Depleção do gene OLFM4 inibe o crescimento celular e aumenta a sensibilidade ao peróxido de hidrogénio e factor de necrose tumoral-alfa induzida por apoptose em células de cancro gástrico

Depleção do gene OLFM4 inibe o crescimento celular e aumenta a sensibilidade ao peróxido de hidrogénio e factor de necrose tumoral-alfa induzida por apoptose em células de cancro gástrico
Resumo
fundo
humano olfactomedin gene 4 (OLFM4) é uma glicoproteína segregada mais comumente conhecido que a molécula anti-apoptótica GW112. OLFM4 é encontrado para ser frequentemente sobre-regulada em muitos tipos de tumores humanos, incluindo o cancro gástrico e acreditou-se que desempenham um papel importante na progressão do cancro gástrico. Embora a função de OLFM4 foi indicado em muitos estudos, evidências recentes sugerem fortemente um papel dependente do tipo de célula ou tecido de OLFM4 no crescimento celular e apoptose. O objetivo deste estudo é analisar o papel da expressão específica de câncer gástrico de OLFM4 no crescimento celular e resistência à apoptose.
Métodos
OLFM4 expressão foi eliminado por interferência de RNA em células MKN45 SGC-7901 e. A proliferação celular, crescimento independente de ancoragem, do ciclo celular e apoptose foram caracterizadas in vitro. Tumorigenicidade foi analisada in vivo. A apoptose e a caspase-3 de activação em resposta ao peróxido de hidrogénio (H 2O 2) ou factor de necrose tumoral-alfa (TNF α) foram avaliadas na presença ou ausência de inibidor de caspases Z-VAD-fmk.
resultados of the eliminação da proteína OLFM4 por interferência de RNA em células MKN45 SGC-7901 e inibe a tumorigenicidade significativamente tanto in vitro e in vivo através da indução da paragem em G1 célula (todos com P < 0,01). OLFM4 knockdown não desencadear a apoptose celular óbvio, mas aumentou H 2O 2 ou TNF apoptose induzida por α e actividade da caspase-3 (todos a P < 0,01). O tratamento de Z-VAD-fmk atenuada actividade da caspase-3 e reverteu significativamente o H 2O 2 ou TNF apoptose em células de knockdown OLFM4 induzida por α (todos com P < 0,01). Conclusão

nosso estudo sugere que a depleção de OLFM4 inibe significativamente tumorigenicidade das células MKN45 câncer gástrico SGC-7901 e. Bloqueio OLFM4 expressão pode sensibilizar células cancerosas gástricas a H 2O 2 ou TNF α tratamento, aumentando a caspase-3 apoptose dependente. A estratégia de combinação com base em OLFM4 tratamento de inibição e anticancerígenos drogas podem oferecer potencial terapêutico na intervenção câncer gástrico.
Palavras-chave
gástrica câncer Olfactomedin 4 RNA crescimento interferência celular apoptose resistência fundo
OLFM4 Humano (olfactomedin 4, também conhecido como hGC-1, GW112), originalmente denominado humano clonado a partir de células precursoras mielóides, após a estimulação de granulócitos factor de estimulação de colónias de [1], é uma glicoproteína segregada, mais vulgarmente conhecida como a molécula de anti-apoptótica GW112 [2, 3]. OLFM4 é normalmente expresso na medula óssea, da próstata, do intestino delgado, estômago, cólon e pâncreas [1, 4]. Subsequentemente, aumentou OLFM4 níveis também foram encontrados no epitélio da cripta do cólon inflamado mucosa de doenças inflamatórias do intestino [5] e em biópsias gástricas infectados com Helicobacter pylori [6, 7]. Mais recentemente, sobre-regulada expressão OLFM4 foi descrito no pulmão e da mama [8], da próstata [3], gástrico [3, 9] e cancros pancreáticos [8, 9], bem como em adenomas colorectais [10-14].
