Nedbryting av OLFM4 genet hemmer cellevekst og øker allergi til hydrogen peroxide og tumornekrosefaktor-alfa indusert-apoptose i magekreftceller

Nedbryting av OLFM4 genet hemmer cellevekst og øker allergi til hydrogen peroxide og tumornekrosefaktor-alfa indusert-apoptose i magekreftceller
Abstract
Bakgrunn
Menneskelig olfactomedin 4 (OLFM4) genet er et utskilt glykoprotein oftere kjent som anti-apoptotiske molekyl GW112. OLFM4 er funnet å være ofte oppregulert i mange typer humane tumorer inkludert magekreft, og det ble antatt å spille betydelig rolle i progresjonen av magekreft. Selv om funksjonen av OLFM4 har vært indikert i mange studier, antyder nyere bevis sterkt en celle eller vevstype-avhengig rolle OLFM4 i cellevekst og apoptose. Målet med denne studien er å undersøke rollen magekreft spesifikke uttrykk for OLFM4 i cellevekst og apoptoseresistens.
Metoder
OLFM4 uttrykk ble eliminert av RNA interferens i SGC-7901 og MKN45 celler. Celleproliferasjon, forankrings-uavhengig vekst, cellesyklus og apoptose ble karakterisert in vitro. Tumorgenisitet ble analysert in vivo. Den apoptose og kaspase-3 aktivering som respons på hydrogenperoksyd (H 2o 2) eller tumornekrosefaktor-alfa (TNF α) ble vurdert i nærvær eller fravær av kaspase-inhibitor Z-VAD-FMK.
Resultater
eliminering av OLFM4 protein av RNA interferens i SGC-7901 og MKN45 celler hemmer betydelig tumorigenicity både in vitro og in vivo ved induksjon av celle G1 arrest (alle P < 0,01). OLFM4 knockdown utløste ikke opplagt celle apoptose men økte H 2o 2 eller TNF α-indusert apoptose og caspase-3-aktivitet (alle P < 0,01). Behandling av Z-VAD-FMK svekket caspase-3-aktivitet og betydelig snudd H 2o 2 eller TNF α-indusert apoptose i OLFM4 knockdown celler (alle P < 0,01).
Konklusjon
vår studie tyder på at nedbryting av OLFM4 hemmer tumorigenitet av magekreft SGC-7901 og MKN45 celler betydelig. Blokkering OLFM4 uttrykk kan bevisst mage kreftceller til H 2o 2 eller TNF α behandling ved å øke caspase-3 avhengig apoptose. En kombinasjon strategi basert på OLFM4 hemming og kreft narkotika behandling kan gi terapeutisk potensial i magekreft intervensjon.
Nøkkelord
Magekreft Olfactomedin 4 RNA interferens Cellevekst apoptoseresistens Bakgrunn
Menneskelig OLFM4 (olfactomedin 4, også kjent som HGC-1, GW112), opprinnelig betegnet humane klonede fra myeloide forløperceller etter granulocytt-kolonistimulerende faktor stimulering [1], er et utskilt glycoprotein mer kjent som anti-apoptotiske molekyl GW112 [2, 3]. OLFM4 er normalt uttrykt i benmarg, prostata, tynntarm, mage, tykktarm og bukspyttkjertel [1, 4]. Deretter økte OLFM4-nivåer ble også funnet i krypten epitel i betent tarmslimhinne av inflammatoriske tarmsykdommer [5] og i mage biopsi infisert med Helicobacter pylori [6, 7]. Mer nylig er oppregulert OLFM4 ekspresjon er beskrevet i lunge og bryst [8], prostata [3], gastrisk [3, 9] og bukspyttkjertel kreft [8, 9], så vel som i kolorektale adenomer [10-14].
Det har vært antydet at OLFM4 er involvert i cellulær prosess slik som apoptose og tumorvekst [2]. Selv om den cellulære funksjon OLFM4 har blitt undersøkt, disse resultatene ikke alltid sammenfallende. Overekspresjon av OLFM4 har vist seg å lette mus prostata tumor uteligger-C1-celler vekst i syngene C57 /BL6-mus [2], men hemmer human prostatacancer PC-3-celle proliferasjon [15]. Videre oppregulert OLFM4 viste en sterk anti-apoptotiske aktivitet i muse-lymfoid vene endotel-SVEC celler og humane adenokarsinomceller HeLa-celler [1, 2], mens de siste resultatene antydet en proapoptotiske virkning av OLFM4 i human myeloid leukemi HL-60-celler [16 ]. Bevis fra disse studiene tyder på at rollene OLFM4 i cellevekstkontroll og apoptose kan avhenge av celle eller vevstype [10, 13-15]. Til dags dato har imidlertid meget begrensede data vedrørende rollen til OLFM4 i cellevekst og apoptose profiler av magekreftcellene har blitt publisert.
