Uitputting van OLFM4 gen remt celgroei en verhoogt de gevoeligheid voor waterstofperoxide en tumornecrosefactor-alfa geïnduceerde apoptose bij maagkanker cells

uitputting van OLFM4 gen celgroei remt en verhoogt de gevoeligheid voor waterstofperoxide en tumornecrosefactor-alfa geïnduceerde apoptose in gastrische kankercellen
Abstracte achtergrond
Human olfactomedin 4 (OLFM4) gen is een uitgescheiden glycoproteïne beter bekend als de anti-apoptotische molecule GW112. OLFM4 blijkt vaak up-gereguleerd in vele soorten van humane tumoren waaronder maagkanker en men geloofde significante rol spelen in de progressie van maagkanker. Hoewel de functie van OLFM4 heeft in vele studies is aangegeven, recent bewijs wijst er sterk op een cel of weefseltype-afhankelijke rol van OLFM4 in celgroei en apoptose. Het doel van deze studie om de rol van maagkanker-specifieke expressie van OLFM4 in celgroei en apoptose resistentie te onderzoeken.
Methods
OLFM4 expressie werd uitgeschakeld door RNA interferentie in SGC-7901 en MKN45 cellen. Celproliferatie, verankering-onafhankelijke groei, celcyclus en apoptose gekarakteriseerd in vitro. Tumorgeniciteit werd geanalyseerd in vivo. De apoptose en caspase-3 activatie in respons op waterstofperoxide (H 2O 2) of tumornecrosefactor-alfa (TNF α) werden onderzocht in de aanwezigheid of afwezigheid van caspaseremmer Z-VAD-fmk.
Resultaten
De eliminatie van OLFM4 eiwit door RNA interferentie in SGC-7901 en MKN45 remt significant tumorigeniciteit zowel in vitro en in vivo door inductie van cel G1 arrest (alle P < 0,01). OLFM4 knockdown niet leiden tot de hand liggende cel apoptose maar verhoogde H 2O 2 of TNF-α-geïnduceerde apoptose en caspase-3-activiteit (alle P < 0,01). Behandeling van Z-VAD-fink verzwakt caspase-3-activiteit en een aanzienlijke ommekeer in de H 2O 2 of TNF-α-geïnduceerde apoptose in OLFM4 knockdown cellen (alle P < 0,01).
Conclusie
onze studie suggereert dat de uitputting van OLFM4 aanzienlijk remt tumorigeniciteit van de maagkanker SGC-7901 en MKN45 cellen. Het blokkeren van OLFM4 expressie kan maagkanker cellen sensibiliseren voor H 2O 2 of TNF-α behandeling door het verhogen van caspase-3 afhankelijke apoptose. Een combinatie strategie gebaseerd op OLFM4 behandeling remming en antikanker geneesmiddelen kunnen therapeutisch potentieel bij maagkanker interventie te bieden.
Sleutelwoorden
Maagkanker Olfactomedin 4 RNA interferentie groei Cell Apoptosis weerstand Achtergrond
Human OLFM4 (olfactomedin 4, ook bekend als HGC-1, GW112), oorspronkelijk genoemd gekloneerd uit humane myeloïde voorlopercellen na granulocyt-koloniestimulerende factor stimulatie [1], is een uitgescheiden glycoproteïne beter bekend als de anti-apoptotische molecule GW112 [2, 3]. OLFM4 wordt gewoonlijk uitgedrukt in beenmerg, prostaat, dunne darm, maag, darm en alvleesklier [1, 4]. Vervolgens verhoogde OLFM4 niveaus werden ook gevonden in de crypte epitheel ontstoken darmmucosa van inflammatoire darmziekten [5] en gastrische biopten geïnfecteerd met Helicobacter pylori [6, 7]. Meer recent is opgereguleerd expressie OLFM4 beschreven in long en borst [8], prostaat [3], maag [3, 9] en pancreaskankers [8, 9] en in colorectale adenomen [10-14].
Er is gesuggereerd dat OLFM4 betrokken is bij celprocessen zoals apoptose en tumorgroei [2]. Hoewel de cellulaire functie van OLFM4 is onderzocht, deze resultaten niet altijd samenvallen. Overexpressie van OLFM4 is aangetoond dat muis prostaattumor Tramp C1-celgroei in syngene C57 /BL6 muizen [2] vergemakkelijken, maar remt humane prostaatkanker PC-3 celproliferatie [15]. Bovendien opgereguleerd OLFM4 vertoonde een sterke anti-apoptotische activiteit in muizen lymfoïde endotheliale SVEC-cellen en humane adenocarcinoma HeLa-cellen [1, 2], terwijl recente bevindingen suggereerden een pro-apoptotisch effect van OLFM4 in humane myeloïde leukemie HL-60-cellen [16 ]. Gegevens uit deze studies suggereert sterk dat de rol van OLFM4 in celgroei en apoptose kan afhangen van de cel of weefseltype [10, 13-15]. Tot op heden echter weinig bekend over de rol van OLFM4 in de celgroei en apoptose profielen van maagkanker cellen is gepubliceerd.
