Ausschöpfung vun OLFM4 Gentherapie bremst Wuesstem Zell an erhéigt drëm ze Waasserstoff Hem an entholl necrosis Faktor-alpha entschlof-apoptosis zu gastric Kriibs Zellen

Ausschöpfung vun OLFM4 Gentherapie bremst Wuesstem Zell an erhéigt drëm ze Waasserstoff Hem an entholl necrosis Faktor-alpha entschlof-apoptosis zu gastric Kriibs Zellen VerfÜgung méiglech VerfÜgung Background VerfÜgung Mënscherechter olfactomedin 4 (OLFM4) Gentherapie ass eng secreted glycoprotein méi allgemeng wéi d'Anti-apoptotic Protein GW112 bekannt. OLFM4 ass fonnt ginn an vill Zorte vu mënschlechen erhéijen up-reegelen dacks ginn gastric Kriibs dorënner an et gouf gegleeft bedeitend Roll an de Werdegang vun gastric Kriibs ze spillen. Obwuel d'Funktioun vun OLFM4 huet an ville Studien agestallt ginn, seet de leschte Beweiser betraff eng Zell oder Otemschwieregkeeten Typ-ofhängeg Roll vun OLFM4 zu Zell Wuesstem an apoptosis. D'Zil vun dëser Etude ass d'Roll vun gastric Kriibs-spezifesch Ausdrock vun OLFM4 zu Zell Wuesstem an apoptosis Resistenz ze iwwerpréifen. VerfÜgung Method VerfÜgung OLFM4 Ausdrock vun RNS Amëschen an SGC-7901 an MKN45 Zellen éliminéiert war. Zell Prolifératioun, Hafen-onofhängeg Wuesstem, Zell Zyklus a apoptosis sech kënschtlech charakteriséiert. Tumorigenicity war zu VIVO analyséiert. D'apoptosis an caspase-3 Aktivéierung an Äntwert zu Waasserstoff Hem (H 2O 2) oder entholl necrosis Faktor-alpha (TNF α) waren an der Presenz oder Feele vun caspase inhibitor Z-VAD-fmk évaluéieren.
Resultater VerfÜgung D'Eliminatioun vun OLFM4 FAQ vun RNS Amëschen an SGC-7901 an MKN45 Zellen bremst vill tumorigenicity souwuel eng kënschtlech an VIVO vun Aféierungs- vun Zell G1 verhaft (all P &Si besteet; 0.01). OLFM4 knockdown net ze iwwersinn Zell apoptosis Iwwerleeung mä fräi H 2O 2 oder TNF α-entschlof apoptosis an caspase-3 Aktivitéit (all P &Si besteet; 0.01). Traitement vun Z-VAD-fmk caspase-3 Aktivitéit attenuated an réckgängeg bedeitend d'H 2O 2 oder TNF α-entschlof apoptosis zu OLFM4 knockdown Zellen (all P &Si besteet; 0.01). VerfÜgung Conclusioun VerfÜgung eis Etude seet, datt Ausschöpfung vun OLFM4 bremst vill tumorigenicity vun der gastric Kriibs SGC-7901 an MKN45 Zellen. OLFM4 Ausdrock Outil kënnt vun waarden caspase-3 ofhängeg apoptosis gastric Kriibs Zellen ze H 2O 2 oder TNF α Behandlung sensitize. Eng Strategie geschéckt baséiert op OLFM4 inhibition an anticancer Drogen Behandlung therapeutesch Potential am Interventioun gastric Kriibs kënne bidden. VerfÜgung Schlësselwieder VerfÜgung Gastric Kriibs Olfactomedin 4 RNS Wuesstem Amëschen Zell Apoptosis Resistenz Background VerfÜgung Mënscherechter OLFM4 (olfactomedin 4, och bekannt als hGC-1, GW112), stamen Mënsch Limburg nom granulocyte Kolonie-Spannend Faktor Stimulatioun aus Servicer sinn Virleefer Zellen gekloonten [1], ass e secreted glycoprotein méi allgemeng als anti-apoptotic Protein GW112 bekannt [2, 3]. OLFM4 ass normalerweis am Réckemuerch hiirgestallt, Aarbecht, kleng Daarm, am Mo, Colon an Bauchspaicheldrüs ausgedréckt [1, 4]. Duerno, fräi OLFM4 Niveauen sech och an der Krypta epithelium vun gestuerwe colonic mucosa vun demagogesch bowel Krankheeten [5] an am gastric biopsies Krankheet mat Helicobacter pylori fonnt [6, 7]. Méi kuerzem, huet weider-reegelen OLFM4 Ausdrock an haett an Broscht [8] beschriwwe ginn, prostatic [3], gastric [3, 9] an pancreatic Cancers [8, 9] wéi och zu colorectal adenomas [10-14]. VerfÜgung Et gëtt ugeholl, datt OLFM4 zu bewosst Prozess wéi apoptosis an entholl Wuesstem Équipe ass [2]. Obwuel de bewosst Funktioun vun OLFM4 huet propagéieren ginn, maachen dës Resultater net ëmmer Hoplit. Overexpression vun OLFM4 gouf Prolifératioun Mënsch PC-3 Zell Aarbecht Kriibs dës Distanz zu Maus Aarbecht entholl TRAMP-C1 Zellen Wuesstem zu syngeneic C57 /BL6 Mais [2] vereinfacht mä inhibit [15]. Desweideren, an-reegelen OLFM4 weisen eng staark anti-apoptotic