I den foreliggende undersøkelse, analyserte vi OLFM4 protein ekspresjon i magekreftceller og normale human gastrisk epitelial GES-1 celler ved western blotting. Ved hjelp av plasmid-formidlet kort hårnål RNA (shRNA), hemmet vi OLFM4 ekspresjon i magekreft SGC-7901 og MKN45 celler for å observere celleproliferasjon, cellesyklus fase, apoptose in vitro og å vurdere dens tumorigene kapasitet in vivo. Vi har også undersøkt den apoptose og caspase-3-aktivering som respons på cytotoksiske midler, som H 2o 2 eller TNF α i nærvær eller fravær av kaspase-inhibitor Z-VAD-FMK mellom OLFM4 knockdown celler og HK kontrollcellene .
Metoder
cellekultur, reagenser og mus Bedrifter Den menneskelige magekreftceller BGC-823, HGC-27, SGC-7901, MKN28, MKN45 og humane normale mage epitelceller GES-1 celler ble opprettholdt DMEM medium (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS, GibcoBRL, USA), 100 E /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. H 2o 2 og TNF-α ble oppnådd fra Sigma (St. Louis, MO) og Z-VAD-FMK ble kjøpt fra Calbiochem (San Diego, California). BALB /C naken (nu /nu) mus (4-6 uker gamle, SPF grad, 20 ± 3 g) ble kjøpt fra Laboratory Animal Center of Chongqing Medical University (Chongqing, Kina). Alle prosedyrer ble utført i henhold til internasjonalt aksepterte etiske retningslinjer (NIH publikasjon nr. 85-23, revidert 1985).
Plasmid konstruerer og stabil transfeksjon
shRNA-mediert RNAi plasmid (pGenesil 1,1-siOLFM4) og en egge kontroll plasmid (pGenesil 1,1-HK) ble konstruert for å slå ned den endogene OLFM4 i SGC-7901 og MKN45 celler. Etter transfeksjon og neomycin (G418) utvalg, OLFM4 knock-down SGC-7901-siOLFM4, MKN45-siOLFM4 celler og egge SGC-7901-HK, MKN45-HK kontrollceller ble stabilt oppnådd henholdsvis (detaljer vist i tilleggsfiler 1: Supplerende data).
RNA ekstraksjon og kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR)
Total RNA i ulike celler eller tumorxenotransplantater ble ekstrahert med RNeasy Mini Kit (Qiagen, CA, USA), og ble etterfulgt av cDNA syntese bruker ReverTra Ace-α-første tråd cDNA syntese system (Toyobo, Osaka, Japan) som tidligere beskrevet [17]. Kvantitativ real-time PCR ble utført ved hjelp av 7500 real-time PCR system (Applied Biosystems) med SYBR-grønne som et fluorescerende fargestoff (Toyobo, Osaka, Japan) (Detaljene som vises i tilleggsfiler 1: Supplerende data). Brett endringer i genuttrykk ble bestemt ved å bruke "2 - ddCT". Metode [18]
Celleproliferering assay in vitro og celleviabilitet måling
celleproliferasjon og celle levedyktighet ble målt ved hjelp av Cell spredning WST-1 kit (Roche ) i henhold til produsentens instruksjoner. For celleproliferasjon, ble cellene sådd ut ved en tetthet på 1 x 10 3 celler per brønn i en 96-brønners plater og dyrket i 5 dager. Den optiske tetthet (450 nm) verdi ble påvist ved hjelp av mikroplateleser (TACAN, Swaziland) per dag. Hver analyse ble utført i tre eksemplarer. Når det gjelder måling av cellenes levedyktighet, ble celler (1 x 10 4 /brønn) ble sådd ut på 200 ul av mediet i 96-brønners plater. Etter 12 timer inkubasjon, H 2o 2 eller TNF α ble behandlet i angitte konsentrasjoner. Relativ absorbans ble målt som beskrevet i celleproliferasjon.