In deze studie analyseerden we OLFM4 eiwitexpressie in maagkanker cellen en normale humane maagepitheel GES-1 cellen door Western blotting. Met behulp van plasmide-gemedieerde short hairpin RNA (shRNA), remde we OLFM4 meningsuiting in de maagkanker SGC-7901 en MKN45 cellen tot cel proliferatie, celcyclus fase apoptose in vitro te observeren en zijn tumorigene capaciteit in vivo te beoordelen. We onderzochten ook apoptose en caspase-3 activatie in respons op cytotoxische middelen zoals H 2O 2 of TNF α in aanwezigheid of afwezigheid van caspaseremmer Z-VAD-fmk tussen OLFM4 knockdown cellen en HK controlecellen .
methoden
Cell cultuur, reagentia en muizen
De menselijke maagkanker cellen BGC-823, HGC-27, SGC-7901, MKN28, MKN45 en menselijke normale maag epitheel GES-1-cellen werden DMEM medium gehandhaafd (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) dat 10% foetaal runderserum (FBS, Gibco BRL, USA), 100 U /ml penicilline en 100 ug /ml streptomycine. H 2O 2 en TNF-α werden verkregen van Sigma (St. Louis, MO) en Z-VAD-fmk werd verkregen van Calbiochem (San Diego, CA). BALB /C naakt (nu /nu) muizen (4-6 weken oud, SPF graden, 20 ± 3 g) werden gekocht van Laboratory Animal Center van Chongqing Medical University (Chongqing, China). Alle procedures werden uitgevoerd volgens de internationaal aanvaarde ethische richtlijnen (NIH publicatie nr. 85-23, herzien 1985).
Plasmide constructen en stabiele transfectie
shRNA-gemedieerde RNAi plasmide (pGenesil 1,1-siOLFM4) en een gecodeerd control plasmide (pGenesil 1,1-HK) werden geconstrueerd voor het neerslaan van de endogene OLFM4 in SGC-7901 en MKN45 cellen. Na transfectie en neomycine (G418) selectie, OLFM4 neerhalen SGC-7901-siOLFM4, MKN45-siOLFM4 cellen en roerei SGC-7901-HK, MKN45-HK controle cellen werden stabiel verkregen, respectievelijk (details getoond in Extra file 1: Aanvullende gegevens).
RNA-extractie en kwantitatieve RT-PCR (qRT-PCR)
Totaal RNA in verschillende cellen of xenotransplantaten werd geëxtraheerd met behulp van de RNeasy Mini Kit (Qiagen, CA, USA), en werd gevolgd door cDNA synthese met de ReverTra Ace-α-eerste streng cDNA synthese systeem (Toyobo, Osaka, Japan) zoals eerder beschreven [17]. Kwantitatieve real-time PCR werd uitgevoerd met 7500 real-time PCR-systeem (Applied Biosystems) met SYBR-groen als fluorescerende kleurstof (Toyobo, Osaka, Japan) (gegevens getoond in aanvullende bestandsinformatie 1: Aanvullende gegevens). Voudige veranderingen in genexpressie werden bepaald met de "2 - DDCT". Werkwijze [18]
celproliferatie assay in vitro en cellevensvatbaarheid gemeten
celproliferatie en levensvatbaarheid werden gemeten met celproliferatie WST-1 kit (Roche ) volgens de instructies van de fabrikant. Voor celproliferatie werden cellen geënt bij een dichtheid van 1 x 10 3 cellen per putje van een 96 putjes en gedurende 5 dagen. De waarde optische dichtheid (450 nm) werd gedetecteerd met de Microplate Reader (Tacan, Swaziland) per dag. Elke bepaling werd in drievoud uitgevoerd. Voor meting van levensvatbaarheid van de cellen, cellen (1 x 10 4 /putje) werden geënt bij 200 ul medium in 96-well platen. Na 12 uur incubatie H 2O 2 of TNF α is in aangegeven concentraties behandeld. Relatieve absorptie werd gemeten zoals beschreven in celproliferatie.
