Истощение гена OLFM4 ингибирует рост клеток и повышает чувствительность к перекиси водорода и фактор некроза опухоли-альфа наведенного апоптоза в желудочном cells

рака Истощение гена OLFM4 ингибирует рост клеток и повышает чувствительность к перекиси водорода и фактор некроза опухоли-альфа наведенного апоптоза в желудочном раковые клетки
Аннотация
фон
Human olfactomedin 4 (OLFM4) ген представляет собой секретируемый гликопротеин более широко известный как антиапоптической молекулы GW112. OLFM4 оказывается часто повышающей регуляции во многих типах опухолей человека, включая рак желудка, и это, как полагают, играют значительную роль в прогрессии рака желудка. Хотя функция OLFM4 было показано во многих исследованиях, последние данные убедительно указывает на клетки или ткани типа зависящих от роли OLFM4 роста клеток и апоптоз. Целью данного исследования является изучение роли желудка канцер-специфической экспрессии в OLFM4 клеточного роста и устойчивости к апоптозу.
Методы
OLFM4 выражение было устранено РНК-интерференции в SGC-7901 и клетках MKN45. Пролиферация клеток, Anchorage независимый рост, клеточного цикла и апоптоза были охарактеризованы в пробирке. Туморогенность анализировали в естественных условиях. Апоптоз и активность каспазы-3 активации в ответ на перекиси водорода (Н <суб> 2O <суб> 2) или фактор некроза опухоли-альфа (TNF-α), оценивали в присутствии или в отсутствие ингибитора каспазы Z-VAD-финляндских марок.
Результаты
ликвидации белка OLFM4 путем РНК-интерференции в SGC-7901 и клетках MKN45 значительно ингибирует онкогенность как в пробирке и в естественных условиях путем индукции клеточного G1 (ареста всех P &лт; 0,01). OLFM4 нокдаун не вызывали явный апоптоз клеток, но увеличилась H <к югу> 2О <суб> 2 или TNF α-индуцированного апоптоза и активность каспазы-3 (все Р &л; 0,01). Лечение Z-VAD-финляндских марок ослабляется активность каспазы-3 и значительно перевернул H <суб> 2О <суб> 2 или TNF α-индуцированного апоптоза в клетках бросовым OLFM4 (все P &лт; 0,01).
Заключение
Наше исследование показывает, что истощение OLFM4 значительно ингибирует онкогенность рака желудка SGC-7901 и клеток MKN45. Блокирование OLFM4 выражение может повышать чувствительность клеток рака желудка Н <югу> 2О <суб> 2 или TNF α лечения путем увеличения каспазы-3 зависимого апоптоза. Стратегия основана на комбинации OLFM4 ингибирующая и противораковые препараты могут оказывать терапевтический потенциал в желудочном вмешательства рака.
Ключевые слова
Желудочный рак Olfactomedin 4 РНК роста интерференция апоптозом клеток Resistance фона
Human OLFM4 (olfactomedin 4, также известный как ТЖК-1, GW112), первоначально названо человеческим клонированный из миелоидных клеток-предшественников после того, как гранулоцитарный колониестимулирующий фактор стимуляции [1], является секретируемый гликопротеин более широко известный как антиапоптозный молекулы GW112 [2, 3]. OLFM4 обычно выражается в костном мозге, предстательной железы, тонкого кишечника, желудка, толстой кишки и поджелудочной железы [1, 4]. Впоследствии, увеличение OLFM4 уровни также были найдены в склепе эпителия воспаленной слизистой оболочки толстой кишки воспалительных заболеваний кишечника [5] и в желудочных биопсий, инфицированных Helicobacter Pylori [6, 7]. Совсем недавно, повышающей регуляции экспрессии OLFM4 было описано в легких и молочной железы [8], простатической [3], желудка [3, 9] и рак поджелудочной железы [8, 9], а также в колоректальных аденом [10-14].
было высказано предположение, что OLFM4 участвует в клеточном процессе, таких как апоптоз и опухолевого роста [2]. Хотя клеточная функция OLFM4 исследован, эти результаты не всегда совпадают. Сверхэкспрессия OLFM4 было показано, чтобы облегчить мыши опухоли простаты Бродяга-C1 роста клеток у сингенных мышей линии C57 /BL6 [2], но ингибируют рака простаты РС-3 пролиферации клеток человека [15]. Кроме того, до регулируемых OLFM4 показали сильную антиапоптозную активность у мышей лимфоидной вены эндотелиальных SVEC клеток и человеческой аденокарциномы HeLa клеток [1, 2], в то время как недавние исследования предложили проапоптотического эффект OLFM4 в миелоидной лейкемии HL-60 клеток человека [16 ]. Данные из этих исследований наводит на мысль, что роль OLFM4 в контроле клеточного роста и апоптоза может зависеть от клетки или ткани типа [10, 13-15]. На сегодняшний день, однако, очень ограниченные данные о роли OLFM4 в росте клеток и апоптоза профилей клеток рака желудка была опубликована.
