Depletion of OLFM4 Gens hemmt das Zellwachstum und erhöht die Sensibilisierung gegenüber Wasserstoffperoxid und Tumor-Nekrose-Faktor-alpha induzierten Apoptose bei Magenkrebs cells

Depletion von OLFM4 Gens hemmt das Zellwachstum und erhöht die Sensibilisierung gegenüber Wasserstoffperoxid und Tumor-Nekrose-Faktor-alpha induzierten Apoptose bei Magen Krebszellen
Zusammenfassung
Hintergrund
Menschliche Olfactomedin 4 (OLFM4) -Gen ein sezerniertes Glycoprotein ist häufiger als das anti-apoptotische Molekül GW112 bekannt. OLFM4 gefunden wird in vielen Arten von humanen Tumoren häufig hochreguliert zu sein, einschließlich Magenkrebs, und es wurde angenommen, dass bedeutende Rolle bei der Progression von Magenkrebs zu spielen. Obwohl die Funktion von OLFM4 hat sich in vielen Studien gezeigt worden ist, deuten neuere Beweise stark eine Zelle oder Gewebetyp-abhängige Rolle OLFM4 in Zellwachstum und Apoptose. Das Ziel dieser Studie ist es, die Rolle von Magenkrebs-spezifische Expression von OLFM4 in Zellwachstum und Apoptoseresistenz zu untersuchen.
Methoden
OLFM4 Expression durch RNA-Interferenz in SGC-7901 und MKN45 Zellen eliminiert wurde. Die Zellproliferation, verankerungsunabhängiges Wachstum, Zellzyklus und Apoptose wurden in vitro charakterisiert. Tumorigenität in vivo analysiert. Die Apoptose und Caspase-3-Aktivierung in Reaktion auf Wasserstoffperoxid (H 2 O 2) oder Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α) wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von Caspase-Inhibitor Z-VAD-fmk beurteilt.
Ergebnisse | Die Eliminierung von OLFM4 Protein, das durch RNA-Interferenz in SGC-7901 und MKN45 Zellen hemmt signifikant tumorigenicity sowohl in vitro als auch in vivo durch Induktion der Zelle G1-Arrest (alle P < 0,01). OLFM4 Knockdown nicht offensichtliche Zellapoptose auslösen, sondern erhöht H 2 O 2 oder TNF α-induzierte Apoptose und Caspase-3-Aktivität (alle P < 0,01). Behandlung von Z-VAD-fmk Caspase-3-Aktivität abgeschwächt, und umgekehrt erheblich die H 2 O 2 oder TNF α-induzierte Apoptose in OLFM4 Knockdown Zellen (alle P < 0,01).
Schlussfolgerung
Unsere Studie legt nahe, dass Erschöpfung der OLFM4 deutlich hemmt tumorigenicity des Magenkrebs SGC-7901 und MKN45 Zellen. OLFM4 Ausdruck Blockierung kann durch eine Erhöhung der Caspase-3-abhängige Apoptose Magenkrebszellen zu H 2 O 2 oder TNF-α-Behandlung zu sensibilisieren. Eine Strategie Kombination basiert auf OLFM4 Hemmung und Krebsmedikamente Behandlung therapeutisches Potenzial bei Intervention Magenkrebs kann liefern.
Schlüsselwörter Magenkrebs Olfactomedin 4 RNA-Interferenz Wachstum Zelle Apoptosis Widerstand Hintergrund
Menschliche OLFM4 (Olfactomedin 4, auch bekannt als hGC-1, GW112), die ursprünglich menschliche genannt nach G-CSF Stimulation von myeloiden Vorläuferzellen geklont [1], ist ein sekretiertes Glycoprotein häufiger als das anti-apoptotische Molekül GW112 bekannt [2, 3]. OLFM4 wird normalerweise in Knochenmark, Prostata, Dünndarm, Magen, Dickdarm und Bauchspeicheldrüse exprimiert [1, 4]. Anschließend erhöhte OLFM4 Spiegel wurden auch in der Kryptenepithel der entzündeten Darmschleimhaut von entzündlichen Darmerkrankungen [5] und in Magenbiopsien mit Helicobacter pylori infiziert gefunden [6, 7]. In jüngerer Zeit hat hochreguliert OLFM4 Expression in Lunge und Brust [8] beschrieben, Prostatahyperplasie [3], Magen- [3, 9] und Bauchspeicheldrüsenkrebs [8, 9] sowie in kolorektalen Adenomen [10-14].
