Išeikvojimas OLFM4 geno slopina ląstelių augimą ir didina jautrumą su vandenilio peroksidu ir naviko nekrozės faktoriaus alfa sukeltas-apoptozės skrandžio vėžio ląsteles

Išeikvojimas OLFM4 geno slopina ląstelių augimą ir didina jautrumą su vandenilio peroksidu ir naviko nekrozės faktoriaus alfa sukeltas-apoptozės skrandžio vėžio ląstelių
Anotacija
fone
Žmogaus olfactomedin 4 (OLFM4) geno yra sekretuojamą glikoproteinas dažniau žinomas kaip anti-apoptozės molekulės GW112. OLFM4 yra nustatyta, kad dažnai iki reguliuojama įvairių tipų žmogaus navikų, įskaitant skrandžio vėžiu ir buvo manoma, kad žaisti svarbų vaidmenį skrandžio vėžio progresavimą. Nors OLFM4 funkcija buvo nurodyta daug tyrimų, naujausi duomenys primygtinai siūlo mobilųjį arba audinio tipo priklausomas vaidmenį OLFM4 ląstelių augimo ir apoptozės. Šio tyrimo tikslas yra ištirti skrandžio vėžiu konkretizacija OLFM4 ląstelių augimą ir atsparumą apoptozė vaidmenį.
Metodai
OLFM4 išraiška buvo šalinami RNR kišimosi į SGC-7901 ir MKN45 ląsteles. Ląstelių proliferaciją, tvirtinimo nepriklausomas augimas, ląstelės ciklo ir apoptozė buvo būdingas in vitro. Tumorogeniš- buvo analizuojami in vivo. Apoptozę ir kaspazės-3 aktyvavimo reaguojant į vandenilio peroksido (H 2O 2) arba auglio nekrozės faktoriaus alfa (TNF α) buvo vertinama atsižvelgiant į buvimo ar nebuvimo kaspazė inhibitoriaus Z-VAD-fmk.
rezultatai Viesbutis The iš OLFM4 baltymų panaikinimo pagal RNR kišimosi į SGC-7901 ir MKN45 ląstelių žymiai slopina tumorogeniš- tiek in vitro ir in vivo, veikiantys taikant indukcijos ląstelių G1 arešto (visais atvejais p < 0,01). OLFM4 nokdaunas nesuaktyvino akivaizdus ląstelių apoptozę, tačiau padidėjo H 2O 2 arba TNF α sukeltos apoptozės ir kaspazės-3 veikla (visais atvejais p < 0,01). Gydymas Z-VAD-FMK susilpnintas kaspazės-3 aktyvumą ir gerokai pasikeitė H 2O 2 arba TNF α sukeltos apoptozės į OLFM4 triuškinantis ląstelių (visais atvejais p < 0,01).
Išvada
Mūsų tyrimas rodo, kad išeikvojimas OLFM4 žymiai slopina tumorogeniš- skrandžio vėžio SGC-7901 ir MKN45 ląsteles. Blokavimo OLFM4 išraiška gali įjautrinti skrandžio vėžio ląsteles H 2O 2 arba TNF α elgesio didinant kaspaze 3 priklausomą apoptozę. Derinys strategija, grindžiama OLFM4 slopinimo ir priešvėžinių narkotikų gydymo gali numatyti gydomąjį potencialą skrandžio vėžio įsikišimo.
Raktiniai žodžiai
Skrandžio vėžys Olfactomedin 4 RNR interferencija ląstelių augimą apoptozę atsparumo fone
žmogaus OLFM4 (olfactomedin 4, taip pat žinomas kaip hGC-1, GW112), iš pradžių, vadinamas žmogaus klonuotą iš mieloidinių pirmtakų ląstelių po granulocitų kolonijas stimuliuojančio faktoriaus stimuliacijos [1], yra sekretuojamas glikoproteinas labiau žinomas kaip anti-aprotoninis molekulės GW112 [2, 3]. OLFM4 yra paprastai išreiškiami kaulų čiulpuose, prostatos, plonosiose žarnose, skrandžio, storosios žarnos ir kasos [1, 4]. Vėliau, padidėjo OLFM4 lygiai taip pat buvo rasta kriptų epitelio uždegimo storosios žarnos gleivinės uždegiminių žarnyno ligų [5] ir skrandžio biopsijos infekuotų su Helicobacter pylori [6, 7]. Daugiau neseniai, iki reguliuojama OLFM4 išraiška buvo aprašyta plaučių ir krūties [8], prostatos [3], skrandžio [3, 9] ir kasos vėžio [8, 9], taip pat kaip ir gaubtinės ir tiesiosios žarnos adenomos [10-14].