tem sido sugerido que OLFM4 está envolvido em processos celulares, tais como crescimento de tumores e apoptose [2]. Embora a função celular de OLFM4 foi investigada, os resultados nem sempre coincidente. A sobre-expressão de OLFM4 foi mostrado para facilitar rato próstata tumor caminhada-C1 crescimento em células singeneicas ratinhos C57 /BL6 [2], mas inibir a proliferação do cancro da próstata humano PC-3 de células [15]. Além disso, OLFM4-regulada mostrou uma forte actividade anti-apoptótica no rato linfóide veia células endoteliais SVEC e adenocarcinoma humano células HeLa [1, 2], ao passo que descobertas recentes sugeriram um efeito pró-apoptótica de OLFM4 em células HL-60 de leucemia mielóide humanas [16 ]. A evidência a partir destes estudos sugere fortemente que os papéis de OLFM4 no controlo do crescimento celular e a apoptose pode depender do tipo de célula ou tecido [10, 13-15]. Até à data, no entanto, dados muito limitados sobre o papel do OLFM4 no crescimento celular e perfis de apoptose de células cancerosas gástricas foi publicado.
No presente estudo, analisamos a expressão da proteína OLFM4 em células cancerosas gástricas e epitelial gástrica humana normal GES-1 células por western blotting. Usando RNA curto hairpin mediada por plasmídeo (shRNA), que inibiu OLFM4 expressão no câncer gástrico SGC-7901 e células MKN45 para observar a proliferação celular, a fase do ciclo celular, apoptose in vitro e avaliar sua capacidade tumorigénica in vivo. Nós também exploraram a apoptose e a caspase-3 de activação em resposta a agentes citotóxicos, tais como H 2O 2 ou α TNF na presença ou ausência de inibidor de caspases Z-VAD-fmk entre células knockdown OLFM4 e células de controlo HK .
Métodos
cultura de células, reagentes e camundongos
As células cancerosas gástricas humanas BGC-823, GSC-27, SGC-7901, MKN28, MKN45 e epiteliais gástricas normais humanos GES-1 células foram mantidas meio DMEM (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) contendo 10% de soro fetal de bovino (FBS, Gibco BRL, EUA), 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina. H 2O 2 e TNF-α foram obtidos a partir de Sigma (St. Louis, MO) e Z-VAD-FMK foi adquirido de Calbiochem (San Diego, CA). camundongos BALB /C nu (nu /nu) (4-6 semanas de idade, grau SPF, 20 ± 3 g) foram adquiridos a partir do Centro de Animal Laboratório de Chongqing Medical University (Chongqing, China). Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes éticas internacionalmente aceites (NIH publicação no. 85-23, revista, 1985).
Plasmídeo constrói e transfecção estável
shRNA mediada por plasmídeo RNAi (pGenesil 1,1 siOLFM4) e um controle mexidos plasmídeo (pGenesil 1,1 HK) foram construídos para derrubar o OLFM4 endógena em células MKN45 SGC-7901 e. Após a seleção transfecção e neomicina (G418), OLFM4 knock-down SGC-7901-siOLFM4, as células MKN45-siOLFM4 e mexidos SGC-7901-HK, foram obtidos de forma estável células controle MKN45-HK, respectivamente (detalhes mostrados na arquivo adicionais 1: Suplementar dados).
extracção de ARN e RT-PCR quantitativo (qRT-PCR) o ARN total
em células ou xenoenxertos de tumores diferentes foi extraído utilizando o RNeasy Mini Kit (Qiagen, CA, EUA), e foi seguido de síntese de ADNc utilizando o sistema de síntese de ADNc de cadeia ReverTra-Ace-α primeiro (Toyobo, Osaka, Japão) tal como descrito anterior [17]. Quantitative PCR em tempo real foi realizado utilizando-7500 em tempo real do sistema de PCR (Applied Biosystems) com SYBR-Green como um corante fluorescente (Toyobo, Osaka, Japão) (pormenores mostrados na arquivo adicional 1: dados suplementares). Fold alterações na expressão de genes foram determinadas utilizando o "2 - DDCT". Método de [18]
ensaio de proliferação celular in vitro e a viabilidade das células de medição
proliferação celular e a viabilidade celular foi medida utilizando a proliferação celular WST-1 Kit (Roche ) de acordo com as instruções do fabricante. Para a proliferação de células, as células foram semeadas a uma densidade de 1 × 10 3 células por poço de uma placas de 96 poços e cultivadas durante 5 dias. O valor de densidade óptica (450 nm) foi detectada utilizando o Microplate Reader (Tacan, Suazilândia) por dia. Cada ensaio foi realizado em triplicado. Tal como para a medição da viabilidade celular, as células (1 x 10 4 /poço) foram cultivadas em 200 ul de meio em placas de 96 poços. Após 12 h de incubação, H 2O 2 ou TNF α foi tratada em concentrações indicadas. absorvância relativa foi medida como descrito na proliferação celular.