Anchorage-onafhankelijke groei assay
Anchorage-onafhankelijke groei werd uitgevoerd op zachte agar in vitro clonogenicity weerspiegelen. In het kort cellen (5 x 10 2) van elke kolonie werd gesuspendeerd in 0,3% agar in DMEM en vervolgens uitgeplaat op gestolde agar (0,5%) in 6-putjes. Cellen werden gedurende 2 weken bij 37 ° C in 5% CO 2 voor de kolonies gemeten. Aantal kolonies werd geteld bij 200 x vergroting vijf willekeurige velden. Elke bepaling werd in drievoud uitgevoerd.
Flowcytometrieanalyse
flowcytometrie (FCM) analyse werd uitgevoerd voortgang van de celcyclus of apoptose beoordelen. (Gegevens getoond in aanvullende bestandsinformatie 1: Aanvullende gegevens)
Caspasetest
enzymatische activiteit van caspase-3 en -9 werd gemeten met een fluorometrische assay volgens een eerder beschreven werkwijze [8]
Western blotanalyse.
Western blotting werd uitgevoerd zoals eerder [17] beschreven. De volgende antilichamen werden gebruikt voor western blotting: anti-OLFM4 (Abcam, Cambridge, UK) en anti-β-actine (Santa Cruz, CA, USA) de relatieve hoeveelheid eiwit werd geanalyseerd met Quantity One software (Bio-Rad, Hercules , CA, USA) en genormaliseerd tot die van β-actine (details afgebeeld in aanvullende bestandsinformatie 1. Bijkomende gegevens)
xenograft tumormodel
Veertig naakt muizen werden verdeeld in vier groepen willekeurig. Elke groep werd subcutaan in de rug van de suspensie van 200 pi met 2 x 10 6 cellen bovengenoemde respectievelijk. Het volume van xenotransplantaten werd serieel gemeten. De muizen werden opgeofferd na 35 dagen. De xenotransplantaten werden uitgesneden en gewogen. De remming tarieven van de xenotransplantaten werden berekend op basis van de formule: remming tarief (%) = 1-gemiddelde gewicht (OLFM4 knock down cellen-geïnjecteerde groep of HK controle cellen-geïnjecteerde groep) /gemiddelde gewicht (HK controle cellen-geïnjecteerde groep) × 100%. Vervolgens werd het tumorweefsel werd onderworpen aan totale RNA isolatie of detectie immunohistochemie.
Immunohistochemie (IHC)
OLFM4 eiwitten in tumor xenotransplantaten werden geanalyseerd door IHC met konijnen anti-OLFM4 (Abcam, Cambridge, UK) (gegevens getoond in extra bestand 1. bijkomende gegevens) Statistische gegevens
gegevens uit onafhankelijke experimenten werden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD van ten minste drie experimenten. Vergelijkingen tussen groepen werden geanalyseerd met tweezijdige Student's t
-test of ANOVA, in voorkomend geval, en p-waarden < 0,05 werden beschouwd als statistisch significant.
Resultaten
Efficiënte knock down van OLFM4-gen door plasmide gemedieerde siRNA bij maagkanker cellen
OLFM4 eiwit expressie patroon werd onderzocht bij maagkanker BGC-823, HGC-27 te zijn, SGC-7901, MKN28, MKN45 cellen en normale GES-1 controle cellen (Figuur 1A). OLFM4 eiwit tot expressie zeker in deze maagkanker cellen en GES-1 cellen. In het bijzonder, SGC-7901 en MKN45 cellen uitgedrukt in verhouding hoog niveau OLFM4 eiwitten dan andere maagkanker cellen en GES-1-cellen. Daarom SGC-7901 en MKN45 cellen werden gekozen voor verdere studies. Figuur 1 Efficiënte knock-down van OLFM4 door RNA-interferentie bij maagkanker SGC-7901 en MKN45 cellen. A. Expressie van OLFM4 eiwit in verschillende maagkanker cellijnen. Expressieprofiel van OLFM4 eiwit werd geanalyseerd met Western blotting met β-actine als een interne controle. GES-1 cellen dienden als normale controlecellen. B. OLFM4 mRNA expressie in OLFM4 knockdown cellen. Relatieve expressie van OLFM4 werd gedetecteerd met qRT-PCR. β-actine werd gebruikt als een interne controle. Veelvoudveranderingen in OLFM4 mRNA expressie werd bepaald met de 2-ΔΔCt methode. C. OLFM4 eiwitexpressie in OLFM4 knockdown cellen. OLFM4 eiwitexpressie werd gedetecteerd door western blotting. P-actine-eiwit werd gebruikt als een interne controle. Vertegenwoordigers van drie experimenten worden getoond. ** P < 0,01 versus HK controle cellen (n = 3). Belgique Om neerwaarts reguleren OLFM4 expressie, werd een plasmide-gemedieerde shRNA targeting OLFM4 gen geconstrueerd om stabiel knock down OLFM4 expressie in SGC-7901 en MKN45 cellen. Zoals getoond in figuur 1B, werden OLFM4 mRNA significant verlaagd SGC-7901-siOLFM4 en MKN45-siOLFM4 cellen in vergelijking met hun HK control of oudercellen (P < 0,01). Deze resultaten werden verder bevestigd door western blot analyse (figuur 1C). Geen significant verschil in OLFM4 expressie werd waargenomen tussen de ouders en HK controle cellen. De niveaus van mRNA en eiwit voor het β-actine waren vergelijkbaar voor de verschillende groepen. Deze resultaten suggereren dat een plasmide-gemedieerde OLFM4-siRNA gericht en efficiënt kan neerslaan OLFM4 niveau maagkanker cellen. Gezien de bovengenoemde analyse derhalve OLFM4 knock down cellen en HK controlecellen werden gekozen voor verder onderzoek.