Jis buvo pasiūlyta, kad OLFM4 svarbus ląstelės proceso, tokio kaip apoptozės, ir naviko augimo [2]. Nors buvo tiriama ląstelių funkcija OLFM4, šie rezultatai ne visada sutampa. Padidėjusi OLFM4 buvo įrodyta, kad palengvinti pelės prostatos naviko valkata-C1 ląstelių augimą singeninės C57 /BL6 [2] pelių, bet slopina žmogaus prostatos vėžio PC 3 ląstelių proliferaciją [15]. Be to, iki reguliuojama OLFM4 parodė tvirtą kovos su Apoptozė veiklą pelės limfinio venų endotelio Švec ląstelių ir žmogaus adenokarcinoma HeLa [1, 2], o naujausi duomenys pasiūlė proapoptotic poveikį OLFM4 žmogiškųjų mieloleukemija HL-60 ląstelių [16 ]. Įrodymai iš šių tyrimų primygtinai siūlo, kad vaidmenys OLFM4 ląstelių augimo kontrolės ir apoptozės gali priklausyti nuo ląstelių arba audinių tipą [10, 13-15]. Iki šiol, tačiau labai nedaug duomenų, susiję su OLFM4 vaidmenį ląstelių augimą ir apoptozę profilių skrandžio vėžio ląstelių buvo paskelbtas.
Šiame tyrime mes analizuojami OLFM4 baltymo ekspresiją skrandžio vėžio ląsteles ir normalus žmogaus skrandžio epitelio GES-1 ląstelių Imunoblotingo. Naudojant plazmidės tarpininkaujant trumpas segtukas RNR (shRNR), mes slopinamas OLFM4 išraišką skrandžio vėžio SGC-7901 ir MKN45 ląsteles stebėti ląstelių proliferaciją, ląstelinio ciklo fazę, apoptozė in vitro ir įvertinti jos tumorogeniškas gebėjimus vivo. Mes taip pat tyrinėjo apoptozę ir kaspaze 3 aktyvavimo reaguojant į citotoksiniais preparatais, pavyzdžiui, H 2O 2 arba TNF α į buvimą ar nebuvimą kaspazės inhibitorių Z-VAD-FMK tarp OLFM4 triuškinantis ląstelių ir HK kontrolinių ląstelių .
metodai
Mobilusis kultūra, reagentai ir pelės
žmogaus skrandžio vėžio ląstelės bgc-823, HGC-27, SGC-7901, MKN28, MKN45 ir normalūs žmogaus skrandžio epitelio GES-1 ląstelės buvo prižiūrimi DMEM terpę (GibcoBRL, Gaithersburg, MD), kurių sudėtyje yra 10% vaisiaus jaučio serumo (FBS, GibcoBRL, JAV), penicilino 100 U /ml ir 100 mikrogramų /ml streptomicino deriniai. O 2O 2 ir TNF-α buvo gauti iš Sigma (St Louis, MO) ir Z-VAD-FMK buvo įsigytas iš CalBiochem (San Diego, CA). BALB /c nuogas (Nu /Nu) Pelės (4-6 savaičių amžiaus, SPF laipsnis, 20 ± 3 g) buvo nupirkta iš laboratorinių gyvūnų centras Chongqing medicinos universiteto (Čongčingas, Kinija). Visos procedūros buvo atliekami pagal tarptautiniu mastu pripažintus etikos gaires (NIH Nr. 85-23, peržiūrėta 1985).
Plazmidžių konstruoja ir stabili transfekcija
shRNR sąlygojamą RNAi plazmidės (pGenesil 1,1 siOLFM4) ir plakta kontrolės plazmidės (pGenesil 1,1-HK) buvo pastatyti numušti endogeninę OLFM4 į SGC-7901 ir MKN45 ląsteles. Po transfekciją ir neomicino (G418) atrankos, OLFM4 trankyti į apačią SGC-7901-siOLFM4, MKN45-siOLFM4 ląsteles ir plakta SGC-7901-HK, MKN45-HK kontrolės ląstelės buvo stabiliai gauti, atitinkamai (detalės parodyta Papildoma failą 1: papildomos duomenys).
RNR gavybos ir kiekybinė PGR (KRL-PGR)
viso RNR įvairiose ląstelės ar navikų audiniuose, buvo išgauti naudojant RNeasy Mini Kit (Qiagen, CA, JAV), ir buvo po sintezei naudojant ReverTra Ace-alfa pirmoji kryptis kDNR sintezės sistemą (Toyobo, Osaka, Japonija), kaip Ankstesnis aprašyta [17]. Kiekybinis realaus laiko PGR buvo atliekama naudojant 7500 realiojo laiko PGR sistema (Applied BIOSYSTEMS) su SYBR žalia kaip liuminescencinių dažų (Toyobo, Osaka, Japonija) (detales rodomų Papildoma failą 1: papildomi duomenys). Sulenkite pokyčiai genų ekspresijos buvo nustatoma naudojant "2 - ddCT". Metodas [18]
ląstelių proliferacija tyrimas in vitro ir ląstelių gyvybingumo matavimo pervežimas ląstelių proliferaciją ir ląstelių gyvybingumą buvo matuojamas naudojant ląstelių proliferaciją WST-1 rinkinys ( "Roche ) pagal gamintojo instrukcijas. Ląstelių proliferaciją, ląstelės buvo pasėjamos esant 1 × 10 3 ląstelių viename šulinėlį 96 šulinėlių plokšteles tankio ir išaugo 5 dienas. Optinis tankis (bangos ilgis 450 nm) vertė buvo aptiktas naudojant microplate skaitytuvas (TACAN, Svazilendas) per dieną. Kiekvienas tyrimas buvo pakartotas tris kartus. Kaip matuoti ląstelių gyvybingumo, ląstelės (1 × 10 4 /gerai), buvo pasėjamos 200 įxL žiniasklaidos 96 duobučių plokšteles. Po 12 h inkubacijos H 2O 2 arba TNF α buvo elgiamasi nurodytas koncentracijas. Santykinis sugeriamumas buvo matuojamas kaip aprašyta ląstelių proliferaciją.