В настоящем исследовании мы проанализировали экспрессию белка OLFM4 в желудочном раковых клеток и нормальных человеческих эпителиальных желудка GES-1 клеток с помощью вестерн-блоттинга. С помощью плазмиды-опосредованной короткой шпилька РНК (shRNA), мы тормозится OLFM4 выражение в рак желудка SGC-7901 и MKN45 клетки для наблюдения пролиферации клеток, фазы клеточного цикла, апоптоза в условиях in vitro и оценить его онкогенного потенциала в естественных условиях. Мы также исследовали апоптозу и каспазы-3 активации в ответ на цитотоксические агенты, такие как H <суб> 2O <суб> 2 или ФНО α в присутствии или в отсутствие ингибитора каспазы Z-VAD-финляндских марок между клетками нокдаун OLFM4 и контрольными клетками HK .
Методы
культуры клеток, реагенты и мыши
раковые клетки желудка человека BGC-823, ГГК-27, SGC-7901, MKN28, MKN45 и нормальные эпителиальные желудка человека ГЭС-1 клетки поддерживали DMEM среду (GibcoBRL, Gaithersburg, MD), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС, GibcoBRL, США), 100 ед /мл пенициллина и 100 мкг /мл стрептомицина. H <суб> 2О <суб> 2 и TNF-α были получены от Sigma (St. Louis, MO) и Z-VAD-FMK был приобретен у Calbiochem (San Diego, CA). ню (ню /ню) мышей BALB /C (4-6 недель, SPF степени, 20 ± 3 г) были приобретены у лабораторных животных Центра Чунцин медицинского университета (Чунцин, Китай). Все процедуры были проведены в соответствии с принятыми на международном уровне этических принципов (NIH публикация №. 85-23, пересмотренная в 1985 году).
Плазмидные конструкции и стабильной трансфекции
shRNA-опосредованной RNAi плазмиды (pGenesil 1,1-siOLFM4) и зашифрованным контроля плазмида (pGenesil 1,1-HK) были построены, чтобы сбить эндогенный OLFM4 в SGC-7901 и клетках MKN45. После трансфекции и неомицин (G418) отбора, OLFM4 нокдауна SGC-7901-siOLFM4, клетки MKN45-siOLFM4 и пополз SGC-7901-HK, контрольные клетки MKN45-HK стабильно получали, соответственно (подробности приведены в дополнительном файле 1: Дополнительное данные).
Выделение РНК и количественный оТ-ПЦР (QRT-ПЦР)
тотальную РНК в различных клетках или опухолевые ксенотрансплантаты экстрагировали с помощью набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, Калифорния, США), и затем синтеза кДНК используя ReverTra Ace-альфа-первой цепи синтеза кДНК системы (Toyobo, Осака, Япония), как описано предыдущая [17]. Количественная ПЦР в реальном времени осуществляли с использованием 7500 в режиме реального времени система PCR (Applied Biosystems) с SYBR-зеленый в качестве флуоресцентного красителя (Тоёбо, Осака, Япония) (детали, приведенные в дополнительном файле 1: Дополнительные данные). Откидные изменения в экспрессии генов определяли с использованием "2 - DDCT". Метод [18]
анализе пролиферации клеток в пробирке и жизнеспособность клеток измерения
пролиферации клеток и жизнеспособность клеток измеряли с использованием клеточной пролиферации WST-1 комплект (Roche ) в соответствии с инструкциями изготовителя. Для пролиферации клеток, клетки высевают при плотности 1 × 10 3 клеток на лунку 96-луночные планшеты и выращивали в течение 5 дней. Значение оптической плотности (450 нм) была обнаружена с использованием микропланшетов Reader (ТАКАН, Свазиленд) в день. Каждый анализ проводили в трех повторностях. Что касается измерения жизнеспособности клеток, клетки (1 × 10 4 /лунку) высевают в количестве 200 мкл среды в 96-луночных планшетах. После 12 ч инкубации, H <югу> 2О <суб> 2 или TNF α обрабатывали в указанных концентрациях. Относительная оптическая плотность измеряли, как описано в пролиферации клеток.