OLFM4 knockdown maag remt proliferatie van kankercellen en verankering-onafhankelijke groei in vitro Belgique Om de rol van OLFM4 gastrische bepalen kanker celgroei, onderzochten we het effect van OLFM4-siRNA op de celgroei op 1-5 dag tijdstip door WST-1 test. Zoals getoond in Figuur 2A, in totaal twee maagkanker cellijnen, de groei van OLFM4 neerslaan cellen was significant verminderd in vergelijking met controlecellen HK vanaf dag 3 (P < 0,01). Om verder te onderzoeken van het belang van OLFM4 in het ontstaan ​​van tumoren van maagkanker cellen in vitro, voerden we verankering-onafhankelijke groei assays en vond SGC-7901 en MKN45 cellen die HK controles groeide goed in zachte agar, de vorming van verschillende kolonies. Daarentegen OLFM4 knockdown SGC-7901 en MKN45 cellen vertoonden een drastische vermindering van het aantal zachte agar kolonies (P < 0,01) (figuur 2B), resultaat transformerende vermogen dan die van de controlecellen. Deze gegevens gaven aan dat omverwerpen van OLFM4 kon maag proliferatie van kankercellen en verankering-onafhankelijke groei in vitro te remmen. Figuur 2 knockdown van OLFM4 remt de groei van SGC-7901 en MKN45 cellen in vitro en in vivo. A. Celgroei curve. Cel proliferatie in vitro werd bepaald door celgroei kromme, zoals bepaald door het tellen van het aantal cellen (WST-1 test) in het SGC-7901-cellen (linker paneel) en MKN45 cellen (rechter paneel). De OD-waarde (450 nm) werd geteld op de aangegeven dagen en weergegeven als het gemiddelde aantal cellen (n = 3). B. Anchorage-onafhankelijke groei in zachte agar. Representatieve beelden van drie experimenten werden getoond (bovenste paneel). Gegevens stellen het gemiddelde aantal kolonies geteld bij 200 x vergroting voor 5 willekeurige velden (onderste paneel). C. De gemiddelde tumorvolume na subcutane injectie van muizen met naakt HK control of OLFM4 knockdown cellen werd gemeten op de aangegeven tijdstippen. D. Representatieve beelden tumoren bij 35 dagen na subcutane injectie van cellen aangegeven. E. Mean tumorgewicht (linker paneel) en remmende rate (rechter paneel) in tumor xenotransplantaten. Gegevens stellen het gemiddelde tumorgewicht van xenotransplantaten (gemiddelde ± SD, n = 10). ** P < 0,01 versus HK controlegroep.
Groei-remmende effect van verminderde OLFM4 in de maag tumor xenotransplantaten
Bovendien hebben we ook uitgevoerd onderhuidse tumor formatieve assay in naakt muizen om de groei onderdrukking effect van down-gereguleerd OLFM4 in vivo te evalueren. Naakt muizen werden subcutaan geïnjecteerd met OLFM4 knockdown of HK controlecellen. Tumor volumes per 4 dagen en tumor gewicht bij 5 weken werden respectievelijk gemeten na subcutane injectie. Zoals weergegeven in figuur 2C-D, hetzij tumorvolume of tumorgewicht door OLFM4 neerhalen SGC-7901 en MKN45 cellen was significant verminderde groei in vergelijking met tumoren die in muizen geïnjecteerd met HK-controle getransfecteerde cellen (P < 0,01). De remmende tarief van SGC-7901 en MKN45 knock down cellen-geïnjecteerde groep op tumorgroei was 40,29% en 37,48% respectievelijk (figuur 2E).