Forankrings-uavhengig vekst assay
forankrings-uavhengig vekst ble utført på bløt agar for å reflektere in vitro clonogenicity. I korthet ble celler (5 x 10 2) fra hver koloni ble suspendert i 0,3% agar i DMEM og deretter sådd ut på stivnede agar (0,5%) i 6-brønners skåler. Celler ble inkubert i 2 uker ved 37 ° C i 5% CO 2 før koloniene ble målt. Antall kolonier ble talt på 200 × forstørrelse i fem tilfeldige felt. Hver analyse ble utført i tre eksemplarer.
Strømningscytometri-analyse
Strømningscytometri (FCM) analyse ble utført for å vurdere cellesyklusprogresjon eller apoptose. (Detaljer er vist på Tilleggs fil 1: Supplerende data)
Caspase assay
Enzymatisk aktivitet av kaspase-3 og -9 ble målt ved anvendelse av en fluorometrisk analyse i henhold til en metode som er beskrevet tidligere [8]
Western blot-analyse.
Western blotting ble utført som beskrevet tidligere [17]. Følgende antistoffer ble brukt til western blotting: anti-OLFM4 (Abcam, Cambridge, UK) og anti-β-aktin (Santa Cruz, CA, USA) Den relative mengden av proteiner ble analysert ved hjelp av Antall Én programvare (Bio-Rad, Hercules , CA, USA) og normalisert til at av β-aktin (detaljene som vises i tilleggsfiler. 1: Xenotransplantat svulst modell Supplerende data)
Førti nakne mus ble delt inn i fire grupper tilfeldig. Hver gruppe ble injisert subkutant i ryggen med suspensjonen på 200 ul inneholdende 2 x 10 6-celler nevnt ovenfor, respektivt. Volumet av xenotransplantater ble serie målt. Musene ble avlivet etter 35 dager. De xenotransplantater ble skåret ut og veiet. Inhiberingsgraden av xenotransplantater ble beregnet i henhold til formelen: inhiberingsgrad (%) = 1-middelvekt (OLFM4 knock down-celler-injisert gruppe eller HK kontrollcellene-injiserte gruppen) /middelvekt (HK kontrollcellene-injisert gruppe) x 100%. Deretter svulstvev ble utsatt for total RNA isolering eller immunhistokjemi deteksjon.
Immunohistochemistry (IHC)
OLFM4 proteiner i tumorxenotransplantater ble analysert ved IHC ved bruk av kanin-anti OLFM4 (Abcam, Cambridge, UK) (detaljer vist på Tilleggs fil. 1: Supplerende data)
statistikker og data fra uavhengige eksperimenter ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD av minst tre forsøk. Sammenligninger mellom gruppene ble analysert ved tosidige Student t
-test eller ANOVA, når det er hensiktsmessig, og p-verdiene < 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant.
Resultater
Effektiv banke ned av OLFM4 gen av plasmid-mediert siRNA i magekreftceller
OLFM4 protein uttrykk mønsteret ble undersøkt i magekreft BGC-823, HGC-27, SGC-7901, MKN28, MKN45 celler og normale GES-1 kontrollceller (Figur 1a). OLFM4 protein definitivt uttrykker i alle disse magekreftceller og GES-1-celler. Spesielt SGC-7901 og MKN45 celler uttrykt relativt høyt nivå OLFM4 protein enn andre magekreftceller og GES-1 celler. Derfor ble SGC-7901 og MKN45 celler valgt for videre studier. Figur 1 Effektiv knockdown av OLFM4 av RNA interferens i magekreft SGC-7901 og MKN45 celler. A. Expression of OLFM4 protein i ulike magekreft cellelinjer. Ekspresjonsprofilen av OLFM4 protein ble analysert ved hjelp av western-blotting med β-aktin som en intern kontroll. GES-1-cellene ble tjente som normale kontrollceller. B. OLFM4 mRNA uttrykk i OLFM4 knockdown celler. Relativ ekspresjon av OLFM4 ble påvist ved QRT-PCR. β-aktin ble benyttet som en intern kontroll. Brett endringer i OLFM4 mRNA uttrykk ble bestemt ved bruk av to-ΔΔCt metoden. C. OLFM4 protein uttrykk i OLFM4 knockdown celler. OLFM4 protein-ekspresjon ble påvist ved western blotting. p-aktin-protein ble anvendt som en intern kontroll. Representanter for tre forsøk er vist. ** P < 0,01 vs. HK kontrollceller (n = 3).