Анкоридж-независимый анализ роста
Анкоридж-независимый рост проводили на мягком агаре, чтобы отразить в пробирке clonogenicity. Вкратце, клетки (5 × 10 2) из ​​каждой колонии суспендировали в 0,3% агара в среде DMEM, а затем высевали на чашки с агаром затвердевшего (0,5%), в 6-луночных планшетах. Клетки инкубировали в течение 2-х недель при 37 ° С в атмосфере 5% СО <югу> 2 до того, как колонии измеряли. Количество колоний подсчитывали при 200-кратном увеличении на пять случайных полей. Каждый анализ проводили в трех повторностях.
Анализ проточной цитометрией
Проточная цитометрия (ТСМ) анализ был проведен с целью оценки прогрессирования клеточного цикла или апоптоз. (Подробности приведены в дополнительный файл 1: дополнительные данные)
каспазы анализ
ферментативную активность каспазы-3 и -9 измеряли с помощью флуорометрического анализа в соответствии с методом, описанным ранее [8]
Вестерн-блот-анализ.
Вестерн-блоттинг проводили, как описано ранее [17]. Следующие антитела были использованы для Вестерн-блоттинга: анти-OLFM4 (Abcam, Кембридж, Великобритания) и анти-β-актина (Santa Cruz, CA, USA) Относительное количество белков анализировали с использованием Количество От одного программного обеспечения (Bio-Rad, Hercules , CA, USA) и нормированы, что из бета-актина (деталей, показанных в дополнительном файле 1:. Дополнительные данные)
модель опухоли ксенотрансплантата
Сорок голых мышей были разделены на четыре группы случайным образом. Каждой группе вводили подкожно в спину с суспензией 200 мкл, содержащих 2 × 10 6 клеток выше, соответственно. Объем ксенотрансплантатов серийно измеряется. Мышей умерщвляли через 35 дней. Ксенотрансплантаты иссекали и взвешивали. Рассчитаны показатели ингибирования ксенографтов по формуле: степень ингибирования (%) = 1-средний вес (OLFM4 сбить клетки инъецировали группы или управления HK клеток-впрыскивается группа) /средний вес (контроль HK клетки-впрыскивается группу) × 100%. Затем ткань опухоли подлежал полной изоляции РНК или обнаружения иммуногистохимии.
Иммуногистохимия (IHC)
OLFM4 белков в опухолевых ксенотрансплантатов анализировали методом IHC с использованием кроличьего антитела OLFM4 (Abcam, Кембридж, Соединенное Королевство) (подробности приведены в Дополнительный файл 1:. Дополнительные данные) Статистика пользователя
данных из независимых экспериментов были выражены как среднее ± стандартное отклонение по меньшей мере, три эксперимента. Сравнения между группами анализировали с помощью т двух Стьюдента
-TEST или ANOVA, в зависимости от обстоятельств, а также величины р и л; 0,05 считались статистически значимыми.
Результаты
Efficient нокдаун гена OLFM4 с помощью плазмид-опосредованной миРНК в раковых клетках желудка
OLFM4 экспрессии белка образец был исследован в рак желудка BGC-823, HGC-27, SGC-7901, MKN28, MKN45 клетки и нормальные клетки управления ГЭС-1 (Рис. 1А) OLFM4 белок определенно выражает во всех этих клеток рака желудка и клеток GES-1. В частности, SGC-7901 и клетки MKN45 выражены относительно высокий уровень OLFM4 белка, чем другие желудочно-кишечные раковые клетки и GES-1 клеток. Таким образом, были выбраны SGC-7901 и клетки MKN45 для дальнейших исследований. Рисунок 1 Эффективное нокдаун OLFM4 путем РНК-интерференции при раке желудка SGC-7901 и клеток MKN45. А. Экспрессия белка OLFM4 в различных желудочных линиях раковых клеток. Профиль экспрессии белка OLFM4 анализировали с использованием вестерн-блоттинга с бета-актина в качестве внутреннего контроля. Клетки ГЭС-1 подавали в нормальных контрольных клеток. Выражение B. OLFM4 мРНК в клетках бросовым OLFM4. Относительное выражение OLFM4 был обнаружен QRT-PCR. β-актин был использован в качестве внутреннего контроля. Сложите изменения в экспрессии мРНК OLFM4 определяли с помощью метода 2-ΔΔCt. экспрессия белка C. OLFM4 в нокдаун клетках OLFM4. экспрессия белка OLFM4 была обнаружена с помощью вестерн-блоттинга. бета-актина белок использовали в качестве внутреннего контроля. Представители трех экспериментов. ** P &л; 0,01 по сравнению с контрольными клетками HK группы (п = 3).