ensaio de crescimento independente de ancoragem-
crescimento Anchorage-independente foi efectuada em agar macio para reflectir clonogenicidade in vitro. Resumidamente, as células (5 × 10 2) a partir de cada colónia foram suspensos em 0,3% de agar em DMEM e em seguida plaqueadas em ágar solidificado (0,5%) em placas de 6 poços. As células foram incubadas durante 2 semanas a 37 ° C em 5% de CO 2 antes das colónias foi medida. Número de colónias foi contado em 200 × ampliação para cinco campos aleatórios. Cada ensaio foi realizado em triplicado. A análise de citometria de fluxo

citometria de fluxo (FCM) foi realizada para avaliar a progressão do ciclo celular ou apoptose. (Detalhes mostrados no arquivo adicional 1: dados suplementares)
ensaio de caspase
actividade enzimática de caspase-3 e -9 foi medida utilizando um ensaio fluorimétrico de acordo com um método descrito anteriormente [8]
análise de Western blot.
transferência de Western foi realizada como descrito anteriormente [17]. Os anticorpos seguintes foram utilizados para a transferência de Western: anti-OLFM4 (Abcam, Cambridge, Reino Unido) e anti-β-actina (Santa Cruz, CA, EUA) A quantidade relativa de proteínas foi analisado utilizando Quantity One Software (Bio-Rad, Hercules , CA, EUA) e normalizado para a de β-actina (detalhes mostrados no arquivo adicional 1:. dados suplementar)
modelo de tumor de xenoenxerto
Quarenta ratinhos nus foram divididos aleatoriamente em quatro grupos. Cada grupo foi injectada por via subcutânea nas costas com a suspensão de 200 ul contendo 2 × 10 6 células acima mencionados, respectivamente. O volume dos xenoenxertos foi medido em série. Os ratinhos foram sacrificados após 35 dias. Os xenoenxertos foram excisados ​​e pesados. As taxas de inibição de xenoenxertos foram calculados de acordo com a fórmula: taxa de inibição (%) = 1-peso médio (OLFM4 derrubar células-injetados grupo e de controlo HK células-injetada grupo) /peso médio (grupo de controle HK células injetadas) × 100%. Em seguida, o tecido tumoral foi sujeito a isolamento de ARN, total ou detecção imuno-histoquímica.
Imuno-histoquímica (IHC)
OLFM4 proteínas em xenoenxertos de tumor foram analisados ​​por IHC utilizando anticorpo de coelho anti-OLFM4 (Abcam, Cambridge, Reino Unido) (pormenores mostrados na arquivo adicional. 1: recolha de dados suplementares): estatísticas
dados de experimentos independentes foram expressos como a média ± SD de pelo menos três experiências. As comparações entre os grupos foram analisadas por Student bicaudal t
-teste ou ANOVA, conforme o caso, e valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados da batida eficiente para baixo do gene OLFM4 por siRNA mediada por plasmídeo em células cancerosas gástricas
OLFM4 expressão da proteína padrão foi investigada em câncer gástrico BGC-823, HGC-27, SGC-7901, MKN28, MKN45 células normais e células de controlo GES-1 (Figura 1A). proteína OLFM4 definitivamente expressa em todas estas células cancerosas gástricas e células GES-1. Em particular, as células MKN45 SGC-7901 e expressou proteínas em relação OLFM4 nível elevado do que outras células cancerosas gástricas e células GES-1. Portanto, as células MKN45 SGC-7901 e foram escolhidos para estudos posteriores. Figura 1 knockdown eficiente de OLFM4 por interferência de RNA em células de câncer gástrico MKN45 SGC-7901 e. A. Expressão de proteína OLFM4 em várias linhas celulares de cancro gástrico. perfil de expressão de proteínas OLFM4 foi analisada usando transferência de Western com β-actina como um controlo interno. células GES-1 foram servidos como células normais de controlo. B. expressão de ARNm em células OLFM4 knockdown OLFM4. A expressão relativa de OLFM4 foi detectada por qRT-PCR. β-actina foi utilizado como um controlo interno. Fold alterações na expressão de ARNm OLFM4 foram determinados usando o método 2-ΔΔCt. a expressão da proteína C. OLFM4 em células knockdown OLFM4. a expressão da proteína OLFM4 foi detectada por transferência Western. proteína p-actina foi utilizado como um controlo interno. Representantes de três experimentos são mostrados. ** P < 0,01 HK grupo células de controlo versus (n = 3).