Ankoridžas nepriklausomas augimo tyrimą
Ankoridžas nepriklausomas augimas buvo atliktas ant minkšto agaro atspindėti in vitro clonogenicity. Trumpai tariant, ląstelės (5 × 10 2) iš kiekvienos kolonijos buvo sustabdytas 0,3% agaro DMEM ir tada padengtas ant sukietintų agaru (0.5%) 6-bei patiekalų. Ląstelės buvo inkubuojami 2 savaites 37 ° C temperatūroje 5% CO 2 prieš kolonijos buvo matuojamas. Kolonijų skaičius buvo skaičiuojamas 200 × priartinimas penkerius atsitiktinių laukų. Kiekvienas tyrimas buvo atliktas tris kartus.
Tėkmės citometrijos analizės
tėkmės citometrijos (FCM) analizė buvo atlikta siekiant įvertinti ląstelių ciklą arba apoptozę. (Išsamiau parodyta Papildoma failą 1: papildomi duomenys)
kaspazės tyrimas
fermentų aktyvumo kaspazės-3 ir -9 buvo matuojamas naudojant Fluorimetrinis tyrimą pagal metodą, aprašytą anksčiau [8]
Vakarų dėmė analizė.
imunoblotingu buvo vykdomi, kaip aprašyta anksčiau [17]. Šie antikūnai buvo naudojami Imunoblotingo: Anti-OLFM4 (Abcam, Kembridžas, Jungtinė Karalystė) ir anti-β-aktino (Santa Krusas, Kalifornija, JAV), santykinė kiekis baltymų buvo analizuojami naudojant kiekį One "programinė įranga (Bio-Rad," Hercules " , CA, JAV) ir standartizuoti, kad beta-aktino (duomenys parodytų papildomų failų 1. Papildomas duomenys)
ksenografiniuose navikas modelis
Keturiasdešimt nude pelėms buvo suskirstyti į keturias grupes atsitiktinai. Kiekviena grupė buvo švirkščiamas po oda į nugarą su 200 įxL 2 × 10 6 ląstelės aukščiau minėta, atitinkamai suspensijos, kurios sudėtyje. Iš audiniuose, apimtis buvo serijiniu matuojamas. Pelės buvo paaukotos po 35 dienų. Į ksenoimplantai buvo pašalintų ir pasveriamos. Slopinimas normos audiniuose, buvo apskaičiuojamas pagal formulę: slopinimo tarifas (%) = 1-vidutinis svoris (OLFM4 numušti ląstelės įpurškimo grupės ar HK kontrolinių ląstelių įpurškimo grupės) /vidutinio svorio (HK kontrolės ląstelės įpurškimo grupė) × 100%. Tada, naviko audinio buvo taikomi visų RNR išskyrimo arba imunohistocheminis aptikti.
Imunohistocheminis (IHC)
OLFM4 baltymų navikų audiniuose, buvo analizuojami IHC naudoti triušių anti OLFM4 (Abcam, Kembridžas, Jungtinė Karalystė) (detalės parodyta Papildoma failą 1:. Papildomi duomenys)
Statistika
duomenys iš nepriklausomų eksperimentų buvo išreikštas vidurkis ± SD bent trys eksperimentai. Palyginimai tarp grupių buvo analizuojami du-tailed Stjudento t
-test arba ANOVA, prireikus, ir p vertės < 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingų rezultatų.

Efektyvus numušti iš OLFM4 geno plazmidės tarpininkaujant siRNA skrandžio vėžio ląstelių
OLFM4 baltymo ekspresija modelis buvo ištirti skrandžio vėžio BGC-823, HGC-27, SGC-7901, MKN28, MKN45 ląstelės ir normalus GES-1 kontrolinių ląstelių (1a pav.) OLFM4 baltymas tikrai išreiškia visų šių skrandžio vėžio ląsteles ir GES-1 ląstelių. Visų pirma, Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ir MKN45 ląstelės išreiškė palyginti aukštą OLFM4 baltymų nei kitų skrandžio vėžio ląsteles ir GES-1 ląstelių. Todėl, Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ir MKN45 ląstelės buvo pasirinkta tolesnėms studijoms. 1 pav Efektyvus nokdaunas iš OLFM4 pagal RNR kišimosi į skrandžio vėžio SGC-7901 ir MKN45 ląsteles. A. išraiška OLFM4 baltymų įvairiais skrandžio vėžio ląstelių linijas. Išraiška profilis OLFM4 baltymų buvo analizuojami naudojant Imunoblotingo su beta-aktino kaip vidaus kontrolė. GES-1 ląstelės buvo tarnavo kaip įprastų kontrolės ląstelių. B. OLFM4 iRNR raiška OLFM4 triuškinantis ląsteles. Santykinis išraiška OLFM4 buvo aptikta KRL-PGR. β-aktino buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės. Sulenkite pokyčiai OLFM4 iRNR išraiškos buvo nustatomas naudojant 2-ΔΔCt metodą. C. OLFM4 baltymų ekspresija OLFM4 triuškinantis ląsteles. OLFM4 baltymo ekspresija buvo aptikta Imunoblotingo. beta-aktino baltymų buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės. Atstovai tris eksperimentus rodomi. ** P < 0,01 vs HK kontrolinių ląstelių grupėje (n = 3).