Aktivitéit an Maus lymphoid verfeelt endothelial SVEC Zellen a mënschlech adenocarcinoma Hela Zellen [1, 2] hierkommen rezent Conclusiounen Divergenzen proapoptotic Effet vun OLFM4 zu Mënsch Servicer sinn Leukämie HL-60 Zellen [16 ]. Beweiser aus dës Studie seet staark dass Rollen vun OLFM4 zu Zell Wuesstem Kontroll an apoptosis op der Zell oder Otemschwieregkeeten Typ hänken kënnen [10, 13-15]. Fir Datum, gouf awer ganz limitéiert Daten d'Roll vun OLFM4 an der Zell Wuesstem betreffend an apoptosis Profiler vun gastric Kriibs Zellen publizéiert. VerfÜgung Am Moment studéieren, analyséiert mir OLFM4 FAQ Ausdrock vun gastric Kriibs Zellen an normale Mënsch gastric epithelial GES-1 Zellen duerch westlech blotting. Benotzt plasmid-mediated kuerz hairpin RNS (shRNA), inhibited mir OLFM4 Ausdrock vun der gastric Kriibs SGC-7901 an MKN45 Zellen Zell Prolifératioun, Zell Zyklus Phas ze observéieren, apoptosis kënschtlech an hir tumorigenic Muecht an VIVO ze bewäerten. Mir lant och de apoptosis an caspase-3 Aktivéierung an Äntwert ze cytotoxic Agenten wéi H 2O 2 oder TNF α an der Presenz oder Feele vun caspase inhibitor Z-VAD-fmk tëscht OLFM4 knockdown Zellen an HK Kontroll Zellen Method.
Zell Kultur, reagents an Mais VerfÜgung De Mënsch gastric Kriibs Zellen BGC-823, HGC-27, SGC-7901, MKN28, MKN45 a mënschlech normal gastric epithelial GES-1 Zellen DMEM mëttelfristeg haten sech (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) mat 10% an et Bovine serum (FBS, GibcoBRL, USA), 100 u /ml vun penicillin an 100 μg /ml vun streptomycin. H 2O 2 an TNF-α sech aus Fläch (St. Louis, MO) an Z-VAD-fmk war vun Calbiochem (San Diego, CA) kaaft kritt. BALB /C Sauna (Nu /Nu) Mais (4-6 Wochen al, SPF Supérieur, 20 ± 3 g) sech vum schafft Déieren Center vun Chongqing medezinesch Uni (Chongqing, China) kaaft. All Prozedure goufen no der international akzeptéiert ethesch Normen gehaal (NIH Publikatioun keen. 85-23, iwwerschafft 1985). VerfÜgung Plasmid gesond a stabil transfection VerfÜgung shRNA-mediated RNAi plasmid (pGenesil 1,1-siOLFM4) an eng Jacquerie Kontroll plasmid (pGenesil 1,1-HK) gebaut goufen d'endogenous OLFM4 zu SGC-7901 an MKN45 Zellen ze hummeren verwandelt. No transfection an neomycin (G418) Auswiel, OLFM4 hummeren-verwandelt SGC-7901-siOLFM4, MKN45-siOLFM4 Zellen an Jacquerie SGC-7901-HK, MKN45-HK Zellen Kontroll stably kritt huet, respektiv (Detailer zu Weider Fichier 1 gewisen: Zousätzlecht Daten). VerfÜgung RNS erauszéien a grouss RT-Hinnen alleguer (qRT-Hinnen alleguer) VerfÜgung Total RNS zu verschiddenen Zellen oder entholl xenografts war mat de Kit RNeasy Mini Quecksëlwer (QIAGEN, CA, USA), a gouf duerch cDNA Synthes duerno mat der ReverTra Ace-α-éischt staarkt cDNA Synthes System (Toyobo, Rekorder, Japan) wéi virdrun beschriwwen [17]. (: Zousätzlecht Donnéeën Detailer zu Weider Fichier 1 gewisen) Chemeschen real-Zäit Hinnen alleguer war als unisse Hoerfaarw (Toyobo, Rekorder, Japan) mat 7500 real-Zäit Hinnen alleguer System (Obwuel Biosystems) mat SYBR-Green gesuergt. Fantastesch Ännerungen am Gentherapie Ausdrock sech mat der "2 - ddCT" alles. Method [18] zu Zell Prolifératioun assay kënschtlech an Zell Nuetsvolen Miessung VerfÜgung Zell Prolifératioun an Zell Nuetsvolen benotzt Zell Prolifératioun WST-1 Kit gemooss (Roche laut) un d'Instruktioune vum Produzent. Fir Zell Prolifératioun, goufen Zellen op enger Dicht vun 1 × 10 3 Zellen pro och vun enger 96-gutt Placke rakommen an fir 5 Deeg ugebaut. D'optesch Dicht (450 nm) Wäert war mat der Microplate Reader (Tacan, Swasiland) pro Dag erwëscht. All assay war zu triplicate gesuergt. Als Moosse vun Zell Nuetsvolen, Zellen (1 × 10 4 /gutt) um 200 μl vu Medien a 96-gutt Placke rakommen goufen. No 12 h incubation, H 2O 2 oder TNF α war zu uginn Konzentratioune behandelt. Relativer absorbance gemooss gouf als zu Zell Prolifératioun beschriwwen. VerfÜgung Anchorage-onofhängeg