Para sub-regular a expressão OLFM4, um gene OLFM4 segmentação shRNA mediada por plasmídeo foi construído para bater de forma estável para baixo OLFM4 expressão em células MKN45 SGC-7901 e. Como mostrado na Figura 1B, os níveis de ARNm OLFM4 foram significativamente reduzidos no SGC-7901-siOLFM4 e células MKN45-siOLFM4 em comparação com o seu controlo HK ou células progenitoras (p < 0,01). Estes resultados foram confirmados por análise de transferência de Western (Figura 1C). Não foi observada diferença significativa na expressão OLFM4 entre as células de controlo parental e de Hong Kong. Os níveis de ARNm e proteína para o β-actina foram semelhantes entre os diferentes grupos. Estes resultados sugerem que a mediada por plasmídeo OLFM4-siRNA podem especificamente e eficientemente derrubar nível OLFM4 em células cancerosas gástricas. Dada a análise indicado acima, por conseguinte, OLFM4 derrubar células e as células de controlo HK foram escolhidos para posterior investigação.
OLFM4 knockdown inibe a proliferação de células de cancro gástrico e o crescimento independente da ancoragem in vitro
Para determinar o papel de OLFM4 em gástrica o crescimento de células de cancro, nós investigamos o efeito de ARNsi OLFM4 sobre o crescimento celular no ponto de tempo de 1-5 dias por ensaio de WST-1. Como mostrado na Figura 2A, em todas as duas linhas celulares de cancro gástrico, o crescimento de OLFM4 derrubar células foi significativamente reduzido em comparação com células de controlo de HK dia 3 (P < 0,01). Para examinar ainda a importância de OLFM4 na tumorigénese de células cancerosas gástricas in vitro, realizou-se ensaios de crescimento independente de ancoragem e encontraram células MKN45 SGC-7901 e expressando controles HK cresceu bem em agar mole, formando colónias distintas. Em contraste, OLFM4 knockdown células MKN45 SGC-7901 e exibiram uma redução dramática no número de colónias de agar mole (P < 0,01) (Figura 2B), mostrando transformar capacidades menores que os das células de controlo. Estes dados indicaram que knock-down de OLFM4 poderia inibir a proliferação de células de cancro gástrico e o crescimento independente da ancoragem in vitro. Figura 2 knockdown de OLFM4 inibe o crescimento de células MKN45 SGC-7901 e in vitro e in vivo. curva de crescimento celular A.. A proliferação celular in vitro foi avaliada por meio da curva de crescimento celular, tal como determinado pela contagem do número de células (WST-1 de ensaio) nas células SGC-7901 (painel da esquerda) e células MKN45 (painel direito). O valor de DO (450 nm) foi contada nos dias indicados e apresentados como o número de células médios (n = 3). B. crescimento Anchorage-independente em agar mole. Imagens representativas de três experiências mostraram (painel superior). Os dados representam o número médio de colónias contadas a 200 × ampliação de 5 campos aleatórios (painel inferior). C. O volume médio do tumor após a injecção subcutânea de ratinhos nus com células de controlo HK ou knockdown OLFM4 foi medida nos pontos de tempo indicados. D. representativas tumores imagens em 35 dias após a injecção subcutânea de células indicados. peso E. média do tumor (painel esquerdo) e taxa de inibição (painel direito) em xenoenxertos tumorais. Os dados representam o peso médio do tumor de xenoenxertos (média ± DP, n = 10). ** P < 0,01 vs grupo de controlo HK. Efeito inibidor do crescimento de
diminuiu OLFM4 em xenoenxertos de tumor gástrico
Além disso, também realizada ensaio de formação do tumor por via subcutânea em ratinhos nu para avaliar o efeito de supressão do crescimento de OLFM4-regulada negativamente in vivo. ratinhos nus foram injectados por via subcutânea com OLFM4 knockdown ou células de controlo de Hong Kong. Os volumes dos tumores por 4 dias e o peso do tumor com 5 semanas foram medidos, respectivamente, após a injecção subcutânea. Tal como mostrado na Figura 2C-D, se o volume tumoral ou tumor de peso produzido pela OLFM4 derrubar SGC-7901 e células MKN45 tinha reduzido de forma significativa o crescimento em comparação com tumores produzidos em ratinhos injectados com células transfectadas com controlo HK (P < 0,01). A taxa inibidora de SGC-7901 e MKN45 derrubar células injectados grupo no crescimento do tumor era 40,29% e 37,48%, respectivamente (Figura 2E).