Вниз регулируют экспрессию OLFM4, плазмида опосредованной shRNA ориентации гена OLFM4 был построен, чтобы стабильно нокдаун экспрессию OLFM4 в SGC-7901 и клетках MKN45. Как показано на фигуре 1В, уровни мРНК OLFM4 были значительно снижены в СГК-7901-siOLFM4 и клеток MKN45-siOLFM4 по сравнению с их контролем HK или родительских клеток (P ≪ 0,01). Эти результаты были подтверждены в дальнейшем с помощью Вестерн-блоттинга (рис 1C). Не наблюдалось значительной разницы в выражении OLFM4 между родительскими и HK контрольными клетками. Уровни мРНК и белка для бета-актина были сходны между различными группами. Эти результаты свидетельствуют о том, что плазмида, опосредованную OLFM4-миРНК могут специфически и эффективно сбить уровень OLFM4 в клеток рака желудка. С учетом анализа указанной выше, поэтому, OLFM4 сбить клетки и контрольные клетки HK были выбраны для дальнейшего исследования.
OLFM4 нокдаун ингибирует желудочную пролиферацию раковых клеток и якорного независимый рост в пробирке
Чтобы определить роль OLFM4 в желудочном рост раковых клеток, мы исследовали влияние OLFM4-миРНК на рост клеток в 1-5 дня момент времени с помощью WST-1 анализа. Как показано на фигуре 2А, ​​во всех двух желудочных линий раковых клеток, рост OLFM4 нокдаун клеток была значительно снижена по сравнению с контрольными клетками HK от 3 день (Р &ЛТ; 0,01). Для дальнейшего изучения важность OLFM4 в онкогенеза желудка раковых клеток в пробирке, мы проводили анализы роста анкерные независимый и нашел SGC-7901 и MKN45 клетки, экспрессирующие управления HK хорошо росли в мягком агаре, образуя отдельные колонии. В отличие от этого, OLFM4 нокдаун СГК-7901, и клетки MKN45 демонстрировали значительное снижение количества мягком агаре колонии (P &ЛТ; 0,01) (рис 2B), показывающий преобразование способности меньше, чем у контрольных клеток. Эти данные указывают на то, что нокдаун в OLFM4 может ингибировать желудочную пролиферацию раковых клеток и якорного независимый рост в пробирке. Рисунок 2 нокдаун OLFM4 ингибирует рост SGC-7901 и клеток MKN45 в пробирке и в естественных условиях. А. Кривая роста клеток. Пролиферация клеток в пробирке оценивали с помощью кривой роста клеток, как определено путем подсчета количества клеток (WST-1 анализа) в СГК-7901 клеток (левая панель) и клетки MKN45 (правая панель). Значение OD (450 нм) подсчитывали на указанные дни и представлены как средние числа клеток (n = 3). B. Anchorage независимый рост в мягком агаре. Типичные изображения трех экспериментов было показано (верхняя панель). Данные представляют собой среднее число колоний, подсчитанных при 200-кратном увеличении на 5 случайных полей (нижняя панель). С. средний объем опухоли после подкожной инъекции голым мышам с контролем HK или нокдаун клеток OLFM4 измеряли в указанные моменты времени. D. Представитель опухолей изображения на 35 дней после подкожной инъекции указанных клеток. вес E. Среднее опухоль (левая панель) и степень ингибирования (правая панель) в ксенотрансплантатов. Данные представляют собой средний вес опухоли ксенотрансплантатов (среднее ± стандартное отклонение, n = 10). ** P &л; 0,01 по сравнению с контрольной группой HK.
Рост-ингибирующий эффект снизился OLFM4 в желудочном ксенотрансплантатов
Кроме того, мы также провели подкожные опухоли формирующее анализа в голых мышах, чтобы оценить подавление роста эффекта понижающей регуляции OLFM4 в естественных условиях. Голым мышам подкожно вводили OLFM4 нокдауна или контрольными клетками HK. Объемы опухоли в течение 4 дней и вес опухоли на 5 недель были измерены, соответственно, после подкожной инъекции. Как показано на рисунке 2C-D, является ли произведенный объем опухоли или опухоли вес путем OLFM4 сбить SGC-7901 и MKN45 клетки значительно уменьшенный рост по сравнению с опухолями, полученных у мышей, которым вводили контроль-трансфецированных клеток HK (P &ЛТ; 0,01). Степень ингибирования ЮГК-7901 и MKN45 нокдаун клетки инъецировали группы на рост опухоли был 40,29% и 37,48% соответственно (рис 2E).