Wuesstem assay VerfÜgung Anchorage-onofhängeg Wuesstem op mëll Agar Leeschtung war fir eng kënschtlech clonogenicity spigelen. Kuerz, sech an 0.3% Agar zu DMEM Zellen (5 × 10 2) vun all Kolonie Sursis an dann zu 6-gutt Platen op einfach Agar (0,5%) plated. Zellen sech op 37 ° C an 5% CO fir 2 Wochen incubated 2 virun der Kolonie gemooss gouf. Zuel vun de Kolonien huet fir fënnef ënnerschiddleche Beräicher bei 200 × Vergréisserung gezielt. All assay zu triplicate gesuergt huet. VerfÜgung cytometry Analyse Flow VerfÜgung Flow cytometry (FCM) Analyse war standing Zell Zyklus Werdegang oder apoptosis ze bewäerten. VerfÜgung Caspase assay VerfÜgung Enzymatic Aktivitéit vun caspase-3 an -9 gemooss gouf e fluorometric assay Hëllef no enger Method virdru beschriwwen [8] VerfÜgung Western blot Analyse: (Zousätzlecht Donnéeën Detailer zu Weider Fichier 1 gewisen). VerfÜgung Western blotting war virdrun ëmschriwwen standing [17]. Déi folgend antibodies sech fir westlech blotting benotzt: Anti-OLFM4 (Abcam, Cambridge, UK) an Anti-β-actin (Santa Cruz, CA, USA) d'famill Quantitéit vu Proteinen war benotzen ech sinn analyséiert One Software (Bio-Rad, Hercules , CA, USA) an normalized fir datt vun β-actin (Detailer zu Weider Fichier dës 1:. Zousätzlecht Daten) VerfÜgung Xenograft entholl Modell VerfÜgung véierzeg Sauna Mais sech an véier Gruppen zoufälleg ënnerdeelt. All Grupp huet subcutaneously vun der Positioun mat der Dispens vun 200 μl mat 2 × 10 heijen 6 Zellen verwisen, bzw.. De Volume vun xenografts war serially gemooss. De Mais sech no 35 Deeg geaffert. D'xenografts sech excised a gewien. inhibition Tarif (%) = 1-mengen Gewiicht (OLFM4 hummeren verwandelt-Zellen heijen Grupp oder HK Kontroll Zellen-heijen Grupp) /mengen Gewiicht (HK Kontroll Zellen-heijen Grupp) ×: d'inhibition Tariffer vun xenografts sech no der Formel berechent 100%. Dunn, no der entholl Otemschwieregkeeten Thema ze total RNS Isolatioun oder immunohistochemistry erkennen. VerfÜgung Immunohistochemistry (IHC) VerfÜgung OLFM4 Proteinen am entholl xenografts vun IHC analyséiert goufen benotzt Kanéngchen-Anti OLFM4 (Abcam, Cambridge, UK) (Detailer dës Distanz an Weider Fichier 1:. zousätzlecht Daten) VerfÜgung Statistics VerfÜgung Data aus onofhängeg Experiment wéi d'mengen ± Fils ausgedréckt vun op d'mannst dräi Experimenter. Vergläicher tëschent Gruppe waren déi zwee-tailed Student d't VerfÜgung Azeton oder ANOVA, wéi ubruecht ze analyséieren, an p Wäerter &Si besteet; 0,05 sech als statistesch relevant ze ginn. VerfÜgung Resultater Effikass hummeren Ugrëff vun OLFM4 Gentherapie vun plasmid-mediated siRNA zu gastric Kriibs Zellen VerfÜgung OLFM4 FAQ Ausdrock Muster an gastric Kriibs BGC-823, HGC-27, ze propagéieren war VerfÜgung SGC-7901, MKN28, MKN45 Zellen an normal GES-1 Kontroll Zellen (Dorënner 1A). OLFM4 FAQ äussert definitiv zu all dës gastric Kriibs Zellen an GES-1 Zellen. gastric Kriibs Zellen an GES-1 Zellen an allem, SGC-7901 an MKN45 Zellen wéi aner relativ héijen Niveau OLFM4 FAQ ausgedréckt. Dofir, SGC-7901 an MKN45 Zellen sech fir weider Studien an dëse Match gaangen. Figur 1 Effikass knockdown vun OLFM4 vun RNS Amëschen an gastric Kriibs SGC-7901 an MKN45 Zellen. A. Expression vun OLFM4 FAQ zu verschiddenen gastric Kriibs Zell Linnen. Ausdrock Profil vun OLFM4 FAQ war mat westlecher blotting mat β-actin wéi eng intern Kontroll analyséiert. GES-1 Zellen sech als normal Kontroll Zellen zerwéiert. B. OLFM4 mRNA Ausdrock vun OLFM4 knockdown Zellen. Relativer Ausdrock vun OLFM4 war vun qRT-Hinnen alleguer festgestallt. β-actin war wéi eng intern Kontroll benotzt. Fantastesch Ännerungen am OLFM4 mRNA Ausdrock sech mat der Method 2-ΔΔCt alles. C. OLFM4 FAQ Ausdrock vun OLFM4 knockdown Zellen. OLFM4 FAQ Ausdrock war déi westlech blotting fonnt. β-actin FAQ war wéi eng intern Kontroll benotzt. Vertrieder vun dräi Experimenter si gewisen. ** P &Si