Til nedregulerer OLFM4 uttrykk, ble en plasmid-mediert shRNA targeting OLFM4 genet konstruert for å stabilt slå ned OLFM4 uttrykk i SGC-7901 og MKN45 celler. Som vist i figur 1B, ble OLFM4 mRNA-nivåer betydelig redusert i SGC-7901-siOLFM4 og MKN45-siOLFM4 celler i forhold til deres HK kontroll eller parentale celler (P < 0,01). Disse resultatene ble ytterligere bekreftet ved western-blotting-analyse (figur 1C). Det ble ikke observert noen signifikant forskjell i OLFM4 uttrykk mellom foreldre og HK kontrollceller. Nivåene av mRNA og protein for β-actin var lik mellom de ulike gruppene. Disse resultater antyder at et plasmid-formidlet OLFM4-siRNA kan spesifikt og effektivt slå ned OLFM4 nivå i magekreftceller. Gitt analysen fremgår ovenfor, derfor OLFM4 slå ned celler og HK kontrollceller ble valgt for videre etterforskning.
OLFM4 knockdown hemmer magekreft celle spredning og forankring uavhengig vekst in vitro
For å bestemme hvilken rolle OLFM4 i mage kreftcellevekst, undersøkte vi effekten av OLFM4-siRNA på celleveksten ved 1-5 dagers tidspunkt av WST-1-assay. Som vist i figur 2A, i alt to magecancercellelinjer, veksten av OLFM4 slå ned celler ble signifikant redusert sammenlignet med HK kontrollceller fra dag 3 (P 0,01). For ytterligere å undersøke betydningen av OLFM4 i tumorigenesis av magekreftceller in vitro, gjennomførte vi forankringsuavhengig vekst analyser og funnet SGC-7901 og MKN45 celler som uttrykker HK kontroller vokste godt i myk agar og danner distinkte kolonier. I motsetning til dette, OLFM4 knockdown SGC-7901 og MKN45 celler utviste en dramatisk reduksjon i antallet av myke agar kolonier (P < 0,01) (figur 2B), som viser egenskaper trans mindre enn de for kontrollcellene. Disse data indikerte at knock-down av OLFM4 kunne hemme magekreft celle spredning og forankring uavhengig vekst in vitro. Figur 2 knockdown av OLFM4 hemmer veksten av SGC-7901 og MKN45 celler in vitro og in vivo. A. Cellevekst kurve. Celleproliferasjon in vitro ble bestemt ved cellevekstkurve, som bestemt ved telling av celletallet (WST-1-analysen) i de SGC-7901-celler (venstre panel) og MKN45 celler (høyre panel). OD verdien (450 nm) ble tellet på de angitte dagene og presentert som middelcelletall (n = 3). B. forankrings-uavhengig vekst i bløt agar. Representative bilder av tre eksperimentene ble vist (øvre panel). Data representerer det midlere antall kolonier telles ved 200 x forstørrelse i 5 tilfeldig felt (lavere panel). C. Den midlere tumorvolum etter subkutan injeksjon av nakne mus med HK kontroll eller OLFM4 knockdown-celler ble målt ved de angitte tidspunkter. D. Representant svulster bilder på 35 dager etter subkutan injeksjon av indikerte cellene. E. Mean tumorvekt (venstre panel) og hemmende rate (høyre panel) i tumorxenotransplantater. Data representerer gjennomsnittlig tumorvekt av xenotransplantater (gjennomsnitt ± SD, n = 10). ** P < 0,01 vs. HK kontrollgruppen.
Vekst-hemmende effekt av redusert OLFM4 i mage tumorxenotransplantater
Videre har vi også utført subkutan svulst formative analyse i hårløse mus for å evaluere veksthemming effekten av nedregulert OLFM4 in vivo. Nude mus ble subkutant injisert med OLFM4 knockdown eller HK kontrollceller. Tumorvolumer per 4 dager og tumorvekt på 5 uker ble målt henholdsvis etter subkutan injeksjon. Som vist i figur 2C-D, enten tumorvolumet eller tumorvekt fremstilt ved OLFM4 knock down SGC-7901 og MKN45 cellene hadde signifikant redusert vekst sammenlignet med tumorer som er produsert i mus injisert med HK kontroll-transfekterte celler (P < 0,01). Den hemmende frekvensen av SGC-7901 og MKN45 slå ned celler-injisert gruppe på tumorvekst var 40,29% og 37,48% på henholdsvis (figur 2E).