Žemyn reguliuoti OLFM4 išraišką, plazmidės, tarpininkaujant shRNR orientacija OLFM4 genas buvo pastatytas taip, kad stabiliai numušti OLFM4 išraišką SGC-7901 ir MKN45 ląsteles. Kaip parodyta 1B pav, OLFM4 iRNR koncentracija buvo žymiai sumažintas SGC-7901-siOLFM4 ir MKN45-siOLFM4 ląstelių, palyginti su jų Honkongo kontrolės ar tėvų ląstelių (P < 0,01). Šie rezultatai dar labiau patvirtino Imunoblotingo analizė (1c pav). Reikšmingai nesiskyrė OLFM4 išraiška buvo pastebėtas tarp tėvų ir HK kontrolinių ląstelių. MRNR ir lygiai baltymo panaudojimas beta-aktino buvo panašus tarp skirtingų grupių. Šie rezultatai rodo, kad plazmidės tarpininkaujant OLFM4-siRNR gali konkrečiai ir veiksmingai numušti OLFM4 lygį skrandžio vėžio ląsteles. Atsižvelgiant į analizę išdėstyta, todėl OLFM4 numušti ląsteles ir HK kontrolės ląstelės buvo pasirinkta tolesniam tyrimui.
OLFM4 nokdaunas slopina skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją ir inkaravimo nepriklausomas augimą in vitro,
Norėdami nustatyti OLFM4 vaidmenį skrandžio vėžio ląstelių augimą, mes tyrė OLFM4-siRNA poveikį ląstelių augimas 1-5 dienų laiko momentu pagal WST-1 metodu. Kaip parodyta 2A pav visais dviem skrandžio vėžio ląstelių linijas, iš OLFM4 augimas numušti ląsteles buvo gerokai sumažintas, palyginti su HK kontrolinių ląstelių iš 3 dieną (P < 0,01). Toliau nagrinėti OLFM4 svarbą skrandžio vėžio ląstelėse in vitro Tumorigenesis, mes atlikome tvirtinimo nepriklausomas augimo mėginiuose ir rasti SGC-7901 ir MKN45 ląstelės išreiškiantys HK kontrolę augo gerai minkšta agaro, formuojant atskirus kolonijas. Priešingai, OLFM4 nokdaunas SGC-7901 ir MKN45 ląstelės eksponuojami dramatišką sumažinti minkštųjų agaro kolonijų skaičius (p < 0,01) (2b pav), rodo transformuojant gebėjimus mažiau nei kontrolinių ląstelių. Šie duomenys rodo, kad grandininį žemyn OLFM4 gali slopinti skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją ir inkaravimo nepriklausomas augimą in vitro. 2 pav nokdaunas iš OLFM4 slopina SGC-7901 ir MKN45 ląstelių augimą in vitro ir in vivo. A. Ląstelių augimas kreivė. Ląstelių proliferaciją in vitro buvo įvertintas ląstelių augimo kreivę, kaip nustatyta skaičiavimo ląstelių skaičius (WST-1 tyrimas) į SGC-7901 ląstelių (kairėje skydelio) ir MKN45 ląstelių (dešinėje meniu). Optinio tankio vertė (450 nm) buvo suskaičiuoti ant nurodytuose dienų ir pateikti kaip vidutinis ląstelių skaičių (n = 3). B. Ankoridžas nepriklausomas augimas minkštu agaro. Reprezentacinės vaizdai trijų eksperimentų buvo parodyta (viršutinį skydelį). Duomenų atstovauti vidutinis kolonijų skaičių, skaičiuojant 200 × priartinimas 5 atsitiktinių laukų (apatinio). C. reiškia naviko apimtį po oda reikia švirkšti nuogas pelių su HK kontrolės ar OLFM4 triuškinantis ląstelių buvo matuojamas nurodytu laiku kiekis. D. atstovas navikai vaizdus 35 dienų po poodinės injekcijos nurodytas ląsteles. E. vidutinis naviko masė (liko skydelis) ir slopinantis norma (dešinėje skydelio) ir navikų audiniuose. Duomenų atstovauti vidutinis naviko svoris audiniuose, (vidurkis ± SN, N = 10). ** P < 0,01 vs HK kontrolinė grupė.
Augimo slopinantis poveikis sumažėjo OLFM4 skrandžio navikų audiniuose
Be to, mes taip pat atlikti poodinę naviko formuojamasis tyrimą nuogas pelių įvertinti augimo slopinimo poveikį žemyn reguliuojama OLFM4 in vivo. Nude pelėms buvo po oda sušvirkšta OLFM4 triuškinantis ar HK kontrolinių ląstelių. per 4 dienas ir naviko masė naviko tūrio sumažėjimas 5 savaites buvo matuojamas atitinkamai po poodinės injekcijos. Kaip parodyta pav 2C-D, ar navikas apimtis arba naviko masės pagaminti OLFM4 numušti SGC-7901 ir MKN45 ląstelės buvo gerokai sumažintas augimą lyginant su navikų gaminamų pelių švirkščiamas su HK kontrolės-perkeltų ląstelių (p < 0,01). Slopinantis norma SGC-7901 ir MKN45 numušti ląstelės įpurškimo grupė naviko augimas buvo 40,29% ir 37,48% atitinkamai (2E pav.)