Es wurde vorgeschlagen, dass OLFM4 in zellulären Prozess wie Apoptose und Tumorwachstum beteiligt ist [2]. Obwohl die zelluläre Funktion von OLFM4 ist untersucht worden, tun diese Ergebnisse nicht immer überein. Überexpression von OLFM4 wurde Proliferation menschlicher PC-3-Zellen Prostatakrebs gezeigt Maus Prostatatumor Vagabund-C1-Zellen das Wachstum in syngene C57 /BL6-Mäusen [2] zu erleichtern, sondern hemmen [15]. Darüber hinaus hochreguliert OLFM4 zeigte eine starke anti-apoptotische Aktivität in Maus lymphatischen Venen-Endothel SVEC Zellen und menschlichen Adenokarzinoms HeLa-Zellen [1, 2], während neuere Erkenntnisse vorgeschlagen, eine pro-apoptotische Wirkung von OLFM4 in menschlichen myeloischen Leukämie HL-60-Zellen [16 ]. Beweise aus diesen Studien stark darauf hin, dass die Rollen von OLFM4 in Zellwachstum und Apoptose Steuerung auf der Zell- oder Gewebetyp abhängig sein kann [10, 13-15]. Bisher wurde jedoch nur sehr begrenzte Daten, die Rolle der OLFM4 in das Zellwachstum über und Apoptose Profile von Magenkrebszellen veröffentlicht.
In der vorliegenden Studie untersuchten wir OLFM4 Protein-Expression in Magenkrebszellen und normalen menschlichen Magenepithelzellen GES-1-Zellen mittels Western Blot. Unter Verwendung von Plasmid-vermittelter short hairpin RNA (shRNA) hemmte wir OLFM4 Expression in der Magenkrebs-SGC-7901 und MKN45-Zellen die Zellproliferation, Zellzyklusphase zu beobachten, die Apoptose in vitro und dessen tumorigenen Kapazität in vivo zu beurteilen. Wir untersuchten auch die Apoptose und Caspase-3-Aktivierung als Antwort auf zytotoxische Mittel, wie H 2 O 2 oder TNF α in der Anwesenheit oder Abwesenheit von Caspase-Inhibitors Z-VAD-fmk zwischen OLFM4 Knockdown Zellen und HK Kontrollzellen Methoden. Bei
Zellkultur, Reagenzien und Mäuse
Die menschlichen Magenkrebszellen BGC-823, HGC-27, SGC-7901, MKN28, MKN45 und normalen menschlichen Magenepithelzellen GES-1-Zellen DMEM-Medium gehalten wurden (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS, Gibco BRL, USA), 100 U /ml Penicillin und 100 ug /ml Streptomycin. H 2 O 2 und TNF-α wurden von Sigma (St. Louis, MO) und Z-VAD-fmk wurde von Calbiochem (San Diego, CA) erworben erhalten. Balb /c-Nackt (nu /nu) Mäuse (4-6 Wochen alt, SPF Grad, 20 ± 3 g) wurden von Laboratory Animal Center der Chongqing medizinischen Universität (Chongqing, China) erworben. Alle Verfahren wurden nach den international anerkannten ethischen Richtlinien durchgeführt (NIH Publikation Nr. 85-23, überarbeitet 1985).
Plasmidkonstrukte und stabile Transfektion
shRNA-vermittelte RNAi-Plasmid (pGenesil 1,1-siOLFM4) und einer verschlüsselten Steuer Plasmid (pGenesil 1,1-HK) gebaut wurden, die endogene OLFM4 in SGC-7901 und MKN45 Zellen zu klopfen. Nach der Transfektion und Neomycin (G418) Auswahl, OLFM4 Knock-down-SGC-7901-siOLFM4, MKN45-siOLFM4 Zellen und verschlüsselten SGC-7901-HK, MKN45-HK-Zellen Kontrolle stabil erhalten wurden, bzw. (Details in den weiteren Datei 1 gezeigt: Ergänzende Daten).
RNA-Extraktion und quantitative RT-PCR (qRT-PCR)
Gesamt-RNA in verschiedenen Zellen oder Tumorxenografte wurde mit der Kit RNeasy Mini extrahiert (Qiagen, CA, USA), und wurde von der cDNA-Synthese gefolgt Verwendung der ReverTra Ace-α-Erststrang-cDNA-Synthesesystems (Toyobo, Osaka, Japan) als vorherigen beschrieben [17]. (: Ergänzende Daten Details in Zusatzdatei 1 gezeigt) Quantitative real-time PCR wurde als Fluoreszenzfarbstoff (Toyobo, Osaka, Japan) mit 7500 real-time PCR-System (Applied Biosystems) mit SYBR-Grün durchgeführt. Falten Sie Veränderungen in der Genexpression wurden mit dem "2 - DDCT" bestimmt. Methode [18]
Zellproliferationsassays in vitro und die Lebensfähigkeit der Zellen Messung
Zellproliferation und die Lebensfähigkeit der Zellen wurden unter Verwendung von Zellproliferation WST-1-Kit gemessen (Roche ) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Für die Zellproliferation wurden die Zellen in einer Dichte von 1 × 10 3 Zellen pro Well einer 96-Well-Platten ausgesät und für 5 Tage gezüchtet. Die optische Dichte (450 nm) Wert wurde mit der Mikroplatten-Reader (Tacan, Swasiland) pro Tag festgestellt. Jeder Assay wurde dreifach durchgeführt. Da für die Messung der Lebensfähigkeit der Zellen, Zellen (1 × 10 4 /Well) in 200 ul Medium in 96-Well-Platten ausgesät. Nach 12 h Inkubation, H 2 O 2 oder TNF-α wurde in angegebenen Konzentrationen behandelt. Relative Absorption wurde gemessen, wie in der Zellproliferation beschrieben.
