jotta saataisiin parempi käsitys tämän roolin muuttuneen OLFM4 ihmisen mahasyövän, kokeellinen tukea tarvitaan vahvistamaan roolia OLFM4 geenin mahasyövässä.
On osoitettu, että epänormaali ilmentyminen HGC-1 voidaan säännellä transkriptionaalisella tai posttranskriptionaalisella tasolla [13]. Meidän hetkellä töitä, me suoraan tutkittu OLFM4 proteiinin ilmentämiskuviota mahasyövässä soluissa ja normaali GES-1-soluissa. SGC-7901 ja MKN45 solut, jotka ilmentävät suhteellisen korkeita OLFM4 tasot valittiin tätä tutkimusta varten. Koska vähentää kohdegeenin ilmentymisen geneettinen keinoin pysyviä solulinjoja on hyödyllistä ymmärtää paremmin sen tehtävä alueiden pahanlaatuiseen fenotyyppiin erityisesti analysoitaessa geenejä, jotka ovat välttämättömiä solujen selviytymisen [21], me syntyy stabiili klooni altaissa SGC-7901 ja MKN45 ilmentävät OLFM4-siRNA tai sekoitetun HK valvonta plasmidipohjaista siRNA lähestymistapa ja vahvistetaan knock-down tehokkuutta OLFM4 geenin mRNA ja proteiini tasoja qRT-PCR ja western-blottauksella.
Nykyinen teoksia osoittavat, että OLFM4 näyttelee keskeinen rooli mahasyövässä kasvainten synnyssä. Knockdovvn OLFM4 estää solujen lisääntymisen ja ankkurista riippumaton kasvu kyky in vitro. Ksenografti kasvain malli in vivo myös sitä, että vähentynyt OLFM4 voi estää kasvaimen kasvua ihmisen mahalaukun syöpäsoluja. Nämä tulokset osoittavat, että OLFM4 keskeinen rooli solujen leviämisen mahalaukun syöpäsoluja. Tuloksemme myös havaittu, että knock-alas OLFM4 ei vaikuttanut nopeus apoptoosin ja kaspaasi-3 ja 9 aktivointia OLFM4 pudotus soluissa, mikä viittaa siihen, että apoptoosin ehkä ole mekanismia taustalla tuumorikasvun eston. Niinpä olettaa, että OLFM4 ilmaisu ei ole välttämätön syöpäsolun selviytyminen, joka on sopusoinnussa äskettäin havainto, että geneettinen knock-out hiirille OLFM4 näyttää normaalin kehityksen ja hematopoieettisten fenotyyppien [17]. Edelleen karakterisoimiseksi mekanismin taustalla kasvun estäminen, teimme solusyklin analyysi ja osoitti, että inhibitio OLFM4 ilmentymisen indusoima mahan syöpäsolujen kerääntyä G1 vaiheen solusyklin, viittaa siihen, että alaspäin säädelty OLFM4 voi käyttää estävä vaikutus solujen kasvuun mekanismi säätö- solusyklin etenemisen, johon ei liity apoptoosia mahalaukun syövän soluissa.
Resistance kasvainsolujen apoptoosin on yksi tärkeimmistä tekijöistä, etteivät monet tavanomaiset syöpähoitoihin, jotka käyttävät syövän vastaisia ​​aineita ja säteily. Siksi apoptoosin ohjaus syöpäsoluissa on kriittinen biologinen ja kliininen merkitys [22, 23]. Anti-apoptoottista aktiivisuutta on toinen tärkeä tehtävä OLFM4 geenin [2]. Erityisesti H 2O 2 aiheuttamaa solujen apoptoosin lievitti ilmentynyt OLFM4 on eturauhasen syöpä solulinja [2]. Lisäksi MKN45-solujen on osoitettu kyky resistenssin TNF α-indusoidun apoptoosin [24]. Näiden havaintojen oletamme, että knockdovvn OLFM4 ilmaisun voisi parantaa H 2O 2 tai TNF α aiheuttama apoptoosin mahasyövässä soluissa. Täällä, osoitimme, että knock-alas OLFM4 tehokkaasti parantaa solujen apoptoosin vastauksena H 2O 2 tai TNF α stimulaation MKN45 sekä SGC-7901-soluissa, mikä viittaa siihen, estämällä OLFM4 saattaa lisätä alttiutta mahasyövän solujen läsnäolo H 2O 2: n tai TNF α.