Om verder te verzekeren OLFM4 expressie indeedly zwijgen opgelegd na subcutane injectie van naakt muizen, hebben we ook geëvalueerd OLFM4 expressie in tumor xenotransplantaten gebruik qRT-PCR en IHC. Evenzo in vitro OLFM4 mRNA niveau tumorxenotransplantaten door OLFM4 knockdown cellen vertoonden ook een significante daling ten opzichte van HK controle tumoren xenotransplantaten (P < 0,01) (Figuur 3A). Consistent met de resultaten van qRT-PCR, werd significante vermindering van OLFM4 eiwitten ook waargenomen in tumor xenotransplantaten IHC (P < 0,01) (Figuur 3B en 3C). Hogere grijstinten en sterker positief signaal van DAB-visualisatie werden gevonden in de tumor xenotransplantaten van HK controle cellen-geïnjecteerde groep. Integendeel, werd zwakke bruine kleuring waargenomen in tumor xenotransplantaten van OLFM4 knockdown cellen-geïnjecteerde groep. Daarnaast werd meer grote regio necrose waargenomen in tumor xenotransplantaten door HK controlecellen door een snelle groei van HK controlecellen (figuur 3B bovenste paneel). Deze gegevens een sterke aanwijzing dat expressie OLFM4 in mRNA en eiwitniveaus zijn stabiel inderdaad geremd in vivo. Tezamen worden zowel in vitro en in vivo experimenten suggereren dat OLFM4 knockdown de groei van maagkanker cellen remt. Figuur 3 qRT-PCR en detectie van IHC OLFM4 tumor xenotransplantaten. A. qRT-PCR voor mRNA in OLFM4 tumor xenotransplantaten. Veelvoudveranderingen in OLFM4 mRNA werden bepaald met de 2-ΔΔCt methode. P-actine-gen werd gebruikt als een interne controle. B. H &E kleuring (bovenste paneel) en IHC voor OLFM4 eiwit (onderste paneel) in tumor xenotransplantaten. Representatieve beelden (200 x) getoond. N, Necrosis. C. Kwantificering analyse van OLFM4 expressie. De gemiddelde waarde werd gemeten van vijf willekeurig verschillende velden onder de microscoop (400 ×) met behulp van de Image-Pro PLUS V6.0. De gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. ** P < 0,01 vs. HK controlegroep.
OLFM4 knock-down vertragingen G1 S overgang, maar leidt niet tot duidelijk apoptose bij maagkanker cellen
Gezien ons waargenomen remmende effecten op de celgroei in vitro en in vivo, we wilden bepalen of verhoogde apoptose of vertraagde progressie van de celcyclus werd geassocieerd met groeiremming. We hebben eerst onderzocht het effect van de verminderde OLFM4 op de voortgang van de celcyclus. Zoals getoond in figuur 4A, zowel OLFM4 knockdown SGC-7901 en MKN45 cellen vertoonden significant toegenomen aantallen in G1 fase en verminderde aantallen in S-fase, in tegenstelling tot hun HK controlecellen (P < 0,01). Geen significante verschillen waargenomen in de G2 /M-fase, hetgeen een typische vertraging G1 celcyclus. Figuur 4 Beoordeling van de celcyclus distributie, apoptotische cellen en caspase-3/9 activatie in OLFM4 knock down maagkanker cellen. A. Cell cycle analysis. Veranderingen in de celcyclus verdeling van de SGC-7901-HK, SGC-7901-siOLFM4 en MKN45-HK, werden MKN45-siOLFM4 cellen geanalyseerd door FCM. Gegevens stellen het gemiddelde percentage celcyclus faseverdeling (n = 3). B. Cel apoptose analyse. Apoptose werd geschat met AnnexinV-PE /7-AAD kleuring door FCM. Gegevens stellen het gemiddelde percentage apoptotische cellen (n = 3). C. caspase-3 en -9 activeringen. Caspase-3, 9 activeringen tussen aangegeven cellen worden getoond. ** P < 0,01 versus HK controlegroep.