Anchorage-unabhängiges Wachstum Test
Anchorage-unabhängiges Wachstum auf Weichagar wurde durchgeführt, um in vitro Klonogenizität reflektieren. Kurz gesagt, wurden in 0,3% Agar in DMEM-Zellen (5 × 10 2) von jeder Kolonie suspendiert und dann in 6-Well-Schalen auf verfestigtem Agar (0,5%) überzogen. Die Zellen wurden bei 37 ° C in 5% CO 2 Wochen inkubiert 2, bevor die Kolonien gemessen. Anzahl der Kolonien wurde für fünf Zufallsfelder bei 200-facher Vergrößerung gezählt. Jeder Test in dreifacher Ausführung durchgeführt wurde.
Zytometrie Analyse Ströme
Durchflusszytometrie (FCM) Analyse wurde durchgeführt, der Zellzyklusprogression oder Apoptose zu bewerten.
Caspase Assay
Die enzymatische Aktivität von Caspase-3 und -9 wurde unter Verwendung eines fluorometrischen Assay unter Verwendung von nach einem zuvor beschriebenen Verfahren [8]
Western-Blot-Analyse: (Ergänzende Daten Details in Zusatzdatei 1 gezeigt).
Western-Blotting wurde wie früher beschrieben durchgeführt [17]. Die folgenden Antikörper wurden für Western-Blot verwendet: anti-OLFM4 (Abcam, Cambridge, UK) und Anti-β-Aktin (Santa Cruz, CA, USA) Die relative Menge von Proteinen wurde mit Menge analysiert One Software (Bio-Rad, Hercules , CA, USA) und normiert auf die von β-Aktin (Details in den weiteren Datei angezeigt. 1: Ergänzende Daten)
Xenograft-Tumormodell
Fourty Nacktmäuse wurden in vier Gruppen randomisiert aufgeteilt. Jede Gruppe wurde subkutan in den Rücken mit der Suspension von 200 &mgr; l, die 2 × 10 injiziert 6 Zellen oben erwähnt sind. Das Volumen von Xenotransplantaten wurde seriell gemessen. Die Mäuse wurden nach 35 Tagen getötet. Die Xenotransplantate wurden ausgeschnitten und gewogen. Hemmungsrate (%) = 1-mittlere Gewicht (OLFM4 knock down-Zellen injizierten Gruppe oder HK Kontrollzellen injizierten Gruppe) /mittlere Gewicht (HK Kontrollzellen injizierten Gruppe) ×: Die Hemmung Raten von Xenotransplantaten wurden nach der folgenden Formel berechnet 100%. Dann wurde das Tumorgewebe unterliegt Gesamt-RNA Isolation oder Immunhistochemie Erkennung.
Immunhistochemie (IHC)
OLFM4 Proteine ​​in Tumorxenografte von IHC analysiert wurden unter Verwendung von Kaninchen-anti OLFM4 (Abcam, Cambridge, UK) (Details gezeigt in Weitere Datei. 1: Ergänzende Daten) Statistik
Daten aus unabhängigen Experimenten wurden als Mittelwert ± SD ausgedrückt von mindestens drei Experimenten. Vergleiche zwischen den Gruppen wurden durch zweiseitigen Student t
-test oder ANOVA, entsprechend analysiert, und p-Werte < 0,05 wurden als statistisch signifikant.
Ergebnisse Efficient knock down von OLFM4 Gens durch Plasmid-vermittelte siRNA in Magenkrebszellen
OLFM4 Proteinexpressionsmuster bei Magenkrebs BGC-823, HGC-27, wurde untersucht
SGC-7901, MKN28, MKN45 Zellen und normalen GES-1 Kontrollzellen (Abbildung 1A). OLFM4 Protein exprimiert definitiv in all diesen Magenkrebszellen und GES-1-Zellen. Magenkrebszellen und GES-1-Zellen, insbesondere SGC-7901 und MKN45 Zellen als andere relativ hohen Niveau OLFM4 Protein exprimiert. Daher SGC-7901 und MKN45 Zellen wurden für weitere Untersuchungen ausgewählt. Abbildung 1 Effiziente Knockdown von OLFM4 durch RNA-Interferenz bei Magenkrebs SGC-7901 und MKN45 Zellen. A. Expression von OLFM4 Protein in verschiedenen Magenkrebs-Zelllinien. Expressionsprofil von OLFM4 Protein wurde unter Verwendung von Western-Blotting mit β-Aktin als interne Kontrolle analysiert. GES-1-Zellen wurden als normale Kontrollzellen dienten. B. OLFM4 mRNA-Expression in OLFM4 Knockdown Zellen. Relative Expression von OLFM4 wurde durch qRT-PCR nachgewiesen. β-Actin wurde als interne Kontrolle verwendet. Falten Sie Änderungen in OLFM4 mRNA-Expression wurden nach der Methode 2-ΔΔCt bestimmt. C. OLFM4 Proteinexpression in OLFM4 Knockdown Zellen. OLFM4 Protein-Expression wurde durch Western-Blot nachgewiesen. ß-Aktin-Protein wurde als interne Kontrolle verwendet. Vertreter von drei Experimenten gezeigt. ** P < 0,01 vs. HK Kontrollzellen-Gruppe (n = 3).