For ytterligere å sikre OLFM4 uttrykk indeedly forstummet etter subkutan injeksjon av nakne mus, vi også evaluert OLFM4 uttrykk i tumorxenotransplantater bruker QRT-PCR og IHC. Tilsvarende in vitro, OLFM4 mRNA nivå i tumorxenotransplantater produsert av OLFM4 knockdown celler viste også en betydelig nedgang sammenlignet med HK kontroll svulster xenografter (P < 0,01) (figur 3A). I samsvar med resultatene av QRT-PCR ble det betydelig reduksjon av OLFM4 protein også observert i tumorxenografter av IHC (P < 0,01) (figur 3B og 3C). Høyere gråtoner og sterkere positivt signal ved DAB visualisering ble funnet i tumorxenotransplantater av HK kontrollceller-injisert gruppe. Tvert imot, ble svak brune flekker observert i tumorxenotransplantater av OLFM4 knockdown celler injisert gruppe. I tillegg ble flere store nekrose region ble observert i tumorxenografter produsert av HK kontrollceller på grunn av en rask vekst av HK kontrollceller (figur 3B øvre panel). Disse dataene gitt en sterk indikasjon på at OLFM4 uttrykk ved mRNA og proteinnivåer er stabilt hemmet faktisk in vivo. Tatt sammen, både in vitro og in vivo-eksperimenter tyder på at OLFM4 knockdown hemmer veksten av magekreftceller. Figur 3 QRT-PCR og IHC påvisning av OLFM4 i tumorxenotransplantater. A. QRT-PCR for OLFM4 mRNA i tumorxenotransplantater. Brett endringer i OLFM4 mRNA ble bestemt ved bruk av to-ΔΔCt metoden. p-aktin-genet ble anvendt som en intern kontroll. B. H & E-farging (øvre panel) og IHC for OLFM4 protein (nedre panel) i tumorxenotransplantater. Representative bilder (200 ×) er vist. N, nekrose. C. Kvantifisering analyse av OLFM4 uttrykk. Den gjennomsnittlige verdien ble målt fra fem tilfeldig ulike felt under mikroskop (400 ×) ved hjelp av Image-Pro PLUS V6.0. Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD. ** P < 0,01 vs. HK kontrollgruppen.
OLFM4 knock-down forsinkelser G1 til S-overgangen, men utløser ikke innlysende apoptose i magekreftceller
Med våre observerte hemmende virkning på cellevekst in vitro og in vivo, har vi forsøkt å bestemme enten forbedret apoptose eller forsinket cellesyklusprogresjon var forbundet med vekst-inhibering. Vi evaluerte først virkningen av redusert OLFM4 på cellesyklusprogresjon. Som vist i figur 4A, både OLFM4 knockdown SGC-7901 og MKN45 celler viste betydelige økte antall i G1 fase og redusert antall i S-fasen, i motsetning til deres HK kontrollceller (p 0,01). Ingen signifikante forskjeller ble observert i G2 /M-fasen, noe som indikerer en typisk G1 forsinkelse av cellesyklus. Figur 4 Vurdering av cellesyklusfordeling, apoptotiske celler og caspase-3/9 aktivering i OLFM4 slå ned magekreftceller. A. Cellesyklus analyse. Endringer i cellesyklus distribusjon av SGC-7901-HK, SGC-7901-siOLFM4 og MKN45-HK, ble MKN45-siOLFM4 celler analysert av FCM. Data representerer gjennomsnittlig prosent av cellesyklus-fasefordeling (n = 3). B. Cell apoptose analyse. Apoptose ble estimert med AnnexinV-PE /7-AAD farging av FCM. Data representerer gjennomsnittet apoptotiske cellen prosentandel (n = 3). C. Caspase-3 og -9 aktiveringer. Caspase-3, 9 aktiveringer mellom indikerte cellene vist. ** P < 0,01 vs. HK kontrollgruppen.