Om te bepalen of apoptose betrokken is bij deze groeiremming, we volgend uitgevoerd cel apoptose analyse. Interessant kan verminderd OLFM4 expressie niet tot significante veranderingen van apoptose (Figuur 4B), hetgeen consistent is met de celcyclus analyse toont geen duidelijke sub-G1 fase van de onderzochte cellen. Om verder te onderzoeken veranderingen van apoptotische signalen, werd caspase-3 /-9 activiteit ook geïdentificeerd door colorimetrische activering assays. Beide caspase-3 en -9 activaties toonde geen significante veranderingen na knock-down van OLFM4 in SGC-7901 en MKN45 cellen (Figuur 4C). Deze resultaten suggereren dat neerwaartse regulatie van OLFM4 een remmend effect op de celgroei kunnen uitoefenen door het reguleren van de celcyclus waarbij geen apoptose bij maagkanker cellen.
Verwijderen van OLFM4 sensibiliseert maagkanker cellen H2O2 of TNF-α geïnduceerde apoptose
de verschillende effect van H 2O 2 of TNF α op de apoptose tussen OLFM4 knock down en HK controle cellen werd ook onderzocht. OLFM4 neerslaan of HK controle cellen werden behandeld met 10, 100 en 1000 uM H 2O 2 of 5, 10 en 50 ng /ml TNF α resp. Cellevensvatbaarheid en apoptose werden beoordeeld. Zoals getoond in figuur 5A-D, werd een dosisafhankelijke afname in cellevensvatbaarheid waargenomen in H 2O 2 of TNF α-behandelde OLFM4 neerslaan cellen. Voorts behandeling van 10 uM H 2O 2 (figuur 5A-B) of 10 ng /ml TNF α (Figuur 5C-D) leidde tot een significante vermindering van cellevensvatbaarheid in OLFM4 neerslaan cellen vergeleken met HK controlecellen (P < 0,01). Van bijzonder belang is de bevinding dat knockdown cellen plaats HK controlecellen behandeld met OLFM4 10 ~ 1000 pM H 2O 2 vertoonde prominenter apoptotische percentages in vergelijking met patiënten behandeld met PBS mock (P < 0,01) ( figuur 5A-B). Soortgelijke resultaten werden ook waargenomen in TNF-α behandelde OLFM4 knockdown cellen (Figuur 5C-D). Met andere woorden, OLFM4 neerhalen verbeterde H 2O 2 of TNF-α geïnduceerde apoptose bij maagkanker cellen, wat aangeeft deletie van OLFM4 gemaakt SGC-7901 en MKN45 cellen gevoeliger voor de behandeling van H 2O 2 of TNF α. Figuur 5 Reactie van OLFM4 knockdown SGC-7901 en MKN45 cellen om apoptose-inducerende middelen H 2 O 2 of TNF α. OLFM4 knockdown en HK controlecellen werden behandeld met H2O2 (A en B) of TNF α (C en D) zoals aangegeven doses voor 12 uur. Levensvatbaarheid van de cellen werd gemeten door WST-1 test (A-D linker panelen) en uitgedrukt in de gemiddelde OD-waarde (450 nm) (n = 3). Het percentage van de apoptotische cellen werd bepaald door FCM (A-D rechterpanelen) en uitgedrukt in het gemiddelde percentage apoptotische (n = 3). * P < 0,05, ** P < 0,01 versus HK controlegroep.