Toliau užtikrinti OLFM4 išraiška indeedly nutildė po poodinės injekcijos nuogas pelių, mes taip pat įvertintas OLFM4 išraiška navikų audiniuose, naudojant KRL-PGR ir IHC. Panašiai in vitro OLFM4 iRNR lygis navikų audiniuose, pagamintų OLFM4 triuškinantis ląstelių, taip pat parodė, kad gerokai sumažėjo, palyginti su HK kontrolės navikų audiniuose, (p < 0,01) (3a pav.) Suderinamas su KRL-PGR rezultatus, gerokai sumažinti OLFM4 baltymų, taip pat buvo pastebėtas navikų audiniuose, IHC (P < 0,01) (3b pav ir 3C). Didesnis pilkosios skalės ir stipresnis teigiamas signalas DAB vizualizacija buvo rasta navikų audiniuose, HK kontrolės ląstelės-liejamo grupei. Priešingai, silpna ruda dėmės buvo pastebėtas navikų audiniuose, iš OLFM4 Klojinius išardomi ląstelės-liejamo grupei. Be to, daugiau didelių nekrozė regionas buvo pastebėtas navikų audiniuose, pagamintų HK kontrolinių ląstelių dėl greito augimo HK kontrolinių ląstelių (3b pav viršutinė skydo). Šie duomenys buvo svarbi nuoroda, kad OLFM4 išraiška mRNR ir baltymų kiekis yra stabiliai slopina tiesų in vivo. Kolektyviai, tiek in vitro ir in vivo rodo, kad OLFM4 parbloškimo slopina skrandžio vėžio ląstelių augimą. 3 paveikslas KRL-PGR ir IHC aptikti OLFM4 į navikų audiniuose. A. KRL-PGR už OLFM4 mRNR navikų audiniuose. Sulenkite pokyčiai OLFM4 mRNR buvo nustatomas naudojant 2-ΔΔCt metodą. beta-aktino genas buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės. B. H & El dažymo (viršutinis skydelis) ir IHC už OLFM4 baltymų (mažiau grupė) per navikų audiniuose. Reprezentacinės vaizdai (200 ×) parodyti. N nekrozė. C. kiekybinis analizė OLFM4 išraiška. Vidutinė vertė buvo matuojamas iš penkių atsitiktinai įvairių sričių mikroskopu (400 ×), naudojant vaizdo Pro Plus v6.0. Duomenys buvo pateikti kaip vidurkis ± SD. ** P < 0,01 vs HK kontroline grupe.
OLFM4 trankyti žemyn vėlavimų G1 į S perėjimo, bet nekyla akivaizdžios apoptozę skrandžio vėžio ląstelių
Kadangi mūsų pastebėtus slopinamąjį poveikį ląstelių augimą in vitro ir in vivo, siekėme nustatyti ar tvirtesnis apoptozė ar uždelsto ląstelės ciklo progresavimo buvo susijęs su augimo slopinimą. Mes pirmą kartą įvertino sumažėjo OLFM4 poveikį ląstelių ciklo progresavimo. Kaip parodyta 4A paveiksle, tiek OLFM4 nokdaunas SGC-7901 ir MKN45 ląstelės parodė daug didesnio numerius G1 fazėje sumažėjo numerius S fazėje, priešingai nei jų HK kontrolinių ląstelių (p < 0,01). Jokių reikšmingų skirtumų nepastebėta G2 /M-fazės, nurodant tipiškas G1 vėlavimo ląstelių ciklą. 4 pav vertinimas ląstelių ciklo platinimo, apoptozinių ląstelių ir kaspazės-3/9 aktyvacijos OLFM4 numušti skrandžio vėžio ląsteles. A. Mobilusis ciklo analizė. Pokyčiai ląstelių ciklo paskirstymo SGC-7901-HK, SGC-7901-siOLFM4 ir MKN45-HK, MKN45-siOLFM4 ląstelės buvo analizuojami FCM. Duomenys rodo tai procentą ląstelės dalijimosi ciklo fazės paskirstymo (n = 3). B. Mobilusis apoptozė analizė. Apoptozė buvo apskaičiuota su AnnexinV-PE /7-AAD dažymo FCM. Duomenys rodo tai aprotoninį ląstelių procentą (n = 3). C. kaspazės-3 ir -9 aktyvinimas. Kaspazė-3, yra parodyta 9 aktyvinimas tarp nurodytų ląstelių. ** P < 0,01 vs HK kontrolinės grupės.