besteet; 0,01 vs. HK Kontroll Zellen Grupp (n = 3). VerfÜgung Fir OLFM4 Ausdrock, e plasmid-mediated shRNA gezielt OLFM4 Gentherapie gebaut gouf verwandelt-regléieren stably OLFM4 Ausdrock vun SGC-7901 an MKN45 Zellen ze hummeren verwandelt. Als zu Dorënner 1B gewisen, sech OLFM4 mRNA Niveauen am SGC-7901-siOLFM4 an MKN45-siOLFM4 Zellen am Verglach zu hire HK Kontroll oder Elteren Zellen (; 0,01 P &Si besteet) bedeitend reduzéiert. Dës Resultater goufen weider duerch westlech blotting Analyse (Dorënner 1c) confirméiert. Nee groussen Ënnerscheed zu OLFM4 Ausdrock war tëscht Elteren a HK Kontroll Zellen observéiert. Den Niveau vun mRNA an FAQ fir d'β-actin waren ënnert de verschiddene Gruppen ähnlech. Dës Resultater hindeit, datt e plasmid-mediated OLFM4-siRNA speziell kann an effizient hummeren verwandelt OLFM4 Niveau vun gastric Kriibs Zellen. Tatsaach virun dohinnergestallt d'Analyse, also, OLFM4 Zellen an HK Kontroll Zellen hummeren verwandelt sech fir weider Ermëttlungen an dëse Match gaangen. VerfÜgung OLFM4 knockdown gastric Kriibs Zell Prolifératioun a Hafen-onofhängeg Wuesstem an eng kënschtlech VerfÜgung bremst d'Roll vun OLFM4 zu gastric ze bestëmmen Kriibs Zell Wuesstem, ze propagéieren mir den Effet vun OLFM4-siRNA op der Zell Wuesstem op 1-5 Dag Zäit Punkt vun WST-1 assay. Als zu Dorënner 2A, dës Zellen an all zwee gastric Kriibs Zell Linnen, de Wuesstem vun OLFM4 hummeren verwandelt huet bedeitend reduzéiert Verglach mat HK Kontroll Zellen vum Dag 3 (P &Si besteet; 0.01). Fir weider d'Wichtegkeet vun OLFM4 an der tumorigenesis vun gastric Kriibs Zellen kënschtlech iwwerpréifen, duerchgefouert mir Hafen-onofhängeg Wuesstem assays eraus an fonnt SGC-7901 an MKN45 Zellen ausdrécken HK Kontrollen gewuess gutt an mëll Agar, administrativ z'ënnerscheedde Kolonien. Am Géigesaz, OLFM4 knockdown SGC-7901 an Schatzkummer MKN45 Zellen engem dramateschen Reduktioun vun der Zuel vun mëll Agar Kolonien (P &Si besteet; 0.01) (Dorënner 2B), weist Fähegkeeten manner wéi déi vun der Kontroll Zellen transforméiert. Dës Donnéeë uginn, datt dru-Ugrëff vun OLFM4 konnt gastric Kriibs Zell Prolifératioun a Hafen-onofhängeg Wuesstem an eng kënschtlech inhibit. Figur 2 knockdown vun OLFM4 bremst den Wuesstem vun SGC-7901 an MKN45 Zellen kënschtlech an VIVO. A. Zell Wuesstem rop. Zell Prolifératioun kënschtlech war vun Zell Wuesstem rop évaluéieren, wéi vun Zielen der Zell Zuel (WST-1 assay) an der SGC-7901 Zellen (lénks Rot) an MKN45 Zellen (riets Rot) alles. D'sel Wäert (450 nm) war um uginn Deeg gezielt an als mengen Zell Zuelen presentéiert (n = 3). B. Anchorage-onofhängeg Wuesstem an mëll Agar. Vertrieder Biller vun dräi Experimenter waren dës (ieweschte Rot). Donnéeën vertrieden mengen Zuel vun Kolonien um 200 × Vergréisserung fir 5 ënnerschiddleche Beräicher (ënneschten Rot) gezielt. C. De mengen Volumen entholl der subcutaneous Sprëtz vun Sauna Mais mat HK Kontroll oder OLFM4 knockdown Zellen am uginn Zäit Punkten gemooss gouf. D. Vertriederin erhéijen Biller op 35 Deeg no subcutaneous Sprëtz vun uginn Zellen. E. Mëttler entholl Gewiicht (lénks Rot) an inhibitory Tarif (riets Rot) zu entholl xenografts. Donnéeën vertrieden mengen entholl Gewiicht vun xenografts (mengen ± Fils, n = 10). ** P &Si besteet; 0,01 vs. HK Kontroll Grupp. VerfÜgung Wuesstem-inhibitory Effet vun OLFM4 zu gastric entholl xenografts ofgeholl VerfÜgung Desweideren, mir standing och subcutaneous entholl ale assay an Sauna Mais de Wuesstem Ennerdréckung Effet vun verwandelt-reegelen OLFM4 zu VIVO ze diskutéieren. Sauna Mais sech subcutaneously mat OLFM4 knockdown oder HK Kontroll Zellen heijen. Entholl Bänn pro 4 Deeg an entholl Gewiicht bei 5 Wochen goufen gemooss respektiv no subcutaneous Sprëtz. Als zu Dorënner 2C-D gewisen, ob entholl Volumen oder entholl Gewiicht vun OLFM4 produzéiert hummeren verwandelt SGC-7901 an MKN45 Zellen Équipe an Mais mat HK