For å avgjøre om apoptose er involvert i denne veksthemming, ved siden utførte vi celle apoptose analyse. Interessant, redusert OLFM4 ekspresjon kan føre til vesentlige endringer i apoptose (figur 4B), som er i overensstemmelse med den cellesyklusanalyse viser ingen tydelig sub-G1 fase i de undersøkte celler. For ytterligere å undersøke endringer av apoptotiske signaler, ble caspase-3 /-9 aktivitet også identifisert av kolorimetriske aktiveringsanalyser. Både caspase-3 og -9 aktive viste ingen signifikante endringer etter knockdown av OLFM4 i SGC-7901 og MKN45 celler (Figur 4C). Disse resultater antyder at nedregulering av OLFM4 kan utøve en inhiberende virkning på cellevekst ved å regulere cellesyklusprogresjon ikke involverer apoptose i magekreftceller.
Sletting av OLFM4 sensitizes magekreftceller til H2O2 eller TNF α-indusert apoptose
den distinkte effekten av H 2o 2 eller TNF α på apoptose mellom OLFM4 slå ned og HK kontrollceller ble også undersøkt. OLFM4 slå ned eller HK kontrollceller ble behandlet med 10, 100 og 1000 uM H 2o 2 eller 5, 10 og 50 ng /ml TNF α respektivt. Celleviabilitet og apoptose ble vurdert. Som vist i figur 5A-D, ble en doseavhengig reduksjon i cellelevedyktighet observeres i H 2o 2 eller TNF α-behandlede OLFM4 slå ned cellene. Videre behandling av 10 uM H 2o 2 (figur 5A-B) eller 10 ng /ml TNF-a (Figur 5C-D) førte til en betydelig reduksjon i celleviabilitet i OLFM4 knock down-celler sammenlignet med HK kontrollceller (p 0,01). Av spesiell interesse er funn som OLFM4 knockdown celler fremfor HK kontrollceller behandlet med 10 ~ 1000 mikrometer H 2o 2 utstilt mer fremtredende apoptotiske prosenter i forhold til de som ble behandlet med PBS mock (P < 0,01) ( Figur 5A-B). Lignende resultater ble også sett i TNF a-behandlede OLFM4 knockdown-celler (Figur 5C-D). Med andre ord, OLFM4 slå ned forbedret H 2o 2 eller TNF α-indusert apoptose i magekreftcellene, hvilket indikerer delesjon av OLFM4 laget SGC-7901 og MKN45 cellene mer følsomme for behandling av H 2O 2 eller TNF α. Figur 5 Response av OLFM4 knockdown SGC-7901 og MKN45 celler til apoptose-induserende midler H 2 O 2 eller TNF alfa. OLFM4 knockdown og HK kontrollceller ble behandlet med H2O2 (A og B) eller TNF α (C og D) som angitt doser i 12 timer. Cellelevedyktigheten ble målt ved hjelp av WST-1-assay (A-D venstre paneler) og uttrykt i den midlere OD verdien (450 nm) (n = 3). Prosentandelen av de apoptotiske celler ble bestemt ved FCM (A-D høyre panel) og uttrykt i den midlere apoptotiske prosentandel (n = 3). * P < 0,05, ** P < 0,01 vs. HK kontrollgruppen.
Caspase-3-aktivitet er involvert i H2O2 eller TNF α-indusert apoptose i OLFM4 knock-down cellene
Ovennevnte Resultatene indikerte at slå ned på OLFM4 kunne øke H 2o 2 eller TNF α-stimulerte apoptose. For ytterligere å verifisere om caspase-3 er aktivert i H 2o 2 eller TNF α-indusert apoptose i OLFM4 knockdown celler, vi neste oppdaget caspase-3-aktivering i H 2o 2 eller TNF a-behandlede celler ved hjelp av kolo analysen. Som vist i figur 6A, behandling av H 2o 2 eller TNF α resulterte i mye mer forbedring av caspase-3 aktivitet i OLFM4 knockdown celler enn HK kontrollceller (P < 0,01), noe som tyder caspase-3 aktivitet er involvert i H 2o 2 eller TNF α-indusert apoptose i OLFM4 knockdown celler. For ytterligere å verifisere om H 2o 2 eller TNF α-indusert apoptose er avhengig av caspase-3-aktivitet, Z-VAD-FMK, en caspase inhibitor ble brukt før behandling av H 2o 2 eller TNF α. Forbehandling av Z-VAD-FMK betydelig svekket H 2o 2 eller TNF α-indusert celle apoptose samt caspase-3 aktivitet i begge OLFM4 knockdown-celler (P < 0,01) (figur 6C-D ), noe som indikerer at H 2o 2 eller TNF α-indusert apoptose er caspase-3 avhengige i