Чтобы обеспечить дополнительную экспрессию OLFM4 является indeedly притихли после подкожной инъекции голых мышей, мы также оценивали OLFM4 экспрессию в опухолевых ксенотрансплантатов с использованием QRT-PCR и IHC. Точно так же в пробирке, уровень OLFM4 мРНК в опухолевых ксенотрансплантатов, производимых OLFM4 нокдаун клеток также показали значительное снижение по сравнению с HK контрольных опухолей ксенотрансплантатов (P < 0,01) (рис 3А). В соответствии с результатами QRT-PCR, также наблюдалось значительное снижение белка OLFM4 в ксенотрансплантатов опухолей с помощью IHC (P &ЛТ; 0,01) (фиг 3В и 3С). Более высокая серая шкала и сильнее положительный сигнал с помощью визуализации DAB были обнаружены в опухолевых ксенотрансплантатов из-под контроля HK клетки-закачиваемой группы. Наоборот, слабый коричневый окрашивание наблюдалось в опухолевые ксенотрансплантаты OLFM4 нокдаун клеток-впрыскиваемого группы. Кроме того, более крупный некроз область наблюдалась в опухолевых ксенотрансплантатов, производимых контрольными клетками HK из-за быстрого роста контрольных клеток (HK Фиг.3В верхняя панель). Эти данные дали мощный признак того, что OLFM4 экспрессию на мРНК и уровни белка стабильно угнетается действительно в естественных условиях. Взятые в совокупности, как в пробирке и в естественных условиях экспериментов позволяют предположить, что OLFM4 нокдаун ингибирует рост клеток рака желудка. Рисунок 3 QRT-PCR и IHC обнаружение OLFM4 в ксенотрансплантатов опухолей. A. QRT-PCR для мРНК OLFM4 в опухолевых ксенотрансплантатов. Сложите изменения в мРНК OLFM4 определяли с помощью метода 2-ΔΔCt. бета-актина ген был использован в качестве внутреннего контроля. B. H &Amp; E окрашивание (верхняя панель) и IHC для OLFM4 белка (нижняя панель) в ксенотрансплантатов. Типичные изображения (200 ×) показаны. N, некроз. С. Количественный анализ экспрессии OLFM4. Среднее значение было измерено от пяти случайным образом различных полей под микроскопом (400 ×) с использованием изображения-Pro Plus V6.0. Данные выражали в виде среднего значения ± SD. ** P &л; 0,01 по сравнению с контрольной группой HK.
OLFM4 нокдауна задержки G1 для перехода S, но не вызывает очевидный апоптоз в раковых клетках желудка
Учитывая наши наблюдаемые тормозящее действие на рост клеток в пробирке и в естественных условиях, мы стремились определить, ли усиливается апоптоз или прогрессирования с задержкой клеточного цикла был связан с торможением роста. Сначала мы оценивали влияние сниженной OLFM4 на прогрессии клеточного цикла. Как показано на рисунке 4A, как OLFM4 нокдаун SGC-7901 и клетки MKN45 показали значительное увеличение числа в фазе G1 и уменьшение числа в фазе S, в отличие от их клеток HK контроля (P < 0,01). Никаких существенных различий не наблюдалось в G2 /M-фазы, что указывает на типичную задержку G1 клеточного цикла. Рисунок 4 Оценка распределения клеточного цикла, апоптозе и каспазы-3/9 активации в OLFM4 нокдаун клеток рака желудка. А. Анализ клеточного цикла. Изменения в распределении клеточного цикла SGC-7901-HK, SGC-7901-siOLFM4 и MKN45-HK, клетки MKN45-siOLFM4 анализировали с помощью ТСМ. Данные представляют собой средний процент распределения фазы клеточного цикла (N = 3). B. Анализ клеточного апоптоза. Апоптоз оценивали с окрашиванием AnnexinV-PE /7-AAD по ТСМ. Данные представляют собой процентное соотношение среднего клеток путем апоптоза (п = 3). С. каспазы-3 и -9 активаций. Каспазы-3, 9 активаций между указанными клетками показаны. ** P &л; 0,01 по сравнению с контрольной группой HK.