Kontroll-transfected Zellen heijen produzéiert vill Wuesstem reduzéiert Verglach mat erhéijen (P &Si besteet; 0.01). D'inhibitory Taux vun SGC-7901 an MKN45 hummeren verwandelt Zellen-heijen Grupp op entholl Wuesstem war 40,29% an 37,48% respektiv (Dorënner 2E). VerfÜgung weider OLFM4 Ausdrock ze versécheren indeedly der subcutaneous Sprëtz vun Sauna Mais entsat ass, och mir évaluéiert OLFM4 Ausdrock vun entholl xenografts qRT-Hinnen alleguer an IHC benotzt. Den Zerfall an kënschtlech, OLFM4 mRNA Niveau vun entholl vun OLFM4 knockdown Zellen produzéiert xenografts zougedréckt och eng drastesch ofgeholl Verglach mat HK Kontroll erhéijen xenografts (P &Si besteet; 0.01) (Dorënner 3A). (Well 3B an 3C); konsequent mat de Resultater vun qRT-Hinnen alleguer, däitleche Minus vun OLFM4 FAQ war och zu entholl xenografts vun IHC (0.01 P &Si besteet) observéiert. Héich gro Skala a staark positivt Signal vun botzt visualization sech zu entholl xenografts vun HK Kontroll Zellen-heijen Grupp fonnt. Am Géigendeel, schwaach brong staining war zu entholl xenografts vun OLFM4 knockdown Zellen-heijen Grupp observéiert. Ausserdeem, méi grouss necrosis Regioun gouf zu entholl xenografts produzéiert vun HK Kontroll Zellen wéinst engem séiere Wuesstem vun HK Kontroll Zellen (Dorënner 3B ieweschte Rot) observéiert. Dës Donnéeë eng staark Indikatioun gëtt, datt Ausdrock OLFM4 um mRNA an FAQ Niveau sinn stably inhibited Exemplar vun VIVO. Geholl ginn, souwuel vun kënschtlech an VIVO Experimenter hindeit datt OLFM4 knockdown de Wuesstem vun gastric Kriibs Zellen bremst. Figur 3 qRT-Hinnen alleguer an IHC erkennen OLFM4 zu entholl xenografts. A. qRT-Hinnen alleguer fir OLFM4 mRNA zu entholl xenografts. Fantastesch Ännerungen am OLFM4 mRNA sech mat der Method 2-ΔΔCt alles. β-actin Gentherapie war wéi eng intern Kontroll benotzt. B. H & E staining (ieweschte Rot) an IHC fir OLFM4 FAQ (ënneschten Rot) zu entholl xenografts. Vertrieder Biller (200 ×) sinn gewisen. N, Necrosis. C. Quantification Analyse vun OLFM4 Ausdrock. D'Moyenne war aus fënnef zoufälleg verschidde Beräicher ënner microscope (400 ×) mat der Bild-Pro PLUS V6.0 gemooss. Date goufen als mengen ± Fils ausgedréckt. ** P &Si besteet; 0,01 vs. HK Kontroll Grupp. VerfÜgung OLFM4 ze S Transitioun Verspéidungen G1 hummeren-verwandelt awer net ze iwwersinn, apoptosis zu gastric Kriibs Zellen Iwwerleeung VerfÜgung eis observéiert inhibitory Auswierkungen op Zell Wuesstem an eng kënschtlech Bezug an VIVO, géng mir ze bestëmmen ob verstäerkte apoptosis oder verspéiten Zell Zyklus Werdegang war mat Wuesstem inhibition assoziéiert. Mir bewäert éischt den Effet vun ofgeholl OLFM4 op Zell Zyklus Werdegang. Als zu Dorënner 4A gewisen, zougedréckt souwuel OLFM4 knockdown SGC-7901 an MKN45 Zellen bedeitendst fräi Zuelen an G1 Phase an erofgaangen Zuelen an Phas S, am Géigesaz zu hire HK Kontroll Zellen (P &Si besteet; 0.01). Keng Differenze waren an der G2 /M-Phase observéiert, eng typesch G1 Retard vun Zell Zyklus ugëtt. Figur 4 Assessment vun Zell Zyklus Distributioun, apoptotic Zellen an caspase-3/9 Aktivatioun vun OLFM4 hummeren gastric Kriibs Zellen verwandelt. A. Zell Zyklus Analyse. Ännerungen am Zell Zyklus Verdeelung vun SGC-7901-HK, SGC-7901-siOLFM4 an MKN45-HK, MKN45-siOLFM4 Zellen sech duerch FCM analyséiert. Donnéeën vertrieden mengen Prozentsaz vun Zell-Zyklus Phase Verdeelung (n = 3). B. Zell apoptosis Analyse. Apoptosis war mat AnnexinV-PE /7-vunda staining vum FCM geschat. Donnéeën vertrieden mengen apoptotic Zell Prozentsaz (n = 3). C. Caspase-3 an -9 activations. Caspase-3, 9 activations tëscht uginn Zelle gewisen. ** P &Si besteet; 0,01 vs. Kontroll Grupp HK. VerfÜgung Fir erauszefannen, ob apoptosis zu dësem Wuesstem inhibition Équipe ass, mir standing nächst Zell apoptosis Analyse. Spannen, kéint reduzéiert OLFM4 Ausdrock net an bedeitendst Ännerungen am apoptosis (Dorënner 4B) Resultat, wat