Um OLFM4 Ausdruck, ein Plasmid-vermittelte shRNA Targeting OLFM4 Gen konstruiert wurde herunterregulieren stabil OLFM4 Ausdruck in SGC-7901 und MKN45 Zellen zu klopfen. Wie in 1B gezeigt, wurden OLFM4 mRNA-Spiegel in SGC-7901-siOLFM4 und MKN45-siOLFM4 Zellen im Vergleich zu ihren HK Kontrolle oder parentalen Zellen (; 0,01 P <) signifikant reduziert. Diese Ergebnisse wurden durch Western-Blot-Analyse (Abbildung 1C) bestätigt. Kein signifikanter Unterschied in OLFM4 Expression wurde zwischen Eltern- und HK Kontrollzellen beobachtet. Die Gehalte an mRNA und Protein für die β-Actin wurden unter den verschiedenen Gruppen ähnlich. Diese Ergebnisse legen nahe, dass ein Plasmid-vermittelte OLFM4-siRNA gezielt und effizient knock down OLFM4 Ebene in Magenkrebszellen. Da oben erwähnt die Analyse daher OLFM4 Zellen und HK Kontrollzellen niederschlagen wurden für die weitere Untersuchung ausgewählt.
OLFM4 Knockdown Magenkrebs-Zellproliferation und Verankerung-unabhängiges Wachstum in vitro
hemmt die Rolle der OLFM4 im Magen Um zu bestimmen, Krebszellenwachstum untersuchten wir die Wirkung von OLFM4-siRNA auf das Zellwachstum in 1-5 Tageszeitpunkt von WST-1-Assay. Wie in 2A gezeigt, Zellen in allen zwei Magenkrebs-Zelllinien, die das Wachstum von OLFM4 knock down wurde deutlich reduziert im Vergleich zu HK Kontrollzellen von Tag 3 (P < 0,01). Um die Bedeutung von OLFM4 in der Tumorentstehung von Magenkrebszellen in vitro zu untersuchen, führten wir verankerungsunabhängigen Wachstumstests und fand SGC-7901 und MKN45-Zellen, die HK Kontrollen wuchsen gut in weichem Agar, bilden verschiedene Kolonien. Im Gegensatz dazu OLFM4 Knockdown SGC-7901 und ausgestellt MKN45-Zellen eine dramatische Reduktion in der Anzahl von Soft-Agar Kolonien (P < 0,01) (Figur 2B), zeigt Fähigkeiten weniger als die der Kontrollzellen transformieren. Diese Daten zeigten, dass Knock-down von OLFM4 könnte Magenkrebszellproliferation und verankerungsunabhängiges Wachstum in vitro zu hemmen. Figur 2 Zuschlags von OLFM4 hemmt das Wachstum von SGC-7901 und MKN45-Zellen in vitro und in vivo. A. Zellwachstumskurve. Zellproliferation in vitro durch Zellwachstumskurve bewertet, wie durch Zählen der Zellzahl (WST-1-Assay) in der SGC-7901-Zellen (links) und MKN45-Zellen (rechtes Feld) bestimmt. Der OD-Wert (450 nm) wurde an den angegebenen Tagen gezählt und als mittlere Zellzahlen dargestellt (n = 3). B. Anchorage-unabhängiges Wachstum in Soft-Agar. Repräsentative Bilder von drei Experimenten wurde gezeigt (oben). Die Daten repräsentieren die mittlere Anzahl von Kolonien bei 200 facher Vergrößerung für 5 Zufallsfeldern (unteres Feld) gezählt. C. Die mittlere Tumorvolumen nach subkutaner Injektion von Nacktmäusen mit HK-Steuerung oder OLFM4 Knockdown Zellen zu den angegebenen Zeitpunkten gemessen. D. Repräsentative Tumoren Bilder bei 35 Tage nach der subkutanen Injektion von Zellen angegeben. E. mittlere Tumorgewicht (linkes Bild) und Hemmungsrate (rechts) in Tumorxenografte. Die Daten repräsentieren die mittlere Tumorgewicht von Xenotransplantaten (Mittelwert ± SD, n = 10). ** P < 0,01 vs. HK Kontrollgruppe.
Wachstumshemmende Wirkung von OLFM4 in Magentumor-Xenotransplantaten verringert
Außerdem führten wir auch subkutanen Tumor prägenden Assay in Nacktmäusen das Wachstum Unterdrückungseffekt von herunterreguliert OLFM4 in vivo zu bewerten. Nacktmäuse wurden subkutan mit OLFM4 Knockdown oder HK Kontrollzellen injiziert. Die Tumorvolumina pro 4 Tage und Tumorgewicht nach 5 Wochen wurden jeweils gemessen nach subkutaner Injektion. Wie in 2C-D gezeigt, ob das Tumorvolumen oder Tumorgewicht von OLFM4 produziert knock down SGC-7901 und MKN45 Zellen hatten bei Mäusen mit HK Kontrolle transfizierten Zellen injiziert produziert das Wachstum erheblich reduziert im Vergleich zu Tumoren (P < 0,01). Die Hemmungsrate von SGC-7901 und MKN45 knock down Zellen injizierten Gruppe auf das Tumorwachstum war 40,29% und 37,48% bzw. (Abbildung 2E).