Чтобы определить, является ли апоптоз участвует в этом торможение роста, мы в следующий раз проводили анализ клеточного апоптоза. Интересно, что снижение экспрессии OLFM4 не может привести к значительным изменениям в апоптоз (рис 4В), что согласуется с анализом клеточного цикла не показывая никакой видимой суб-G1 фазы в исследуемых клетках. Для дальнейшего изучения изменений апоптотических сигналов, каспазы-3 /-9 активность также были определены колориметрическим анализом активации. Оба каспазы-3 и -9 активаций не показали каких-либо существенных изменений после нокдауна OLFM4 в SGC-7901 и клеток MKN45 (рис 4в). Эти результаты свидетельствуют о том, что снижение экспрессии OLFM4 может оказывать ингибирующее действие на рост клеток путем регуляции прогрессию клеточного цикла, не связанной с апоптоз в раковых клетках желудка.
Делеция OLFM4 сенсибилизирует клеток рака желудка Н2О2 или TNF альфа-индуцированного апоптоза <бр> отчетливый эффект H <суб> 2О <суб> 2 или TNF α на апоптоз между OLFM4 сбить и контрольные клетки HK также была исследована. OLFM4 сбить или контрольные клетки HK обрабатывали 10, 100 и 1000 мкМ H <> 2O к югу <югу> 2 или 5, 10 и 50 нг /мл TNF α соответственно. оценивали жизнеспособность клеток и апоптоз. Как показано на рисунке 5A-D, наблюдалось дозозависимое снижение жизнеспособности клеток в H <суб> 2O <Суб> 2 или TNF α обработанных OLFM4 нокдаун клеток. Кроме того, обработка 10 мкМ Н <суб> 2O <суб> 2 (рис 5A-B), или 10 нг /мл α -ФНО (5С-D), привело к значительному снижению жизнеспособности клеток в OLFM4 сбить клетки по сравнению с HK контрольные клетки (P &л; 0,01). Особый интерес вызывает тот факт, что OLFM4 нокдаун клеток, а не контрольные клетки HK обрабатывают 10 ~ 1000 мкМ H <суб> 2О <суб> 2 выставлены более заметным апоптотических процент по сравнению с пациентами, получавшими PBS издеваться (P &л; 0,01) ( На фиг.5А-В). Аналогичные результаты были также замечены в TNF альфа-клетках, обработанных бросовым OLFM4 (5С-D). Другими словами, OLFM4 сбить усиленную H <суб> 2O <суб> 2 или TNF α-индуцированный апоптоз клеток рака желудка, что указывает на удаление OLFM4 из СГК-7901, и клетки MKN45 более чувствительны к лечению Н <суб> 2O <к югу> 2 или TNF α. Рисунок 5 Реакция OLFM4 нокдаун SGC-7901 и клетки MKN45 к индуцирующих апоптоз агентов H 2 O 2 или TNF альфа. OLFM4 нокдаун и контрольные клетки HK обрабатывали H2O2 (А и В) или TNF α (C и D) в указанных дозах в течение 12 ч. Жизнеспособность клеток измеряли с помощью WST-1 анализа (A-D левые панели) и выражали в Среднее значение ОП (450 нм) (п = 3). Процент апоптотических клеток определяли с помощью FCM (A-D правая панели) и выражали в среднем апоптотических процент (п = 3). * P &л; 0,05, ** Р &л; 0,01 по сравнению с контрольной группой HK.
Активность каспазы-3 участвует в H2O2 или TNF альфа-индуцированного апоптоза в OLFM4 нокдауна клетки
Вышеуказанные результаты показали, что сбить из OLFM4 может увеличить H <суб> 2O <к югу> 2 или TNF α-стимулированной апоптоз. Для дополнительной проверки, активирована ли каспазы-3 в Н <югу> 2О <суб> 2 или TNF α-индуцированного апоптоза в нокдаун клетках OLFM4, мы в следующий раз обнаружена каспазы-3 активации в Н <югу> 2О <суб> 2 или TNF альфа-клеток, обработанных с помощью колориметрического анализа. Как показано на рисунке 6A, обработка H <югу> 2О <югу> 2 или TNF α приводит к гораздо больше усиление каспазы-3 в клетках бросовым OLFM4, чем контрольные клетки HK (P &лт; 0,01), что предполагает активность каспазы-3 участвует в H <югу> 2О <суб> 2 или TNF α-индуцированного апоптоза в клетках бросовым OLFM4. Для дальнейшего проверить, является ли H <суб> 2О <суб> 2 или TNF α-индуцированного апоптоза зависит от активность каспазы-3, Z-VAD-FMK, ингибитор каспазы использовали до лечения Н <югу> 2О <суб> 2 или TNF α. Предварительная обработка Z-VAD-финляндских марок значительно ослабляется H <югу> 2О <суб> 2 или TNF α-индуцированного апоптоза клеток, а также активность каспазы-3 в обоих OLFM4 нокдаун клеток (P &л; 0,01) (рис 6C-D ), что указывает, что Н <суб> 2O <суб> 2 или TNF α-индуцированного