Para assegurar ainda mais OLFM4 expressão é silenciada indeedly após a injecção subcutânea de ratinhos nus, nós também avaliada OLFM4 expressão em xenoenxertos de tumor utilizando qRT-PCR e IHC. Da mesma forma, in vitro, o nível de ARNm OLFM4 em xenoenxertos de tumores produzidos por células de knockdown OLFM4 também mostrou uma diminuição significativa em comparação com os tumores de controlo HK xenoenxertos (P < 0,01) (Figura 3A). Consistente com os resultados de qRT-PCR, a redução significativa de proteína OLFM4 também foi observada em xenoenxertos tumorais por IHC (P < 0,01) (Figura 3B e 3C). Maior escala de cinza e de sinal positivo mais forte através da visualização DAB foram encontrados em xenoenxertos de tumor do grupo de controlo HK células-injetado. Pelo contrário, fraca coloração castanha foi observada em xenoenxertos do tumor do grupo de knockdown OLFM4 células-injectado. Além disso, a região mais larga necrose foi observada em xenoenxertos de tumores produzidos por células de controlo HK devido a um crescimento rápido das células de controlo HK (Figura 3B painel superior). Estes dados forneceram um forte indício de que OLFM4 expressão de mRNA e os níveis de proteína são estavelmente inibida fato in vivo. Tomadas em conjunto, tanto in vitro e em experiências in vivo sugerem que OLFM4 knockdown inibe o crescimento de células de cancro gástrico. Figura 3 qRT-PCR e a detecção de IHC OLFM4 em xenoenxertos de tumor. A. qRT-PCR para mRNA de OLFM4 em xenoenxertos de tumor. Dobram mudanças no mRNA OLFM4 foram determinados utilizando o método 2-ΔΔCt. gene da p-actina foi utilizado como um controlo interno. B. H & E de coloração (painel superior) e de IHQ para OLFM4 proteína (painel inferior), em xenoenxertos de tumor. Imagens representativas (200 ×) são mostrados. N, necrose. C. Análise de Quantificação da expressão OLFM4. O valor médio foi medido a partir de cinco campos aleatoriamente diferentes sob o microscópio (400 ×) usando o PLUS V6.0 Imagem-Pro. Os dados foram expressos como média ± SD. ** P < 0,01 vs. grupo controle HK.
OLFM4 knock-down atrasos G1 a transição S, mas não acionar apoptose óbvio em células cancerosas gástricas
Dadas as nossas efeitos inibitórios observados no crescimento celular in vitro e in vivo, buscou-se determinar se aumentada apoptose ou a progressão do ciclo celular retardada foi associada com a inibição do crescimento. O primeiro avaliou o efeito de diminuição da OLFM4 na progressão do ciclo celular. Como mostrado na Figura 4A, tanto células MKN45 OLFM4 knockdown SGC-7901 e mostrou o aumento do número significativo na fase G1 e diminuiu números em fase S, em contraste com as células de controlo HK (P < 0,01). Não foram observadas diferenças significativas na /M-fase G2, indicando um atraso G1 típico do ciclo celular. Figura 4 Avaliação da distribuição do ciclo celular, as células em apoptose e caspase-09/03 ativação no OLFM4 derrubar células cancerosas gástricas. análise do ciclo celular A.. Mudanças na distribuição do ciclo celular da SGC-7901-HK, SGC-7901-siOLFM4 e MKN45-HK, as células MKN45-siOLFM4 foram analisadas por FCM. Os dados representam a percentagem média de distribuição de fases do ciclo celular (n = 3). B. A análise celular apoptose. A apoptose foi estimado com a coloração AnnexinV-PE /7-AAD pela FCM. Os dados representam a percentagem média de células apoptóticas (n = 3). C. Caspase-3 e ativações -9. Caspase-3, 9 ativações entre as células indicadas são mostrados. ** P < 0,01 vs grupo controlo HK.