Weitere OLFM4 Ausdruck Um sicherzustellen, indeedly nach subkutaner Injektion von Nacktmäusen zum Schweigen gebracht wird, auch wir ausgewertet OLFM4 Ausdruck in Tumorxenografte qRT-PCR und IHC verwenden. Ähnlich ist es in vitro, OLFM4 mRNA-Ebene in Tumor durch OLFM4 Knockdown Zellen produziert Xenotransplantate zeigte auch eine signifikante Abnahme im Vergleich zu HK Kontrolltumoren Xenotransplantaten (P < 0,01) (3A). (3B und 3C) in Übereinstimmung mit den Ergebnissen der qRT-PCR, signifikante Reduktion der OLFM4 Protein wurde auch in Tumor-Xenotransplantaten von IHC (0,01 P <) beobachtet. Höhere Graustufen und stärker positives Signal von DAB Visualisierung wurden in Tumorxenografte von HK Kontrollzellen injizierten Gruppe gefunden. Im Gegenteil, schwach braune Färbung wurde in Tumor-Xenotransplantaten von OLFM4 Knockdown Zellen-injizierten Gruppe beobachtet. Darüber hinaus mehr große Nekrose-Region wurde in Tumorxenografte produziert von HK Kontrollzellen aufgrund eines schnellen Wachstums von HK Kontrollzellen (3B oben) beobachtet. Diese Daten, die eine starke Anzeige bereitgestellt, welche die Expression OLFM4 an mRNA und Protein-Ebene stabil inhibiert tatsächlich in vivo. Genommen kollektiv sowohl in vitro und in vivo Experimente legen nahe, dass OLFM4 Knockdown das Wachstum von Magenkrebszellen hemmt. Abbildung 3 qRT-PCR und IHC Nachweis von OLFM4 in Tumorxenografte. A. qRT-PCR für OLFM4 mRNA in Tumorxenografte. Falten Sie Änderungen in OLFM4 mRNA wurden nach der Methode 2-ΔΔCt bestimmt. ß-Aktin-Gen wurde als interne Kontrolle verwendet. B. H & E-Färbung (oberes Feld) und IHC für OLFM4 Protein (unteres Bild) in Tumorxenografte. Repräsentative Bilder (200 ×) gezeigt. N, Nekrosen. C. Quantifizierung Analyse von OLFM4 Ausdruck. Der Mittelwert aus fünf zufällig verschiedenen Bereichen unter dem Mikroskop (400 ×) unter Verwendung des Image-Pro PLUS V6.0 gemessen. Die Daten wurden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. ** P < 0,01 vs. HK Kontrollgruppe.
OLFM4 zu S-Übergang Verzögerungen G1 Knock-down, aber nicht offensichtlich, Apoptose bei Magenkrebszellen auslösen
unsere beobachtete hemmende Wirkung auf das Zellwachstum in vitro und in vivo gegeben, haben wir versucht, um zu bestimmen, ob verstärkte Apoptose oder verzögerte Progression des Zellzyklus wurde mit Wachstumshemmung verbunden. Wir untersuchten zunächst die Wirkung der verminderten OLFM4 auf den Zellzyklus. Wie in 4A gezeigt ist, zeigten beide OLFM4 Knockdown SGC-7901 und MKN45-Zellen signifikant erhöhte Zahlen in der G1-Phase und verringerte Zahlen in Phase S, im Gegensatz zu ihren HK Kontrollzellen (P < 0,01). Keine signifikanten Unterschiede wurden in der G2 /M-Phase beobachtet, eine typische Verzögerung G1 des Zellzyklus hindeutet. Abbildung 4 Beurteilung der Zellzyklus-Verteilung, apoptotischen Zellen und Caspase-09.03 Aktivierung in OLFM4 klopfen Magenkrebszellen nach unten. A. Zellzyklus-Analyse. Änderungen in der Zellzyklus-Verteilung von SGC-7901-HK, SGC-7901-siOLFM4 und MKN45-HK, MKN45-siOLFM4 Zellen wurden durch FCM analysiert. Die Daten stellen den Mittelwert Prozentsatz der Zellzyklus-Phasenverteilung (n = 3). B. Zell-Apoptose-Analyse. Die Apoptose wurde mit AnnexinV-PE /7-AAD-Färbung von FCM geschätzt. Die Daten stellen den Mittelwert apoptotischen Zellanteil (n = 3). C. Caspase-3 und -9 Aktivierungen. Caspase-3, 9-Aktivierungen zwischen angegeben Zellen gezeigt. ** P < 0,01 vs. Kontrollgruppe HK.