апоптоза каспазы-3 зависит в нокдаун клеток OLFM4. Рисунок 6 Вовлечение каспазы-3 в H 2 O 2 или TNF α-индуцированного апоптоза в OLFM4 нокдаун SGC-7901 и клетки MKN45. (A-B) Повышение активности каспазы-3 в H2O2 или TNF альфа обработанных нокдаун клеток OLFM4. OLFM4 нокдаун и НК-контрольные клетки обрабатывали 10 мкМ Н2О2 (А) или 10 нг /мл TNF α (В) в течение 12 ч. Активность каспазы-3 измеряли с помощью колориметрического анализа и выражается в складчатых изменений. ** P &л; 0,01 по сравнению с PBS издеваться группа (п = 3). (C-D) Перевернутое апоптоз клеток ингибитором каспаз в нокдаун клетках OLFM4. Клетки обрабатывали только H2O2 или α -ФНО с ​​указанными дозами, как указанное выше, или предварительно обрабатывают с помощью 20 мкМ Z-VAD-FMK 2 ч до H2O2 или α -ФНО лечения. Процент апоптотических клеток определяли с помощью FCM. Данные представляют собой средние значения ± SD трех независимых экспериментов. ** Р &л; 0,01 по сравнению с H2O2 (С) или TNF α (D) -обработанной OLFM4 нокдаун Клетки группы.
Обсуждение
Недавно накапливающиеся данные продемонстрировали OLFM4 часто избыточно экспрессируется во многих типах опухолей человека, включая рак желудка, и это, как полагают, играют решающую роль в развитии и прогрессии рака желудка [19, 20]. Хотя предыдущие исследования показали, что OLFM4 участвует в апоптозе и опухолевого роста, недавние наблюдения также показывают, что клетки или ткани специфические эффекты могут существовать для гена OLFM4. Относительно мало известно о росте опухоли и подстилающей желудка экспрессии OLFM4 канцер-специфической апоптозу. Для того, чтобы получить более глубокое понимание этой роли измененном OLFM4 при раке желудка человека, экспериментальная поддержка необходима для подтверждения роли гена OLFM4 при раке желудка.
Было показано, что аномальная экспрессия ТЖК-1 может регулироваться на транскрипционном или посттранскрипционном уровне [13]. В наших нынешних работах, мы исследовали непосредственно OLFM4 белка характер экспрессии в желудочном раковых клеток и нормальных GES-1 клеток. SGC-7901 и клетки MKN45 выражают относительные высокие уровни OLFM4 были выбраны для этого исследования. Поскольку уменьшение экспрессии гена-мишени с помощью генетических средств в установленных клеточных линий полезно для лучшего понимания своей роли в поддержании злокачественного фенотипа особенно при анализе генов, которые необходимы для клеточного выживания [21], мы получили устойчивые бассейны клон SGC-7901 и MKN45 выражения OLFM4-миРНК или зашифрованная контроль HK плазмидной на основе миРНК подхода и подтвердили нокдауна эффективность гена OLFM4 на мРНК и уровня белка QRT-PCR и вестерн-блоттинга.
Наши нынешние работы демонстрируют, что OLFM4 играет Существенную роль в желудочном онкогенеза рака. Нокдаун OLFM4 ингибирует клеточную пролиферацию и якорного независимый способность роста в лабораторных условиях. Модели ксенотрансплантата опухоли в естественных условиях также предполагает, что снижение OLFM4 может ингибировать опухолевый рост клеток рака желудка человека. Эти результаты указывают на то, что OLFM4 играет решающую роль в пролиферации клеток клеток рака желудка. Наши результаты также наблюдали, что нокдаун в OLFM4 не оказывает влияния на скорость апоптоза и каспазы-3 и 9 активаций в OLFM4 нокдаун клеток, предполагая, что апоптоз не может быть механизм, лежащий в основе ингибирования роста опухоли. Таким образом, мы допускаем, что выражение OLFM4 не является необходимым для выживания раковых клеток, что в соответствии с недавним наблюдением, что генетические выбиваемые мышей для OLFM4 показывают нормальное развитие и кроветворных фенотип [17]. Для дальнейшей характеристики механизма, лежащего ингибирования роста, мы провели анализ клеточного цикла, и показано, что ингибирование экспрессии OLFM4 индуцированных клеток рака желудка аккумулироваться в G1-фазе клеточного цикла, предполагая, что понижающей регуляции OLFM4 могут оказывать ингибирующее действие на рост клеток путем прогрессию клеточного цикла, регулирующий механизм, не связанных с апоптоз в раковых клетках желудка.