Norėdami nustatyti, ar apoptozė dalyvauja šio augimo slopinimą, kitą kartą atlikta ląstelių apoptozę analizę. Įdomu tai, kad sumažintas OLFM4 išraiška negalėjo sukelti reikšmingų pokyčių apoptozės (4b paveikslas), kuris yra suderintas su ląstelių ciklo analize, atskleidžiančia, neturi akivaizdaus sub-G1 "etapą tirtų ląstelių. Toliau nagrinėti pakitimai apoptozinių signalus, kaspazės-3 /-9 veikla taip pat nustatė, spalvinėmis aktyvacijos tyrimus. Tiek kaspazės-3 ir -9 aktyvinimas neparodė jokių reikšmingų pokyčių po triuškinantis iš OLFM4 į SGC-7901 ir MKN45 ląstelių (4c paveikslą). Šie rezultatai rodo, kad žemyn reguliavimas OLFM4 gali daryti slopinančiu poveikiu ląstelių augimo reguliavimą ląstelinį ciklą, nėra susiję apoptozę skrandžio vėžio ląsteles.
Išbraukus OLFM4 sensitizes skrandžio vėžio ląstelių H2O2 ar TNF alfa sukeltos apoptozės
skiriasi poveikis H 2O 2 arba TNF α dėl ryšio tarp OLFM4 apoptozės numušti ir HK kontrolės ląstelės taip pat buvo tiriamas. OLFM4 numušti arba HK kontrolės ląstelės buvo gydomi 10, 100 ir 1000 mkm H 2O 2 arba 5, 10 ir 50 ng /ml TNF alfa atitinkamai. Ląstelių gyvybingumas ir apoptozė buvo įvertintas. Kaip parodyta pav 5A-D, nuo dozės priklausomas sumažėjimas ląstelių gyvybingumui buvo pastebėtas H 2O 2 arba TNF α gydytų OLFM4 numušti ląsteles. Be to, O gydymas 10 mikromolių 2O 2 (pav 5A-B), arba 10 ng /ml TNF alfa (pav 5C-D), leido gerokai sumažinti ląstelių gyvybingumą OLFM4 numušti ląstelių, lyginant su HK kontrolės ląstelės (P < 0,01). Ypač įdomūs yra išvada, kad OLFM4 triuškinantis ląsteles, o ne HK kontrolinių ląstelių gydomi 10 ~ 1000 mkm O 2O 2 eksponuojama daugiau garsių apoptozinių procentas palyginti su gydytų PBS maketas (P < 0,01) ( 5A-B pav.) Panašūs rezultatai taip pat buvo pastebėtas TNF alfa gydytų OLFM4 triuškinantis ląstelių (pav 5C-D). Kitaip tariant, OLFM4 numušti sustiprintą H 2O 2 arba TNF α sukeltos apoptozės skrandžio vėžio ląsteles, nurodant naikinimui OLFM4 padarė SGC-7901 ir MKN45 ląstelės jautresni gydymo H 2O 2 arba TNF α. 5 pav atsakas OLFM4 triuškinantis SGC-7901 ir MKN45 ląstelių apoptozę skatinančiais agentais H 2 O 2 ar TNF alfa. OLFM4 nokdaunas ir HK kontrolės ląstelės buvo gydomi H2O2 (A ir B) ar TNF alfa (C ir D), kaip nurodyta dozėmis 12 h. Ląstelių gyvybingumas buvo matuojamas pagal BTS-1 tyrimo (A-D kairė plokštes) ir išreikštas vidutinės OD vertės (450 nm) (n = 3). Iš apoptozės ląstelių procentas buvo nustatomas pagal FCM (A-D dešinysis plokštės) ir išreikštas vidutinės apoptozės procentais (n = 3). * P < 0,05, ** p < 0,01 vs HK kontroline grupe.
Kaspaze 3 veikla užsiima H2O2 ar TNF alfa sukeltos apoptozės į OLFM4 trankyti-žemyn ląstelės
Pirmiau pateikti rezultatai rodo, kad numušti iš OLFM4 gali padidinti H 2O 2 arba TNF α-skatino apoptozę. Norėdami dar kartą patikrinti, ar kaspazės-3 įjungiamas H 2O 2 arba TNF α sukeltos apoptozės OLFM4 triuškinantis ląsteles, kitą kartą aptikta kaspaze 3 aktyvavimo H 2O 2 arba TNF alfa gydytų ląsteles naudojant spalviniu testu. Kaip parodyta 6a paveikslas, gydymo H 2O 2 arba TNF α ir lėmė daug daugiau stiprinimą kaspazės-3 veiklos OLFM4 triuškinantis ląstelių negu HK kontrolinių ląstelių (p < 0,01), o tai rodo kaspaze 3 veikla dalyvauja H 2O 2 arba TNF α sukeltos apoptozės OLFM4 triuškinantis ląsteles. Norėdami dar kartą patikrinti, ar H 2O 2 arba TNF α sukeltos apoptozės priklauso nuo kaspaze 3 veiklos Z-VAD-FMK, kaspazės inhibitorius buvo naudojamas iki H gydymo 2O 2 arba TNF α. Pirminio apdorojimo Z-VAD-fmk žymiai susilpnintas H 2O 2 arba TNF α-sukeltas ląstelių apoptozę, taip pat kaspazė-3 aktyvumas abiejų OLFM4 triuškinantis ląstelių (P <0.01) (pav 6C-D ), nurodant, kad O 2O 2 arba TNF α sukeltos apoptozės yra kaspazės-3 priklauso į OLFM4 triuškinantis ląsteles. 6 pav dalyvavimas kaspazės-3 veiklos H 2 O 2 ar TNF α sukeltos apoptozės į OLFM4 triuškinantis SGC-7901 ir MKN45 ląsteles. (A-B), Padidėjęs kaspazės-3 aktyvumą H2O2 ar TNF alfa gydytų OLFM4 triuškinantis ląsteles. OLFM4 Klojinius išardomi ir HK-kontrolės ląstelės buvo gydomi 10 mkm H2O2 (A) arba 10 ng /ml TNF alfa (B), kad 12 h. Kaspazės-3 veikla buvo matuojamas naudojant spalviniu testu ir išreikštas klosčių pokyčius. ** P < 0,01, lyginant su PBS maketas grupė (n = 3). (C-D) Reversed ląstelių apoptozę pagal kaspazė inhibitoriaus OLFM4 triuškinantis ląsteles. Ląstelės buvo gydomi vien H2O2 ar TNF alfa su nurodytomis dozėmis kaip nurodyta pirmiau minėtų ar išvalytos su 20 mkm Z VAD-FMK 2 h prieš H2O2 ar TNF alfa gydymą. Iš apoptozinių ląstelių procentas buvo nustatomas pagal FCM. Duomenys apima priemones ± SN iš trijų nepriklausomų eksperimentų. ** P < 0,01 vs H2O2 (C) TNF alfa (D) gydomiems OLFM4 triuškinantis ląstelių grupė.