Caspase-3-activiteit is betrokken bij H2O2 of TNF α-geïnduceerde apoptose in OLFM4 knock-down cellen Ondernemingen De bovenstaande resultaten gaven aan dat neerhalen van OLFM4 zou kunnen verhogen H 2O 2 of TNF-α gestimuleerde apoptose. Om verder te gaan of caspase-3 wordt geactiveerd in de H 2O 2 of TNF-α geïnduceerde apoptose in OLFM4 knockdown cellen, we vervolgens gedetecteerd caspase-3 activatie in H 2O 2 of TNF a-behandelde cellen via colorimetrische bepaling. Zoals getoond in figuur 6A, behandeling van H 2O 2 of TNF α resulteerde in veel verbetering van caspase-3-activiteit in OLFM4 knockdown cellen dan HK controlecellen (P < 0,01), wat suggereert caspase-3 activiteit is betrokken bij de H 2O 2 of TNF α-geïnduceerde apoptose in cellen OLFM4 knockdown. Om verder te gaan of H 2O 2 of TNF-α geïnduceerde apoptose afhankelijk is van caspase-3-activiteit, Z-VAD-fmk, een caspase inhibitor werd gebruikt voor de behandeling van H 2O 2 of TNF α. Voorbehandeling van Z-VAD-fmk aanzienlijk verzwakt H 2O 2 of TNF-α geïnduceerde apoptose alsook caspase-3-activiteit in zowel OLFM4 knockdown cellen (P < 0,01) (Figuur 6C-D ) dat aangeeft dat H 2O 2 of TNF-α geïnduceerde apoptose caspase-3 afhankelijke cellen in OLFM4 knockdown. Figuur 6 Betrokkenheid van caspase-3-activiteit in H 2 O 2 of TNF-α geïnduceerde apoptose in OLFM4 knockdown SGC-7901 en MKN45 cellen. (A-B) verhoogde caspase-3-activiteit in H2O2 of TNF-α behandelde OLFM4 knockdown cellen. OLFM4 knockdown en HK-controle cellen werden behandeld met 10 uM H2O2 (A) of 10 ng /ml TNF α (B) gedurende 12 h. Caspase-3 activiteit werd gemeten onder toepassing van colorimetrische bepaling, uitgedrukt in vouwveranderingen. ** P < 0,01 versus PBS mock-groep (n = 3). (C-D) Reversed cel apoptose door caspase-remmer in OLFM4 knockdown cellen. Cellen werden behandeld met H2O2 of TNF α alleen voor aangegeven doseringen zoals hierboven vermeld of voorbehandeld met 20 pM Z-VAD-fmk 2 uur vóór H2O2 of TNF α behandeling. Het percentage apoptotische cellen werd bepaald door FCM. Gegevens stellen het gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke experimenten. ** P < 0,01 vs. H2O2 (C) of TNF α (D) behandeld OLFM4 knockdown cellen aan.
Discussie
Recently accumuleren gegevens tonen OLFM4 vaak tot overexpressie gebracht in veel soorten van humane tumoren waaronder maagkanker en werd verondersteld spelen een cruciale rol in de ontwikkeling en progressie van maagkanker [19, 20]. Hoewel eerdere studies hebben aangetoond dat OLFM4 is betrokken bij apoptose en tumorgroei, recente waarnemingen suggereren ook dat cel- of weefselspecifieke effecten kunnen bestaan ​​voor de OLFM4 gen. Er is relatief weinig bekend over de tumorgroei en apoptose onderliggende maagkanker specifieke OLFM4 expressie. Om een ​​beter begrip van de rol van de veranderde OLFM4 in menselijke maagkanker krijgen, is experimentele ondersteuning nodig om de rol van de OLFM4 gen bij maagkanker valideren.
Aangetoond is dat abnormale expressie van HGC-1 kan worden geregeld op het transcriptionele of post-transcriptionele niveau [13]. In onze huidige werken we direct onderzocht OLFM4 eiwit expressie patroon in maagkanker cellen en normale GES-1-cellen. SGC-7901 en MKN45 cellen die relatief hoge OLFM4 niveaus werden gekozen voor deze studie. Aangezien het reduceren van de expressie van het doelwitgen door genetische middelen gevestigde cellijnen nuttig voor een beter begrip van de rol bij het handhaven van het maligne fenotype name bij de analyse van genen die essentieel zijn voor cellulaire overleving [21] zijn genereerden wij stabiele kloon pools van SGC-7901 en MKN45 uitdrukken OLFM4-siRNA of roerei HK controle door de plasmide gebaseerde siRNA benadering en bevestigde knock-down efficiëntie van OLFM4 gen in mRNA en eiwit niveaus door qRT-PCR en western blotting.
Onze werkzaamheden die aantonen dat OLFM4 speelt een essentiële rol bij maagkanker ontstaan ​​van tumoren. Knockdown van OLFM4 remt celproliferatie en verankering-onafhankelijke groei van het vermogen in vitro. Xenograft tumormodel in vivo impliceert dat verminderde OLFM4 kan de tumorgroei van menselijke maagkanker cellen remmen. Deze resultaten geven aan dat OLFM4 speelt een cruciale rol bij celproliferatie maagkanker cellen. Onze resultaten waargenomen dat knock-down van OLFM4 had geen invloed op de mate van apoptose en caspase-3 en 9 activaties in OLFM4 knockdown cellen, wat suggereert dat apoptose niet het mechanisme achter de remming van tumorgroei. Zo postuleren we dat OLFM4 expressie niet essentieel voor kanker celoverleving, die volgens een recente waarneming dat genetische knock-out muizen vertonen OLFM4 normale ontwikkeling en hematopoietische fenotypen [17]. Om verder te karakteriseren het onderliggende mechanisme groeiremming, voerden we celcyclusanalyse en liet zien dat remming van OLFM4 expressie geïnduceerde maagkanker cellen te accumuleren in G1 fase van de celcyclus, wat suggereert dat-downgereguleerde OLFM4 kan een remmend effect op celgroei uitoefent door een mechanisme regulerende celcyclus waarbij geen apoptose bij maagkanker cellen.