mat der Zell Zyklus Analyse konsequent ass keng visuell sub-G1 Phase vun der getest Zellen weist. Fir weider hire Restaurant vun apoptotic Signaler iwwerpréifen, caspase-3 /-9 Aktivitéit war och vun colorimetric Aktivéierung assays identifizéiert. Béid caspase-3 an -9 activations zougedréckt kee groussen Ännerungen an der knockdown vun OLFM4 zu SGC-7901 an MKN45 Zellen (Dorënner 4C). Dës Resultater hindeit, datt verwandelt-Regulatioun vun OLFM4 kann vun dreiwen Zell Zyklus Werdegang net sensibiliséieren apoptosis zu gastric Kriibs Zellen. VerfÜgung Läsche vun OLFM4 sensitizes gastric Kriibs Zellen ze H2O2 oder TNF α-entschlof apoptosis
d'Frae Effet vun H 2O 2 oder TNF α op der apoptosis tëscht OLFM4 hummeren verwandelt a Kontroll Zellen HK war och ze propagéieren. OLFM4 hummeren verwandelt oder Kontroll Zellen HK sech mat 10, 100 an 1000 μM H 2O 2 oder 5, 10 an 50 Dummeldéng /ml TNF α bzw. behandelt. Zell Nuetsvolen an apoptosis sech évaluéieren. Als zu Dorënner 5A-D gewisen, eng Dose-ofhängeg erofgoen zu Zell Nuetsvolen war an H 2O 2 oder TNF α-behandelt observéiert OLFM4 verwandelt Zellen hummeren. Ausserdeem, Behandlung vun 10 μM H 2O 2 (Dorënner 5A-B) oder 10 Dummeldéng /ml TNF α (Dorënner 5C-D) Nerve en däitleche Minus am Zell Nuetsvolen zu OLFM4 hummeren verwandelt Zellen am Verglach mat HK Kontroll Zellen (P &Si besteet; 0.01). Vun allem Interessi ass Opklärung dass mat 10 ~ 1000 μM H 2O behandelt knockdown Zellen anstatt HK Kontroll Zellen OLFM4 2 méi dichteg apoptotic Prozentzuelen am Verglach zu deene mat PBS mierkt (P &Si besteet; 0.01) behandelt Schatzkummer ( Figur 5A-B). Ähnlech Resultater goufen och zu TNF α-behandelt OLFM4 knockdown Zellen (Dorënner 5C-D) gesinn. An anere Wierder, OLFM4 verstäerkte H 2O 2 oder TNF α-entschlof apoptosis zu gastric Kriibs Zellen hummeren verwandelt, déi besot Läsche vun OLFM4 feieren SGC-7901 an MKN45 Zellen méi sensibel op Behandlung vun H 2O 2 oder TNF α. Figur 5 Äntwert vun OLFM4 knockdown SGC-7901 an MKN45 Zellen ze apoptosis-Pinguin Agenten H 2 O 2 oder TNF α. OLFM4 knockdown an HK Kontroll Zellen sech fir 12 h mat H2O2 (A a B) oder TNF α (C an D) als uginn Schrëtt behandelt. Zell Nuetsvolen vun WST-1 assay (A-D lénks Brieder) a ausgedréckt an der heeschen sel Wäert (450 nm) (n = 3) gemooss gouf. De Prozentsaz vun de apoptotic Zellen war vum FCM (A-D Recht Brieder) an ausdrécke am apoptotic Prozentsaz mengen sech (n = 3). * P &Si besteet; 0,05, ** P &Si besteet; 0,01 vs. HK Kontroll Grupp. VerfÜgung Caspase-3 Aktivitéit ass am H2O2 oder TNF α-entschlof apoptosis zu OLFM4 Équipe hummeren-verwandelt Zellen VerfÜgung D'virun Resultater uginn, datt dru Ugrëff vun OLFM4 konnt H 2O Erhéijung 2 oder TNF α-stimuléiert apoptosis. Fir weider z'iwwerpréiwen ob caspase-3 ass an der H 2O ageschalt 2 oder TNF α-entschlof apoptosis zu OLFM4 knockdown Zellen, mir caspase-3 Aktivatioun vun H 2O 2 oder TNF nächst fonnt α-behandelt Zellen colorimetric assay benotzt. Als zu Dorënner 6A, Behandlung vun H dës 2O 2 oder TNF α schéinen vill méi Opléisung vun caspase-3 Aktivitéit zu OLFM4 knockdown Zellen wéi Kontroll Zellen HK (P &Si besteet; 0.01) suggeréiert caspase-3 Aktivitéit ass an der H 2O 2 oder TNF α-entschlof apoptosis zu OLFM4 knockdown Zellen Équipe. Fir weider z'iwwerpréiwen ob H 2O 2 oder TNF α-entschlof apoptosis ass ofhängeg op caspase-3 Aktivitéit, Z-VAD-fmk, engem caspase inhibitor virun der Behandlung vun H benotzt gouf 2O 2 oder TNF α. (Well 6C-D; Pre-Behandlung vun Z-VAD-fmk vill H 2O 2 oder TNF α-entschlof Zell apoptosis souwéi caspase-3 Aktivitéit zu souwuel OLFM4 knockdown Zellen (0.01 P &Si besteet) attenuated ), wat beweist, datt H 2O 2 oder TNF α-entschlof apoptosis zu OLFM4 knockdown Zellen caspase-3 ofhängeg ass. Figur 6 Zesummenaarbecht vun caspase-3 Aktivitéit an H 2 O 2 oder TNF α-entschlof apoptosis zu OLFM4 knockdown SGC-7901 an MKN45 Zellen. (A-B) Geklomm