Diskusijos
Neseniai kaupimo duomenys parodė OLFM4 dažnai ekspresija įvairių tipų žmogaus navikų, įskaitant skrandžio vėžio, ir tai buvo manoma, kad vaidina svarbų vaidmenį kuriant ir progresavimo skrandžio kancerogenezėje [19, 20]. Nors ankstesni tyrimai parodė, kad OLFM4 dalyvauja apoptozė ir naviko augimą, naujausi stebėjimai taip pat rodo, kad ląstelių ar audinių poveikis atskiriems gali egzistuoti už OLFM4 geno. Palyginti mažai žinoma dėl naviko augimui ir apoptozė pagrindinės skrandžio vėžio konkrečių OLFM4 išraiška. Norėdami geriau suprasti šio vaidmens pakitusiu OLFM4 į žmogaus skrandžio vėžio, eksperimentinė yra reikalinga parama patvirtinti, kad OLFM4 geno skrandžio vėžio vaidmenį.
Įrodyta, kad nenormalus išraiška hGC-1 gali būti reglamentuotas tuo transkripcijos arba posttranscriptional lygio [13]. Mūsų dabartinių darbų, mes tiesiogiai ištirti OLFM4 baltymo ekspresija modelis skrandžio vėžio ląsteles ir normalių GES-1 ląstelių. SGC-7901 ir MKN45 ląstelės išreiškia santykinę aukštos OLFM4 lygį buvo pasirinktos šiame tyrime. Nuo sumažinant tikslinę genų ekspresiją genetinių priemonėmis žinomų ląstelių linijų yra naudinga geriau suprasti savo vaidmenį palaikant piktybinis fenotipą ypač analizuojant genus, kurie yra būtini ląstelių išlikimo [21], mes generuoja stabilias klonas baseinai SGC-7901 ir MKN45 išreikšti OLFM4-siRNA arba plakta HK kontrolę plazmidės pagrindo siRNA požiūrio ir patvirtino trankyti į apačią efektyvumą OLFM4 geną mRNR ir baltymų lygius KRL-PGR ir Imunoblotingo.
Mūsų dabartiniai darbai rodo, kad OLFM4 vaidina esminį vaidmenį skrandžio vėžio tumorigenesis. Nokdaunas iš OLFM4 slopina ląstelių proliferaciją ir inkaravimo nepriklausomas sugebėjimą augti in vitro. Ksenografiniuose navikas modelis in vivo taip pat reiškia, kad sumažėjo OLFM4 gali slopinti auglio augimą žmogaus skrandžio vėžio ląsteles. Šie rezultatai rodo, kad OLFM4 vaidina svarbų vaidmenį ląstelių proliferaciją skrandžio vėžio ląsteles. Mūsų rezultatai taip pat pastebėjo, kad grandininį žemyn OLFM4 neturėjo įtakos apoptozės ir kaspazė-3 ir 9 aktyvavimų į OLFM4 triuškinantis ląstelių greitį, o tai rodo, kad apoptozė gali būti ne mechanizmo, lemiančio naviko augimo slopinimą. Taigi, mes teigiame, kad OLFM4 išraiška nėra svarbus vėžio ląstelių išlikimas, kuris pagal neseniai pastebėjimu, kad genetiniai grandininį iš pelėms OLFM4 parodyti normalų vystymąsi bei hematopoetinei fenotipų [17]. Norėdami papildomai apibūdinti mechanizmo, lemiančio augimo slopinimą, mes atliekame ląstelių ciklo analizę ir paaiškėjo, kad slopinimas OLFM4 išraiškos sukelta skrandžio vėžio ląsteles kauptis G1 fazėje ląstelės ciklo, o tai rodo, kad žemyn reguliuojama OLFM4 gali daryti slopinančiu poveikiu ląstelių augimo mechanizmas reguliuoja ląstelės ciklą, nėra susiję apoptozę skrandžio vėžio ląsteles.