Para determinar se a apoptose está envolvida neste inibição do crescimento, que realizada a análise seguinte apoptose celular. Curiosamente, a expressão reduzida OLFM4 não pode resultar em mudanças significativas na apoptose (Figura 4B), o que é consistente com a análise do ciclo celular mostrando nenhuma fase sub-G1 aparente nas células testadas. Para examinar ainda mais alterações de sinais apoptóticos, a actividade da caspase-3 /-9 foi também identificado por ensaios de activação colorimétricos. Ambos caspase-3 e -9 ativações não mostraram alterações significativas após knockdown de OLFM4 em células MKN45 (Figura 4C) SGC-7901 e. Estes resultados sugerem que a sub-regulação de OLFM4 podem exercer um efeito inibidor sobre o crescimento celular através da regulação progressão do ciclo celular não envolvendo a apoptose em células de cancro gástrico.
Supressão de OLFM4 sensibiliza células gástricas cancerosas ao H2O2 ou TNF apoptose induzida por α
o efeito distinto de H 2O 2 ou TNF α na apoptose entre OLFM4 derrubar e células de controlo de Hong Kong também foi investigado. OLFM4 derrubar ou células de controlo HK foram tratados com 10, 100 e 1000 ^ M H 2O 2 ou 5, 10 e 50 ng /ml de TNF α respectivamente. A viabilidade celular e a apoptose foi avaliada. Como mostrado na Figura 5A-D, foi observada uma diminuição dependente da dose na viabilidade celular em H 2O 2 ou TNF-α tratada OLFM4 derrubar células. Além disso, o tratamento de 10 ^ M H 2O 2 (Figura 5A-B) ou 10 ml de TNF-a (Figura 5C-D) levou a uma redução significativa na viabilidade das células em OLFM4 derrubar células ng /comparada com HK as células de controlo (p < 0,01). De particular interesse é a constatação de que OLFM4 células knockdown em vez de células de controlo HK tratados com 10 ~ 1000 um H 2O 2 exibiu percentuais apoptóticos mais proeminentes em comparação com aqueles tratados com PBS simulada (P < 0,01) ( A Figura 5A-B). Resultados semelhantes foram também observados em células tratadas de TNF-ct OLFM4 knockdown (Figura 5C-D). Em outras palavras, OLFM4 derrubar melhorada H 2O 2 ou TNF apoptose induzida por α em células de cancro gástrico, indicando deleção de OLFM4 feita SGC-7901 e células MKN45 mais sensíveis ao tratamento de H 2O 2 ou α TNF. Figura 5 Resposta de OLFM4 knockdown células MKN45 SGC-7901 e a agentes indutores de apoptose H 2 O 2 ou TNF. OLFM4 knockdown e células de controlo HK foram tratados com H2O2 (A e B) ou TNF α (C e D) como doses indicadas, durante 12 h. A viabilidade celular foi medida por ensaio de WST-1 (painéis da esquerda A-D) e expressa no valor médio (450 nm) (n = 3). A percentagem de células apoptóticas foi determinada por FCM (A-D painéis da direita) e expressa na percentagem média apoptótica (n = 3). * P < 0,05, ** P < apoptose 0,01 vs. grupo controle HK.