OLFM4 knockdown celler. Figur 6 Involvering av caspase-3-aktivitet i H 2 O 2 eller TNF α-indusert apoptose i OLFM4 knockdown SGC-7901 og MKN45 celler. (A-B) Økt caspase-3-aktivitet i H2O2 eller TNF alfa-behandlede OLFM4 knockdown celler. OLFM4 knockdown og HK-kontrollceller ble behandlet med 10 uM H2O2 (A) eller 10 ng /ml TNF α (B) i 12 timer. Caspase-3 aktivitet ble målt ved å bruke kolorimetrisk analyse og uttrykt i brette endringer. ** P < 0,01 versus PBS mock-gruppen (n = 3). (C-D) Reversert celle apoptose av kaspase-inhibitor i OLFM4 knockdown-celler. Celler ble behandlet med H2O2 eller TNF α alene med angitte doser som ovenfor nevnt eller forbehandlet med 20 pM Z-VAD-FMK 2 timer før den H2O2 eller TNF α behandling. Prosentandelen av apoptotiske celler ble bestemt ved FCM. Data representerer gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. ** P < 0,01 vs. H2O2 (C) eller TNF α (D) -behandlet OLFM4 knockdown celler gruppe.
Diskusjon
Nylig samler data demonstrert OLFM4 ofte overuttrykt i mange typer humane tumorer inkludert magekreft, og det ble antatt å spiller en avgjørende rolle i utvikling og progresjon av magekreftutvikling [19, 20]. Selv om det tidligere studier har vist at OLFM4 er involvert i apoptose og tumorvekst, nylige observasjoner tyder også på at celle- eller vevs-spesifikke effekter kan foreligge for den OLFM4 genet. Relativt lite er kjent når det gjelder tumorvekst og apoptose underliggende magekreft-spesifikke OLFM4 ekspresjon. For å få en bedre forståelse av denne rollen for den endrede OLFM4 i human magekreft, er eksperimentell støtte som er nødvendig for å validere rolle OLFM4 genet i magekreft.
Det har vist seg at unormal uttrykk for HGC-en kan reguleres på transkripsjons eller posttranskripsjonelt nivå [13]. I vår nåværende arbeid, vi direkte undersøkt OLFM4 protein uttrykk mønster i magekreftceller og normale GES-1 celler. SGC-7901 og MKN45 celler uttrykker relative høye OLFM4 nivåer ble valgt for denne studien. Siden redusere målet genuttrykk av genetiske hjelp i etablerte cellelinjer er nyttig for en bedre forståelse av sin rolle i å opprettholde den ondartede fenotype spesielt i å analysere gener som er viktige for cellenes overlevelse [21], vi genererte stabile klone bassenger av SGC-7901 og MKN45 uttrykker OLFM4-siRNA eller egge HK kontroll av plasmid-baserte siRNA tilnærming og bekreftet knock-down effektivisere OLFM4 genet på mRNA og proteinnivåer ved QRT-PCR og Western blotting.
Våre nåværende arbeid viser at OLFM4 spiller en avgjørende rolle i magekreft tumorigenesis. Knockdown av OLFM4 hemmer celleproliferasjon og forankrings-uavhengig vekst evne in vitro. Xenograft tumormodellen in vivo antyder også at redusert OLFM4 kan hemme tumorvekst av humane magecancerceller. Disse resultatene indikerer at OLFM4 spiller en avgjørende rolle i celleproliferasjon av gastrisk kreft celler. Våre resultater også observert at knock-down av OLFM4 ikke påvirke frekvensen av apoptose og caspase-3 og 9 aktiveringer i OLFM4 knockdown celler, noe som tyder på at apoptose er kanskje ikke den underliggende mekanismen hemming av tumorvekst. Dermed postulerer vi at OLFM4 uttrykk er ikke avgjørende for kreft celle overlevelse, noe som er i samsvar med en fersk observasjon at genetiske knock-out mus for OLFM4 viser normal utvikling og blodkreft fenotyper [17]. For ytterligere å karakterisere mekanismen bak vekstinhibering, utførte vi cellesyklusanalyse og viste at inhibering av OLFM4 ekspresjon indusert magekreftceller til å akkumulere i G1-fasen av cellesyklusen, noe som tyder på at nedregulert OLFM4 kan utøve en inhiberende virkning på cellevekst etter en mekanisme som regulerer cellesyklusprogresjon ikke involverer apoptose i magekreftceller.