rezistencijos vėžinių ląstelių apoptozės indukcija yra vienas iš pagrindinių veiksnių, atsakingų už daugelį įprastų gydymo priešvėžiniais preparatais, kurie naudoja priešvėžinių agentų ir spinduliuotės nepakankamumas. Todėl, apoptozės kontrolė vėžinių ląstelių yra kritinės biologinio ir klinikinė reikšmė [22, 23]. Anti-aprotoninis veikla yra dar vienas svarbus funkcija OLFM4 geno [2]. Visų pirma, H 2O 2-sukeltas ląstelinis apoptozę buvo sumažintas, ekspresija OLFM4 į prostatos vėžys ląstelių linijos [2]. Be to, MKN45 ląstelės buvo parodyta rezistencijos gebėjimą TNF α-sukeltos apoptozės [24]. Atsižvelgiant į šias išvadas, mes iškėlė hipotezę, kad triuškinantis iš OLFM4 išraiškos gali sustiprinti H 2O 2 arba TNF α-sukeltas apoptozę skrandžio vėžio ląsteles. Čia mes parodėme, kad grandininį žemyn OLFM4 veiksmingai pagerinti ląstelių apoptozė reaguojant į H 2O 2 ar TNF alfa stimuliacija MKN45 taip pat SGC-7901 ląstelių, tai rodo, blokuoja OLFM4 gali padidinti skrandžio vėžio jautrumą ląstelės po H buvimas 2O 2 arba TNF α.
Kaip ji yra gerai žinoma, kad kaspazė-3, kuris yra pagrindinis vykdomasis molekulė pagal apoptozės keliu, vaidina svarbų vaidmenį apoptozinių procesų veislės ląstelių. Mes toliau nagrinėjo kaspazės-3 aktyvavimo OLFM4 triuškinantis ir HK kontrolės ląstelių buvimą ar nebuvimą kaspazės inhibitorių Z-VAD-FMK. Matėme, kad H gydymą 2O 2 arba TNF alfa ženkliai iki reglamentuojamo kaspaze 3 veiklos OLFM4 triuškinantis ląstelių negu HK kontrolinių ląstelių, o prieš gydymą su Z-VAD-FMK atvirkštine kaspazės-3 aktyvumą, taip pat kaip H 2O 2 arba TNF alfa sukeltos apoptozės. Rezultatai rodo, kad O 2O 2 arba TNF α sukeltos apoptozės į OLFM4 triuškinantis ląstelių kaspazės-3 priklausomi. Remiantis dabartinėmis duomenimis, tai suprantama, kad iki reguliuojama OLFM4 leidžia skrandžio vėžio ląsteles atsispirti apoptozę indukcijos sumažinant imlumą priešvėžinių vaistų.
Tiesą sakant, antagonistai OLFM4 buvo pranešta slopina kitose tipų platinimu vėžinės ląstelės, kaip antai žmogaus kasos vėžio Panc-1 ląstelių [8] ir žmogaus plaučių CANER SBC-1 ląstelių [9]. Tačiau taip pat buvo pastebėta prieštaringų rezultatų. Sumažėjęs OLFM4 iRNR slopina Panc-1 ląstelių proliferaciją S į G2 /M fazės areštas [8], kuris skiriasi nuo mūsų rezultatų, rodančių atidėtas G1 fazės pažangą skrandžio vėžio. Kai kurie svarbūs detales (arba priežasčių) gali paaiškinti šį neatitikimą. Pirma, naujausi tyrimai parodė, ląstelių ar audinių specifinis vaidmuo OLFM4 (skrandžio vėžio ląstelės ir kasos vėžio ląstelės), gali būti įtikinantys paaiškinimas šiam neatitikimui. Žinomiausias yra, OLFM4 išraiška iRNR lygio, bet ne baltymas lygis Panc-1 ląstelių sėkmingai matuojamas RT-PGR [8] o naujausioje ataskaitoje Kim et al., parodė, kad Panc-1 ląstelės neturi OLFM4 iRNR raiška [25], nurodant išraiška modelio ir vaidmenį OLFM4 geno Panc-1 ląstelių reikia papildomos patvirtinimą.
Nepaisant OLFM4 duslintuvai buvo įrodyta, kad slopinančiu poveikiu ląstelių augimą ir atsparumas sumažėjo H 2O 2 arba TNF α gydyti skrandžio vėžio ląstelių, tai nėra pašalinamas, kad kiti mechanizmai, taip pat gali būti reguliuojamas OLFM4 ir prisideda prie augimo slopinimo ir apoptozės valdymo signalizacijos, atsižvelgiant į tinklo Šķērsruna , Iš tiesų, OLFM4, taikinys genas NF-κB keliu [16, 17, 25], taip pat parodė neigiamą grįžtamąjį poveikį H. pylori
infekcijos sukeltas NF-κB aktyvacijos HEK 293 T ląstelės [6],

• Epidermio augimo faktoriaus receptorių struktūriniai pakitimai skrandžio vėžio
• Išraiškos COX-2 ir VEGF-C skrandžio vėžiu: koreliacijos su limfangiogenezės ir prognostinė implications