Caspase 3-atividade está envolvido em H2O2 ou TNF α-induzida em OLFM4 knock-down células
Os resultados acima indicaram que derrubar de OLFM4 poderia aumentar H 2O 2 ou TNF-α estimulada a apoptose. Para verificar ainda se caspase-3 é ativado na H 2O 2 ou TNF apoptose induzida por α em células knockdown OLFM4, o próximo detectado ativação da caspase-3 em H 2O 2 ou TNF a-tratada células utilizando o ensaio colorimétrico. Como mostrado na Figura 6A, o tratamento de H 2O 2 ou α TNF resultou em muito mais aumento da actividade da caspase-3 em células de knockdown OLFM4 do que as células de controlo HK (P < 0,01), sugerindo que a actividade da caspase-3 está envolvido na H 2O apoptose induzida por α 2 ou TNF em células knockdown OLFM4. Para verificar ainda se H 2O 2 ou TNF apoptose induzida por α é dependente de caspase 3-atividade, Z-VAD-fmk, um inibidor da caspase foi utilizado antes do tratamento de H 2O 2 ou TNF α. Pré-tratamento de Z-VAD-fmk significativamente atenuada H 2O 2 ou apoptose celular induzida por α TNF, bem como a actividade da caspase-3 em ambas as OLFM4 células knockdown (P < 0,01) (Figura 6C-D ), indicando que H 2O 2 ou TNF apoptose induzida por α é dependente em células knockdown OLFM4 3-caspase. Figura 6 O envolvimento da actividade da caspase-3 em H 2 O 2 ou TNF-α apoptose induzida em células MKN45 OLFM4 knockdown SGC-7901 e. (A-B) Aumento da actividade da caspase-3 em células de knockdown OLFM4 tratados com H2O2 alfa ou TNF. células OLFM4 knockdown e HK-controlo foram tratadas com 10? M de H2O2 (A) ou 10 ng /ml de TNF α (B) durante 12 h. a actividade da caspase-3 foi medida utilizando um ensaio colorimétrico e expresso em mudanças de dobragem. ** P < 0,01 versus PBS grupo simulada (n = 3). (C-D) reverteu a apoptose celular por inibidores de caspases em células de knockdown OLFM4. As células foram tratadas com H2O2 ou TNF α só com doses indicadas como acima indicado ou pré-tratado com 20 uM de Z-VAD-fmk 2 h antes de H2O2 ou TNF α tratamento. A percentagem de células apoptóticas foi determinada por FCM. Os dados representam as médias ± SD de três experiências independentes. ** P < 0,01 vs. H2O2 (C) ou α TNF (D) tenha sido tratada com OLFM4 grupo células knockdown.
Discussão
dados recentemente acumulando demonstrado OLFM4 é frequentemente sobre-expresso em muitos tipos de tumores humanos incluindo câncer gástrico, e se acreditava desempenham um papel crucial no desenvolvimento e progressão da carcinogénese gástrica [19, 20]. Embora os estudos anteriores mostraram que OLFM4 está envolvido no crescimento e apoptose de tumor, observações recentes também sugerem que os efeitos de células ou de tecidos específicos pode existir para o gene OLFM4. Relativamente pouco se sabe sobre o crescimento do tumor e apoptose subjacente expressão OLFM4 específico do cancro gástrico. Para obter uma melhor compreensão do presente papel para o OLFM4 alterada no cancro gástrico humano, é necessário um suporte experimental para validar o papel do gene OLFM4 no cancro gástrico.
Tem sido demonstrado que a expressão anormal de hGC-1 pode ser regulada ao nível da transcrição ou pós-transcricional [13]. Em nossas obras atuais, investigamos diretamente OLFM4 padrão de expressão de proteína em células cancerosas gástricas e GES-1 células normais. células MKN45 SGC-7901 e expressando altos níveis de OLFM4 relativos foram escolhidos para este estudo. Uma vez que a redução da expressão do gene alvo por meios genéticos em linhas celulares estabelecidas, é útil para uma melhor compreensão do seu papel na manutenção do fenótipo maligno particularmente na análise de genes que são essenciais para a sobrevivência celular [21], que gerado pools de clones estáveis ​​de SGC-7901 e MKN45 expressar OLFM4-siRNA ou controlo HK mexidos pela abordagem siRNA à base de plasmídeo e confirmou a eficiência do knock-down do gene OLFM4 no mRNA e os níveis de proteína por qRT-PCR e western blot.
Nossos trabalhos atuais demonstram que OLFM4 desempenha um papel essencial na tumorigênese câncer gástrico. Knockdown de OLFM4 inibe a proliferação celular e capacidade de crescimento independente de ancoragem in vitro. modelo de tumor de xenoenxerto in vivo implica também que a diminuição da OLFM4 pode inibir o crescimento do tumor de células de cancro gástrico humano. Estes resultados indicam que OLFM4 desempenha um papel fundamental na proliferação celular de células de cancro gástrico. Os nossos resultados também observado que knock-down de OLFM4 não influenciou a taxa de apoptose da caspase-3 e 9 e activações em OLFM4 knockdown células, sugerindo que a apoptose pode não ser o mecanismo subjacente à inibição do crescimento do tumor. Assim, postulamos que a expressão OLFM4 não é essencial para a sobrevivência de células de cancro, o que está de acordo com uma observação recente de que ratinhos knock-out genéticos para OLFM4 mostrar o desenvolvimento normal e fenótipos hematopoiéticas [17]. Para caracterizar ainda mais o mecanismo subjacente a inibição do crescimento, foi realizada a análise do ciclo celular e demonstrou que a inibição da expressão OLFM4 induzida células de cancro gástrico para se acumulam em fase G1 do ciclo celular, o que sugere que OLFM4 regulada para baixo pode exercer um efeito inibidor sobre o crescimento de células por uma progressão do ciclo celular mecanismo de regulação não envolve a apoptose em células de cancro gástrico.