устойчивости опухолевых клеток к индукции апоптоза является одним из основных факторов, ответственных за неспособность многих традиционных противораковых терапий, которые используют противоопухолевые агенты и радиацию. Таким образом, контроль апоптоза в раковых клетках является критической биологической и клинической значимости [22, 23]. Антиапоптозную активность является еще одной важной функцией гена [2] OLFM4. В частности, Н <суб> 2O <суб> 2-индуцированный клеточный апоптоз, ослабленный суперэкспрессированный OLFM4 в простатической клеточной линии рака [2]. Кроме того, MKN45 клетки, как было показано способность устойчивости к TNF-α-индуцированного апоптоза [24]. Учитывая эти данные, мы предполагаем, что нокдаун экспрессии OLFM4 может усилить H <> 2O суб <суб> 2 или TNF α-индуцированный апоптоз в раковых клетках желудка. Здесь мы показали, что нокдаун в OLFM4 эффективно улучшенную апоптоз клеток в ответ на H <югу> 2О <суб> 2 или TNF альфа стимуляции в MKN45, а также SGC-7901 клеток, предполагая блокирование OLFM4 может увеличить восприимчивость рака желудка клетки в присутствии H <суб> 2O <суб> 2 или ФНО α.
Как хорошо известно, что активность каспазы-3, ключевой исполнительный молекула пути апоптоза, играет критическую роль в апоптотических процессов в различных клеток. Кроме того, мы исследовали активацию каспазы-3 в OLFM4 нокдауна и контрольных клеток HK в присутствии или в отсутствие ингибитора каспазы Z-VAD-финляндских марок. Мы наблюдали, что лечение Н <югу> 2О <суб> 2 или TNF альфа значительно повышающей регуляции каспазы-3 в клетках бросовым OLFM4, чем контрольные клетки HK во время предварительной обработки с Z-VAD-финляндских марок обращенно активность каспазы-3, а также в H <суб> 2O <югу> 2 или TNF альфа-индуцированного апоптоза. Эти результаты указывают на то, что Н <суб> 2O <Суб> 2 или TNF α-индуцированного апоптоза в клетках нокдаун OLFM4 является каспазы-3 зависит. На основании имеющихся данных, можно предположить, что повышающей регуляции OLFM4 позволяет клеток рака желудка противостоять индукции апоптоза путем уменьшения чувствительности к противоопухолевым препаратам.
На самом деле, антагонисты OLFM4, как сообщалось, ингибируют пролиферацию в других типах раковые клетки поджелудочной железы, такие как раковые клетки человека PANC-1 [8] и человеческого CANER легких клеток SBC-1 [9]. Тем не менее, также наблюдались противоречивые результаты. Снижение OLFM4 мРНК ингибирует PANC-1 клеток, пролиферацию S в G2 /M фазы ареста [8], которая отличается от наших результатов, показывающих ход фазы G1 задержанный в развитии рака желудка. Некоторые важные детали (или причины) может объяснить это несоответствие. Во-первых, как показали недавние исследования позволяют предположить, клетки или ткани специфическая роль OLFM4 (рак желудка клетки и раковые клетки поджелудочной железы) может быть убедительным объяснением такого расхождения. Наиболее примечательно то, выражение OLFM4 на уровне мРНК, но не уровень белка в клетках PANC-1 была успешно измерена с помощью RT-PCR [8], тогда как в последнем докладе Ким и др. показали, что Рапс-1 клетки не имеет экспрессии мРНК OLFM4 [25], что указывает на характер экспрессии и роль гена OLFM4 в клетках PANC-1 нуждаются в дальнейшем подтверждении.
Несмотря на OLFM4 глушение было показано, что ингибирующее действие на рост клеток и а снижение устойчивости к H <югу> 2О <суб> 2 или ФНО α лечения в желудочном раковых клеток, не исключено, что другие механизмы могут быть также регулируются OLFM4 и способствует торможению роста и сигнализации управления апоптозом, принимая во внимание перекрестные помехи в сети ,

• структурные изменения рецептора эпидермального фактора роста при раке желудка
• Выражения ЦОГ-2 и VEGF-C при раке желудка: корреляции с лимфангиогенез и прогностическое значение