caspase-3 Aktivitéit zu H2O2 oder TNF α-behandelt OLFM4 knockdown Zellen. OLFM4 knockdown an HK-Kontroll Zellen sech mat 10 μM H2O2 (A) behandelt oder 10 Dummeldéng /ml TNF α (B) fir 12 h. Caspase-3 Aktivitéit war mat colorimetric assay a ausgedréckt an fantastesch Ännerungen gemooss. ** P &Si besteet; 0,01 versus PBS mierkt Grupp (n = 3). (C-D) réckgängeg Zell apoptosis vun caspase inhibitor zu OLFM4 knockdown Zellen. Zellen sech mat H2O2 oder TNF α eleng mat uginn Schrëtt behandelt wéi uewen mat 20 μM Z-VAD-fmk 2 h virun H2O2 oder TNF α Behandlung ernimmt oder pretreated. De Prozentsaz vun apoptotic Zellen war vum FCM sech. Donnéeën vertrieden heescht ± Fils vum dräi onofhängeg Experimenter. ** P &Si besteet; 0,01 vs. H2O2 (C) oder TNF α (D) -treated OLFM4 Grupp knockdown Zellen. VerfÜgung Diskussioun VerfÜgung Féierplaz aktueller Donnéeën OLFM4 bewisen dacks zu vill Zorte vu mënschlechen erhéijen dorënner gastric Kriibs overexpressed ass, an et gouf ugeholl Leeschtung eng wichteg Roll bei der Entwécklung an Werdegang vun gastric carcinogenesis [19, 20]. Obwuel virdrun Studie gewisen hunn, datt OLFM4 zu apoptosis an entholl Wuesstem Équipe ass, proposéiere rezent Observatioune och déi Zell oder Otemschwieregkeeten-spezifesch Effekter fir d'OLFM4 Gentherapie existéieren kann. Relativ kleng ass, wat d'entholl Wuesstem an apoptosis Basisdaten gastric Kriibs-spezifesch OLFM4 Ausdrock bekannt. Zu engem bessere Verständnis vun dësem Roll fir d'verännert OLFM4 zu Mënsch gastric Kriibs kréien, ass experimentell Ënnerstëtzung néideg der Roll vun der OLFM4 Gentherapie zu gastric Kriibs ze validéieren. VerfÜgung Et ass déi anormal Ausdrock vun hGC-1 gewise gi kënnen regulariséiert ginn op der transcriptional oder posttranscriptional Niveau [13]. An eis heiteg Wierker, ze propagéieren mir Ausdrock Muster direkt OLFM4 FAQ zu gastric Kriibs Zellen an normal GES-1 Zellen. SGC-7901 an MKN45 Zellen ausdrécken relativ héich OLFM4 Niveauen sech fir dës Etude an dëse Match gaangen. Zanter loung d'Zilscheif Gentherapie Ausdrock vun genetesch heescht vun etabléierten Zell Linnen ass hëllefräich fir e bessert Verständnis vun hirer Roll an der malignant phenotype Erhalen besonnesch an Genen analyséiert datt fir bewosst Iwwerliewe Grondlinne sinn [21], generéiert mir stabil Klon déinen vun SGC-7901 an MKN45 ausdrécken OLFM4-siRNA oder Jacquerie HK Kontroll vun der plasmid-baséiert siRNA Approche a confirméiert hummeren-verwandelt Effizienz vun OLFM4 Gentherapie um mRNA an FAQ Niveau vun qRT-Hinnen alleguer a westlech blotting. VerfÜgung Eis presentéieren Wierker bewisen, datt OLFM4 spillt eng wesentlech Roll an gastric Kriibs tumorigenesis. Knockdown vun OLFM4 bremst Zell Prolifératioun a Hafen-onofhängeg Wuesstem ëmmer eng kënschtlech. Xenograft entholl Modell vun VIVO beinhalt och dass OLFM4 ofgeholl der entholl Wuesstem vun mënschlech gastric Kriibs Zellen inhibit kann. Dës Resultater weisen, datt OLFM4 spillt eng wichteg Roll an der Zell Prolifératioun vu gastric Kriibs Zellen. Eis Resultater observéiert och dass hummeren-Ugrëff vun OLFM4 net den Taux vun apoptosis an caspase-3 an 9 activations zu OLFM4 knockdown Zellen Afloss hat, proposéiert, datt apoptosis net de Mechanismus d'inhibition vun entholl Wuesstem kënnen Basisdaten. Sou, ka mir dat OLFM4 Ausdrock fir Kriibs Zell Iwwerliewe net essentiel ass, déi am Aklang mat enger rezent Observatioun ass déi genetesch hummeren-out Mais fir OLFM4 weisen normal Entwécklung an hematopoietic phenotypes [17]. Fir weider de Mechanismus Markenzeeche Wuesstem inhibition Basisdaten, standing mir Zyklus Analyse Zell a bewisen, dass inhibition vun OLFM4 Ausdrock gastric Kriibs Zellen entschlof an G1 Phase vun der Zell Zyklus ze leeën, suggeréiert datt verwandelt-reegelen OLFM4 vläicht eng inhibitory Effekt op Zell Wuesstem huele vun e Mechanismus Regulatioun Zell Zyklus Werdegang net apoptosis zu