a resistência de células tumorais para a indução de apoptose é um dos principais factores responsáveis ​​pelo fracasso de muitas terapias anti-cancro convencionais que utilizam agentes anticancerígenos e radiação. Portanto, o controlo da apoptose em células cancerosas é de importância biológica e clínica crítica [22, 23]. A actividade anti-apoptótica é outra importante função do gene OLFM4 [2]. Em particular, H 2O apoptose celular 2-induzida foi atenuada por OLFM4 sobre-expressa numa linha celular de cancro da próstata [2]. Além disso, as células MKN45 foram mostraram capacidade de resistência a apoptose induzida por TNF α [24]. Tendo em conta estes resultados, os autores sugerem que knockdown de expressão OLFM4 pode melhorar H apoptose induzida por α 2 ou TNF 2O em células cancerosas gástricas. Aqui, mostramos que knock-down de OLFM4 melhorar eficazmente a apoptose celular em resposta a H 2O 2 ou TNF α estimulação em MKN45, bem como células SGC-7901, sugerindo o bloqueio OLFM4 podem aumentar a susceptibilidade do cancro gástrico células para a presença de H 2O 2 ou TNF α.
Como é bem conhecido que a caspase-3, uma molécula executivo chave da via apoptótica, desempenha um papel fundamental nos processos de apoptose numa variedade de células. Examinámos a activação de caspase-3 em OLFM4 knockdown e células de controlo HK na presença ou ausência de inibidor de caspases Z-VAD-fmk. Observou-se que o tratamento de H 2O 2 ou TNF significativamente sobre-regulada a actividade da caspase-3 em células de knockdown OLFM4 do que as células de controlo HK enquanto pré-tratamento com Z-VAD-fmk inverteu a actividade da caspase-3, bem como H 2O 2 ou TNF-α apoptose induzida. Os resultados indicam que o H apoptose induzida por α 2 ou TNF 2O em células knockdown OLFM4 é dependente da caspase-3. Com base nos dados actuais, é concebível que OLFM4-regulada permite que as células de cancro gástrico para resistir a indução de apoptose pela diminuição da susceptibilidade a fármacos anticancerígenos.
De facto, os antagonistas de OLFM4 têm sido relatados para inibir a proliferação de outros tipos de células de cancro, tais como células humanas PANC-1 de cancro pancreático [8] e células de pulmão humano Caner SBC-1 [9]. No entanto, os resultados também foram controversos observada. Diminuição OLFM4 ARNm inibir PANC-1 a proliferação das células por S /G2 de captura de fase M [8], que é diferente dos nossos resultados mostram o progresso fase G1 retardada no cancro gástrico. Alguns detalhes importantes (ou razões) poderia explicar esta discrepância. Em primeiro lugar, como estudos recentes sugeriram um papel célula ou tecido específico de OLFM4 (células de cancro gástrico e células de cancro do pâncreas) pode ser uma explicação para esta discrepância convincente. A, a expressão mais notável é OLFM4 a nível mRNA, mas não o nível de proteína em células PANC-1 foi medida com sucesso usando RT-PCR [8] Considerando que o mais recente relatório de Kim et al. mostrou que as células PANC-1 tem nenhuma expressão de ARNm OLFM4 [25], indicando o padrão de expressão e função do gene OLFM4 em células PANC-1 precisem de ser confirmados.
Apesar OLFM4 silenciamento foi demonstrado que um efeito inibitório sobre o crescimento de células e um diminuição da resistência a H 2O 2 ou TNF α tratamento em células de cancro gástrico, que não é eliminado que outros mecanismos podem também ser regulada por OLFM4 e contribui para a inibição do crescimento e a sinalização de controlo de apoptose, considerando a interferência da rede .

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