Resistens av tumorceller til induksjon av apoptose er en av de viktigste faktorene som er ansvarlig for svikt i mange konvensjonelle anticancer terapi som bruker anticancermidler og stråling. Derfor er kontroll apoptose i kreftceller av kritisk biologisk og klinisk viktighet [22, 23]. Anti-apoptotiske aktivitet er en annen viktig funksjon av OLFM4-genet [2]. Spesielt ble H 2o 2-indusert cellulær apoptose dempet ved overuttrykt OLFM4 i en prostatakreft-cellelinje [2]. Dessuten har MKN45 celler blitt vist en evne til motstand mot TNF α-indusert apoptose [24]. Gitt disse funnene, hypotese vi at knockdown av OLFM4 uttrykk kan forbedre H 2o 2 eller TNF α-indusert apoptose i magekreftceller. Her viste vi at knock-down av OLFM4 effektivt forbedret celle apoptose som svar på H 2o 2 eller TNF α stimulering i MKN45 samt SGC-7901 celler, noe som tyder på blokkering OLFM4 kan øke følsomheten av magekreft celler av tilstedeværelsen av H 2o 2 eller TNF α.
som det er vel kjent at caspase-3, en nøkkel utøvende molekyl av den apoptotiske reaksjonsvei, spiller en kritisk rolle i apoptotiske prosesser i en rekke av celler. Vi har videre undersøkt kaspase-3 aktivering i OLFM4 knockdown og HK kontrollceller i nærvær eller fravær av kaspase-inhibitor Z-VAD-FMK. Vi har observert at behandlingen av H 2o 2 eller TNF-a signifikant oppregulert Caspase-3-aktivitet i OLFM4 knockdown celler enn HK kontrollceller mens forbehandling med Z-VAD-FMK reversert caspase-3 aktivitet i tillegg som H 2o 2 eller TNF α-indusert apoptose. Resultatene indikerer at H 2o 2 eller TNF α-indusert apoptose i OLFM4 knockdown-celler er caspase-3-avhengig. Basert på de foreliggende data, er det tenkelig at oppregulert OLFM4 muliggjør magekreftceller til å motstå apoptose-induksjon ved å redusere følsomhet for anticancer-legemidler.
Faktisk har antagonister av OLFM4 blitt rapportert å hemme proliferasjon i andre typer av kreftceller, slik som humane kreft i bukspyttkjertelen PANC-1-celler [8] og human lunge caner SBC-1-celler [9]. Imidlertid har kontroversielle resultater også blitt observert. Redusert OLFM4 mRNA hemme PANC-1 celler spredning av S til G2 /M fase arrest [8], som er forskjellig fra våre resultater viser forsinket G1 fase fremgang i magekreft. Visse viktige detaljene (eller årsaker) kan forklare dette avviket. Først, som senere studier antydet, en celle eller vev spesifikke rollen til OLFM4 (magekreftceller og kreft i bukspyttkjertelen celler), kan være en overbevisende forklaring på dette avvik. Det mest bemerkelsesverdige er, OLFM4 uttrykk på mRNA-nivå, men ikke proteinnivået i PANC-1 celler ble vellykket målt ved hjelp av RT-PCR [8] mens den siste rapporten fra Kim et al. viste at PANC-1-celler ikke har noen OLFM4 mRNA-ekspresjon [25], noe som indikerer uttrykket mønster og rollen til OLFM4 genet i PANC-1-celler behov for ytterligere bekreftelse.
tross OLFM4 lyddemping ble vist av en hemmende virkning på cellevekst og en nedsatt motstand til H 2o 2 eller TNF α behandling i magekreftceller, er det ikke elimineres at andre mekanismer kan også reguleres ved OLFM4 og bidrar til veksthemming og apoptose styringssignaler, med tanke på crosstalk av nettverket . Faktisk OLFM4, et målgen av NF-kB veien [16, 17, 25], har også vist en negativ feedback-effekt på H. pylori-infeksjon
-indusert NF-kB-aktivering i HEK 293 T-celler [6],

• Epidermal vekstfaktor reseptor strukturelle endringer i mage cancer
• Uttrykk for COX-2 og VEGF-C i magekreft: korrelasjoner med lymphangiogenesis og prognostisk implications