Kuten on hyvin tunnettua, että kaspaasi-3, on keskeinen johtoon molekyylin apoptoottisen reitin, on ratkaiseva merkitys apoptoottisten prosessien eri soluja. Olemme lisäksi tutkittiin kaspaasi-3-aktivaation OLFM4 pudotus ja HK-ohjaus solujen läsnä ollessa tai puuttuessa kaspaasiestäjä Z-VAD-fmk. Havaitsimme, että hoito H 2O 2: n tai TNF-a merkittävästi säädelty kaspaasi-3 aktiivisuutta OLFM4 Knockdown soluja kuin HK kontrollisolut taas esikäsittely Z-VAD-fmk päinvastaiseksi kaspaasi-3: n aktiivisuuden sekä kuten H 2O 2 tai TNF α: n indusoiman apoptoosin. Tulokset osoittavat, että H 2O 2 tai TNF α aiheuttama apoptoosin OLFM4 Knockdown soluissa on kaspaasi-3 riippuvainen. Perustuu tämän datan, se on mahdollista, että säädelty OLFM4 avulla mahalaukun syövän solujen vastustaa apoptoosin vähentämällä alttius syöpälääkkeiden.
Itse asiassa, antagonistit OLFM4 on raportoitu estävän proliferaation muun tyyppisiä syöpäsolut, kuten ihmisen haimasyövän PANC-1-soluissa [8] ja ihmisen keuhkojen caner SBC-1-soluissa [9]. Kuitenkin myös ristiriitaisia ​​tuloksia on havaittu. Vähentynyt OLFM4 mRNA estävät PANC-1-solujen lisääntymistä S G2 /M vaiheessa pidätyksen [8], joka on erilainen kuin meidän tulokset osoittavat myöhässä G1 vaihe edistystä mahasyövässä. Tietyt tärkeät tiedot (tai syyt) voi selittää tätä eroa. Ensinnäkin, kuten viimeaikaiset tutkimukset ehdotti, solun tai kudoksen erityistä roolia OLFM4 (mahalaukun syöpäsoluja ja haimasyövän soluja) voi olla vakuuttava selitys tätä eroa. Huomattavin on, OLFM4 ilmentymisen mRNA-tasolla, mutta ei proteiinin tason PANC-1-soluissa onnistuneesti mitattiin käyttämällä RT-PCR [8], kun taas viimeisimmän raportin Kim et al. osoittivat, että PANC-1-soluissa ei ole OLFM4 mRNA: n ilmentymisen [25], mikä osoittaa, ekspressiomalli ja roolia OLFM4 geenin PANC-1-soluja on vielä vahvistuksen.
huolimatta OLFM4 hiljentäminen osoitettiin estävä vaikutus solujen kasvuun ja heikentynyt vastustuskyky H 2O 2 tai TNF α hoitoon mahalaukun syöpäsolujen, se ei poistu, että muut mekanismit voidaan myös säädellä OLFM4 ja edistää kasvun estäminen ja apoptoosin ohjaussignalointi, ottaen ylikuuluminen verkon . Todellakin, OLFM4, kohdegeenin NF-KB-reitin [16, 17, 25], on myös osoittanut negatiivista palautetta vaikutus H. pylori
-infektion aiheuttama NF-KB: n aktivaation in HEK 293-T-solut [6],

• Epidermaalisen kasvutekijän reseptori rakenteellisia muutoksia mahalaukun cancer
• Ilmauksia COX-2: n ja VEGF-C mahasyövän: korrelaatiot lymfangiogeneesiä sekä varoituksia implications