gastric Kriibs Zellen sensibiliséieren. VerfÜgung Resistance vun entholl Zellen zu der Aféierungs- vun apoptosis ass ee vun den Faktore responsabel fir den Echec vun villen konventionell anticancer Therapien dass anticancer Agenten an Stralung benotzen. Dofir, ass Kontroll apoptosis zu Kriibs Zellen vun kritescher biologesch a Krankheete Bedeitung [22, 23]. Anti-apoptotic Aktivitéit ass eng aner wichteg Fonctioun vun OLFM4 Gentherapie [2]. Besonnesch, H 2O 2-entschlof bewosst apoptosis war vun overexpressed OLFM4 zu engem prostatic Kriibs Zell Linn attenuated [2]. Ausserdem, hun MKN45 Zellen eng Kapazitéit vun Resistenz zu TNF α-entschlof apoptosis [24] gewisen. Entscheet dëse Conclusiounen, hypothesize mir dass knockdown vun OLFM4 Ausdrock kéint H 2O 2 oder TNF α-entschlof apoptosis zu gastric Kriibs Zellen verbesseren. Hei, awer mir dat richteg Fuesstëmmung-Ugrëff vun OLFM4 effektiv gestäerkt Zell apoptosis an Äntwert ze H 2O 2 oder TNF α Stimulatioun vun MKN45 souwéi SGC-7901 Zellen, proposéiert OLFM4 Outil kënnt de waat gastric Kriibs Erhéijung Zellen zu der Presenz vun H 2O 2 oder TNF α. VerfÜgung Well et bekannt ass, dass caspase-3, e Schlëssel exekutiv Protein vun der apoptotic Passerelle, engem kriteschen Roll an apoptotic Prozesser an enger Rei spillt vun Zellen. Mir iwwerpréift weider caspase-3 Aktivatioun vun OLFM4 knockdown an HK Kontroll Zellen an d'Presenz oder Feele vun caspase inhibitor Z-VAD-fmk. Mir gesinn, datt Behandlung vun H 2O 2 oder TNF α vill weider-reegelen Caspase-3 Aktivitéit zu OLFM4 knockdown Zellen wéi Kontroll Zellen HK iwwerdeems Précoce-Behandlung mat Z-VAD-fmk réckgängeg caspase-3 Aktivitéit wéi gutt den H 2O 2 oder TNF α-entschlof apoptosis. D'Resultater weisen, datt H 2O 2 oder TNF α-entschlof apoptosis zu OLFM4 knockdown Zellen ass caspase-3 ofhängeg. Baséiert op der presentéieren Donnéeën, et ass erdenklech datt weider-reegelen OLFM4 gastric Kriibs Zellen erméiglecht apoptosis Aféierungs- ze widderstoen vun der waat falender Drogen ze anticancer. VerfÜgung An Tatsaach, antagonists vun OLFM4 goufen gemellt der Verbreedung zu aneren Zorte vu bis inhibit Kriibs Zellen wéi mënschlech pancreatic Kriibs PANC-1 Zellen [8] a mënschlech haett caner SBC-1 Zellen [9]. Allerdéngs hunn kontrovers Resultater och observéiert ginn. Ofgeholl OLFM4 mRNA Zellen PANC-1 Prolifératioun vun S zu G2 /M Phase verhaft [8], inhibit wat aus eise Resultater verschidden ass verspéiten G1 Phase Fortschrëtter an gastric Kriibs weist. Verschidden wichteg Detailer (oder Grënn) kéint dës Ënnerscheeder erklären. Éischt, wéi rezent Studien virgeschlo, eng Zell oder Otemschwieregkeeten spezifesch Roll vun OLFM4 (gastric Kriibs Zellen an pancreatic Kriibs Zellen) kann e iwwerzeegt Erklärung fir dës Ënnerscheeder ginn. De stäerkste enormen ass, bei mRNA Niveau OLFM4 Ausdrock awer net FAQ Niveau vun PANC-1 Zellen war erfollegräich RT-Hinnen alleguer [8] hierkommen, déi rezenste Rapport vum Kim et al gemooss benotzt. den Ausdrock Muster a Roll vun OLFM4 Gentherapie zu PANC-1 Zellen zougedréckt datt PANC-1 Zellen kee OLFM4 mRNA Ausdrock [25] huet, brauchen déi besot weider Bekräftegung. VerfÜgung Trotz OLFM4 silencing fir eng inhibitory Effekt op Zell Wuesstem gewise gouf an engem Verréngerung Resistenz zu H 2O 2 oder TNF α Behandlung vun Zellen gastric Kriibs, ass et net eliminéiert déi aner Mechanismen och vun OLFM4 regulariséiert ginn an dréit zu Wuesstem inhibition an apoptosis Kontroll sécher, d'crosstalk vun de Reseau vu que . Tatsächlech OLFM4, eng Zilscheif Gentherapie vun NF-κB Passerelle [16, 17, 25], huet och e negativen Feedback Effekt op H. pylori VerfÜgung Wonn-entschlof dës NF-κB Aktivatioun vun HEK 293 T Zellen [6],

• Epidermal Wuesstem Faktor receptor strukturell hire Restaurant zu gastric cancer
• Ausdrock vun COX-2 an VEGF-C zu gastric Kriibs: kennenzeléieren mat lymphangiogenesis an prognostic Implikatioune