Um festzustellen, ob die Apoptose in diesem Wachstumshemmung beteiligt ist, führten wir neben Zell-Apoptose-Analyse. Interessanterweise konnte reduziert OLFM4 Ausdruck nicht in signifikanten Veränderungen in der Apoptose (4B) zur Folge haben, die mit dem Zellzyklus-Analyse konsistent ist keine offensichtliche Unter G1-Phase in den getesteten Zellen zeigt. Um weitere Veränderungen der apoptotischen Signalen untersuchen, Caspase-3 /-9-Aktivität wurde auch durch kolorimetrische Aktivierungsassays identifiziert. Sowohl Caspase-3 und -9 Aktivierungen zeigten keine signifikanten Veränderungen nach der Zuschlags OLFM4 in SGC-7901 und MKN45-Zellen (4C). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Herabregulierung von OLFM4 kann durch Regulieren der Zellzyklusprogression beteiligt nicht Apoptose bei Magenkrebszellen.
Deletion von OLFM4 sensitiviert Magenkrebszellen H2O2 oder TNF α-induzierte Apoptose
die deutliche Wirkung von H 2 O 2 oder TNF-α auf die Apoptose zwischen OLFM4 knock down und Kontrollzellen HK wurde ebenfalls untersucht. OLFM4 abreißen oder Kontrollzellen HK wurden mit 10, 100 und 1000 uM H 2 O 2 oder 5, 10 und 50 ng /ml TNF α bzw. behandelt. Die Lebensfähigkeit der Zellen und Apoptose wurden bewertet. Wie in 5A-D gezeigt, wird eine dosisabhängige Abnahme in der Lebensfähigkeit der Zellen wurde in H 2 O 2 oder TNF α-behandelten beobachtet OLFM4 unten Zellen klopfen. Weiterhin Behandlung von 10 uM H 2 O 2 (5A-B) oder 10 ng /ml TNF α (5C-D) führte zu einer signifikanten Verringerung der Lebensfähigkeit der Zellen in OLFM4 knock down-Zellen im Vergleich mit HK Kontrollzellen (P < 0,01). Von besonderem Interesse ist die Erkenntnis, dass mit 10 ~ 1000 um H 2 O behandelt Knockdown Zellen statt HK Kontrollzellen OLFM4 2 weitere prominente apoptotischen Prozent im Vergleich zu denen mit PBS mock (P < 0,01) behandelt ausgestellt ( 5A-B). Ähnliche Ergebnisse wurden auch in TNF α behandelten OLFM4 Knockdown Zellen (5C-D) gesehen. Mit anderen Worten, OLFM4 verbesserte H 2 O 2 oder TNF-α-induzierte Apoptose in Magenkrebszellen niederschlagen, was darauf hinweist Löschung von OLFM4 gemacht SGC-7901 und MKN45 Zellen empfindlicher auf die Behandlung von H 2O 2 oder TNF-α. Abbildung 5 Reaktion von OLFM4 SGC-7901-Knockdown und MKN45 Zellen zur Apoptose-induzierende Mittel H 2 O 2 oder TNF-α. OLFM4 Knockdown und HK-Kontrollzellen wurden für 12 h mit H2O2 (A und B) oder TNF α (C und D), wie angegeben Dosen behandelt. Die Lebensfähigkeit der Zellen von WST-1-Test (A-D linken Panels) und ausgedrückt in der mittleren OD-Wert (450 nm) (n = 3) gemessen. Der Prozentsatz der apoptotischen Zellen wurde durch FCM (A-D rechte Felder) und ausgedrückt in der apoptotischen Prozentsatz bedeuten bestimmt (n = 3). * P < 0,05, ** P < 0,01 vs. HK Kontrollgruppe.
Caspase-3-Aktivität in H2O2 oder TNF-α-induzierte Apoptose in OLFM4 beteiligt Knock-down-Zellen
Die obigen Ergebnisse zeigten, dass knock down von OLFM4 konnte H 2O erhöhen 2 oder TNF-α-stimulierte Apoptose. Weiter zu verifizieren, ob Caspase-3 in dem H 2 O aktiviert 2 oder TNF α-induzierte Apoptose in OLFM4 Knockdown Zellen wir Caspase-3-Aktivierung in H 2 O 2 oder TNF nächsten erkannten a-behandelten Zellen kolorimetrischen Assay. Wie in 6A, die Behandlung von H gezeigt 2 O 2 oder TNF α resultierte in viel Verbesserung der Caspase-3-Aktivität in OLFM4 Zuschlagszellen als Kontrollzellen HK (P < 0,01), was darauf hindeutet, Caspase-3-Aktivität wird in der H 2 O 2 oder TNF-α-induzierte Apoptose in OLFM4 Knockdown Zellen beteiligt. Um festzustellen, ob H 2 O 2 oder TNF-α-induzierte Apoptose ist abhängig von Caspase-3-Aktivität, Z-VAD-fmk, ein Caspase-Inhibitor vor der Behandlung von H verwendet wurde 2 O 2 oder TNF-α. (6C-D; Vorbehandlung von Z-VAD-fmk signifikant H 2 O 2 oder TNF α-induzierte Zellapoptose sowie Caspase-3-Aktivität in beiden OLFM4 Knockdown-Zellen (0,01 P <) abgeschwächt ), was darauf hinweist, dass H 2 O 2 oder TNF-α-induzierte Apoptose in OLFM4 Knockdown Zellen Caspase-3 abhängig ist. Abbildung 6 Involvement der Caspase-3-Aktivität in H 2 O 2 oder TNF-α-induzierte Apoptose in OLFM4 Knockdown