Resistentie van tumorcellen op de inductie van apoptose is een van de belangrijkste factoren die verantwoordelijk zijn voor het falen van veel conventionele kankerbehandelingen die antikankermiddelen en straling gebruiken. Daarom apoptose in kankercellen controle is van essentieel biologische en klinische belang [22, 23]. Anti-apoptotische activiteit is een belangrijke functie van OLFM4 gen [2]. In het bijzonder werd H 2O 2-geïnduceerde cellulaire apoptose verzwakt door overexpressie OLFM4 in een prostaatkanker cellijn [2]. Bovendien zijn MKN45 cellen getoond een vermogen van resistentie tegen TNF α-geïnduceerde apoptose [24]. Gezien deze bevindingen, veronderstellen we dat knock-down van OLFM4 meningsuiting H 2O 2 of TNF α-geïnduceerde apoptose bij maagkanker cellen zou kunnen verbeteren. Hier toonden we aan dat de down-regulatie van OLFM4 effectief verhoogde apoptose in respons op H 2O 2 of TNF α stimulatie in MKN45 en SGC-7901 cellen, wat suggereert blokkeren OLFM4 kan de gevoeligheid van maagkanker verhogen cellen om de aanwezigheid van H 2O 2 of TNF-α.
Zoals algemeen bekend is dat caspase-3, een belangrijke uitvoerende molecuul van de apoptotische route, speelt een cruciale rol bij apoptotische processen in verschillende cellen. Verder hebben we onderzocht caspase-3 activatie in OLFM4 knockdown en HK controlecellen in de aanwezigheid of afwezigheid van caspaseremmer Z-VAD-fmk. We vonden dat behandeling van H 2O 2 of TNF-a significant opgereguleerd caspase-3-activiteit in OLFM4 knockdown cellen dan HK controlecellen terwijl voorbehandeling met Z-VAD-fmk omgekeerde caspase-3-activiteit en zo H 2O 2 of TNF-α geïnduceerde apoptose. De resultaten geven aan dat H 2O 2 of TNF α-geïnduceerde apoptose in OLFM4 knockdown cellen caspase-3 afhankelijke. Op basis van de huidige gegevens, is het denkbaar dat opwaarts gereguleerd OLFM4 maakt maagkanker cellen om apoptose inductie weerstaan ​​door de geringere gevoeligheid voor geneesmiddelen tegen kanker.
In feite zijn antagonisten van OLFM4 is dat het de proliferatie in andere soorten remmen kanker cellen zoals menselijke pancreaskanker PANC-1-cellen [8] en menselijke long caner SBC-1-cellen [9]. Echter controversieel resultaten waargenomen. Verminderde OLFM4 mRNA remmen PANC-1 celproliferatie door S G2 /M fase-arrest [8], die verschilt van onze resultaten blijkt vertraagde G1 fase vooruitgang bij maagkanker. Bepaalde belangrijke gegevens (of redenen) kan dit verschil verklaren. Ten eerste, zoals recente studies gesuggereerd, een cel of weefsel specifieke rol van OLFM4 (maagkanker cellen en pancreaskanker cellen) kan een overtuigende verklaring voor deze discrepantie te zijn. Het meest opmerkelijk is, OLFM4 expressie op mRNA-niveau, maar niet eiwitgehalte in PANC-1 cellen werd met succes gemeten met behulp van RT-PCR [8], terwijl de meest recente rapport van Kim et al. bleek dat PANC-1-cellen geen OLFM4 mRNA [25], waarin de expressie patroon en de rol van OLFM4 gen in PANC-1-cellen moet nog bevestigd.
Ondanks OLFM4 silencing bleek een remmend effect op celgroei en verminderde weerstand tegen H 2O 2 of TNF-α behandeling bij maagkanker cellen wordt niet opgeheven dat andere mechanismen kunnen ook worden geregeld door OLFM4 en draagt ​​bij aan groeiremming en apoptose besturingssignalering, gezien de overspraak van het netwerk .

• Epidermale groeifactorreceptor structurele veranderingen in maagkanker
• Uitingen van COX-2 en VEGF-C bij maagkanker: correlatie met lymfangiogenese en prognostische implicaties