SGC-7901 und MKN45-Zellen. (A-B) Erhöhte Caspase-3-Aktivität in H2O2 oder TNF α-behandelten OLFM4 Knockdown Zellen. OLFM4 Zuschlags und HK-Kontrollzellen wurden mit 10 &mgr; M H2O2 (A) behandelte oder 10 ng /ml TNF α (B) für 12 h. Caspase-3-Aktivität wurde unter Verwendung von farbmetrischen Assays und ausgedrückt in fache Veränderungen gemessen. ** P < 0,01 im Vergleich zu PBS Mock-Gruppe (n = 3). (C-D) Reversed-Zell-Apoptose durch Caspase-Inhibitor in OLFM4 Knockdown Zellen. Die Zellen wurden mit H2O2 oder TNF-α allein mit den angegebenen Dosierungen behandelt, wie oben mit 20 &mgr; M Z-VAD-fmk 2 h vor H2O2 oder TNF-α Behandlung erwähnt oder vorbehandelt. Der Prozentsatz an apoptotischen Zellen wurde durch FCM bestimmt. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD von drei unabhängigen Experimenten. ** P < 0,01 vs. H2O2 (C) oder TNF-α (D) -behandelten OLFM4 Gruppe Knockdown-Zellen.
Diskussion
Kürzlich akkumulieren Daten OLFM4 demonstriert häufig in vielen Arten von menschlichen Tumoren einschließlich Magenkrebs überexprimiert wird, und es wurde angenommen, spielen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung und Progression von Magen-Karzinogenese [19, 20]. Obwohl frühere Studien haben gezeigt, dass OLFM4 bei der Apoptose und Tumorwachstum beteiligt ist, legen neuere Beobachtungen auch, dass Zell- oder gewebespezifische Effekte für das OLFM4 Gen vorliegen kann. Relativ wenig ist in Bezug auf die Tumorwachstum und Apoptose zugrunde liegenden Magen-Krebs-spezifische OLFM4 Ausdruck bekannt. Um ein besseres Verständnis dieser Rolle für die veränderte OLFM4 in menschlichen Magenkrebs zu gewinnen, ist experimentelle Unterstützung erforderlich, um die Rolle des OLFM4 Gens bei Magenkrebs zu validieren. Und starten Sie, dass abnormale Expression von HGC-1 gezeigt, kann geregelt werden auf der Transkriptions oder posttranskritionelle Ebene [13]. In unserer gegenwärtigen Arbeiten untersuchten wir Expressionsmuster direkt OLFM4 Protein in Magenkrebszellen und normalen GES-1-Zellen. SGC-7901 und MKN45-Zellen, die relativ hohe OLFM4 Spiegel wurden für diese Studie ausgewählt. Da die Verringerung der Expression des Zielgens durch genetische Mittel in etablierten Zelllinien ist hilfreich für ein besseres Verständnis ihrer Rolle in den malignen Phänotyp Aufrechterhaltung besonders in den Genen zu analysieren, die für die zelluläre Überleben essentiell sind [21], haben wir einen stabilen Clone-Pools von SGC-7901 und MKN45 exprimieren OLFM4-siRNA oder verschlüsselt HK Kontrolle durch das Plasmid-basierte siRNA Ansatz und bestätigt Knock-down-Effizienz von OLFM4 Gens auf mRNA und Protein-Ebene durch qRT-PCR und Western Blot.
Unsere präsentieren Werke zeigen, dass OLFM4 spielt eine wesentliche Rolle bei Magenkrebs Tumorentstehung. Preissturz von OLFM4 hemmt die Zellproliferation und verankerungsunabhängigen Wachstumsfähigkeit in vitro. Xenograft-Tumormodell in vivo bedeutet auch, dass OLFM4 verringerte sich das Tumorwachstum von menschlichen Magenkrebszellen hemmen kann. Diese Ergebnisse zeigen, dass OLFM4 spielt eine entscheidende Rolle bei der Zellproliferation von Magenkrebszellen. Unsere Ergebnisse auch beobachtet, dass Knock-down von OLFM4 nicht die Rate der Apoptose und Caspase-3 und 9 Aktivierungen in OLFM4 Knockdown-Zellen nicht beeinflusste, was nahe legt, dass die Apoptose nicht der Mechanismus, um die Hemmung des Tumorwachstums sein könnte zugrunde liegen. So postulieren wir, dass OLFM4 Ausdruck für Überleben von Krebszellen nicht wesentlich ist, die in Übereinstimmung mit einer aktuellen Beobachtung ist, dass genetisches Knock-out-Mäuse für OLFM4 zeigen normale Entwicklung und hämatopoetischen Phänotypen [17]. Um den Mechanismus zu charakterisieren Wachstumshemmung zugrundeliegenden, führten wir Zyklusanalysezelle und gezeigt, dass die Hemmung der OLFM4 Expression Magenkrebszellen induziert in G1-Phase des Zellzyklus zu akkumulieren, was darauf hindeutet, dass die nach unten reguliert OLFM4 können eine hemmende Wirkung auf das Zellwachstum ausüben, indem einen Mechanismus Regelzellzyklus nicht Apoptose bei Magenkrebszellen beteiligt sind.
Resistenz von Tumorzellen gegenüber der Induktion der Apoptose ist einer der wichtigsten Faktoren, die für das Scheitern vieler herkömmlichen Anti-Krebs-Therapien, die Mittel gegen Krebs und Strahlung verwenden. Daher ist die Kontrolle der Apoptose in Krebszellen von kritischen biologischen und klinischen Bedeutung [22, 23]. Anti-apoptotische Aktivität ist eine weitere wichtige Funktion des Gens OLFM4 [2]. Insbesondere H 2 O 2-induzierte zelluläre Apoptose wurde durch überexprimiert OLFM4 in einer Prostata-Krebszelllinie abgeschwächt [2]. Außerdem wurden MKN45-Zellen die Fähigkeit der Resistenz gegen TNF α-induzierte Apoptose [24] gezeigt. In Anbetracht dieser Ergebnisse die Hypothese auf, dass wir Zuschlags von OLFM4 Ausdruck könnte H 2 O 2 oder TNF-α-induzierte Apoptose in Magenkrebszellen verbessern. Hier haben wir gezeigt, dass die Knock-down von OLFM4 wirksam verbessert Zell-Apoptose in Reaktion auf H 2 O 2 oder TNF-α Stimulation in MKN45 sowie SGC-7901-Zellen, was darauf hindeutet, OLFM4 Blockierung kann die Anfälligkeit von Magenkrebs erhöhen Zellen auf die Anwesenheit von H 2 O 2 oder TNF α.
Wie allgemein bekannt ist, dass Caspase-3, ein wichtiger Executive Molekül des apoptotischen Weg, eine kritische Rolle bei apoptotischen Prozessen in einer Vielzahl spielt der Zellen. Wir untersuchten ferner die Caspase-3-Aktivierung in OLFM4 Knockdown und HK Kontrollzellen in Gegenwart oder Abwesenheit von Caspase-Inhibitors Z-VAD-fmk. Wir beobachteten, dass die Behandlung von H 2 O 2 oder TNF &agr; signifikant hochreguliert Caspase-3-Aktivität in OLFM4 Zuschlagszellen als Kontrollzellen HK, während die Vorbehandlung mit Z-VAD-fmk umgekehrt Caspase-3-Aktivität als auch wie H 2 O 2 oder TNF-α-induzierte Apoptose. Die Ergebnisse zeigen, daß H 2 O 2 oder TNF α-induzierte Apoptose in OLFM4 Knockdown Zellen ist Caspase-3 abhängig. Auf der Grundlage der vorliegenden Daten ist es denkbar, dass hochreguliert OLFM4 Magenkrebszellen ermöglicht Apoptoseinduktion zu widerstehen, indem die Empfindlichkeit abnimmt Medikamente gegen Krebs.
Tatsächlich Antagonisten von OLFM4 berichtet worden, die Verbreitung in andere Arten von zu hemmen Krebszellen wie menschliche Bauchspeicheldrüsenkrebs PANC-1-Zellen [8] und menschliche Lungen caner SBC-1-Zellen [9]. Jedoch haben kontroverse Ergebnisse ebenfalls beobachtet. Verminderte OLFM4 mRNA Zellen PANC-1-Proliferation durch S G2 /M-Phase Verhaftung [8], hemmen, die aus unseren Ergebnissen unterscheidet verzögert G1 Phase Fortschritte bei Magenkrebs zeigt. Einige wichtige Details (oder Gründe) könnte diese Diskrepanz erklären. Zunächst wird, wie neuere Studien vorgeschlagen, eine Zelle oder ein Gewebe spezifische Rolle von OLFM4 (Magenkrebszellen und Pankreaskrebszellen) kann eine überzeugende Erklärung für diese Diskrepanz sein. Die bemerkenswerteste ist, auf mRNA-Ebene OLFM4 Ausdruck, aber nicht Protein-Ebene in PANC-1-Zellen wurde erfolgreich RT-PCR [8], während der jüngste Bericht von Kim et al gemessen. das Expressionsmuster und die Rolle der OLFM4 Gens in PANC-1-Zellen zeigte, dass PANC-1-Zellen keine OLFM4 mRNA expression [25] hat, müssen weitere Bestätigung anzeigt.
Trotz OLFM4 silencing auf eine hemmende Wirkung auf das Zellwachstum gezeigt wurde und eine verringerte Beständigkeit gegen H 2 O 2 oder TNF α-Behandlung in Zellen Magenkrebs, ist es nicht ausgeschlossen, dass auch andere Mechanismen durch OLFM4 geregelt werden können, und trägt zur Wachstumshemmung und Apoptose Steuersignalisierung, des Übersprechens des Netzes unter Berücksichtigung .

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