Udtømning af OLFM4 genet inhiberer cellevækst og forøger sensibilisering over for hydrogenperoxid og tumornekrosefaktor-alfa-induceret apoptose i gastriske cancerceller

Udtømning af OLFM4 genet inhiberer cellevækst og forøger sensibilisering over for hydrogenperoxid og tumornekrosefaktor-alfa-induceret apoptose i gastriske cancerceller
Abstract
Baggrund
Humant olfactomedin 4 (OLFM4) genet er et udskilt glycoprotein mere almindeligt kendt som den anti-apoptotiske molekyle GW112. OLFM4 viser sig at være ofte opreguleret i mange typer af humane tumorer, herunder gastrisk cancer, og det mentes at spille en betydelig rolle i udviklingen af ​​mavekræft. Selvom funktionen af ​​OLFM4 er angivet i mange undersøgelser, tyder nylige beviser kraftigt en celle eller vævstype-afhængig rolle OLFM4 i cellevækst og apoptose. Formålet med denne undersøgelse er at undersøge, hvilken rolle mavekræft-ekspression af OLFM4 i cellevækst og apoptose modstand.
Metoder
OLFM4 ekspression blev elimineret af RNA-interferens i SGC-7901 og MKN45 celler. Celleproliferation, forankringsuafhængig vækst, cellecyklus og apoptose blev karakteriseret in vitro. Tumorgenicitet blev analyseret in vivo. Den apoptose og caspase-3-aktivering som respons på hydrogenperoxid (H 2O 2) eller tumornekrosefaktor-alfa (TNF α) blev vurderet i nærvær eller fravær af caspaseinhibitor Z-VAD-fmk.
Resultater Salg elimineringen af ​​OLFM4 protein ved RNA-interferens i SGC-7901 og MKN45 celler inhiberer signifikant tumorigenicitet både in vitro og in vivo ved induktion af celle G1 arrest (alle P < 0,01). OLFM4 knockdown ikke udløse indlysende celle apoptose men steg H 2O 2 eller TNF α-induceret apoptose og caspase-3 aktivitet (alle P < 0,01). Behandling af Z-VAD-FMK svækket caspase-3 og væsentligt vendt H 2O 2 eller TNF α-induceret apoptose i OLFM4 Knockdown celler (alle P < 0,01).
Konklusion
Vores undersøgelse tyder på, at udtømning af OLFM4 signifikant hæmmer tumorgenicitet af mavekræft SGC-7901 og MKN45 celler. Blokering OLFM4 udtryk kan bevidstgøre gastriske kræftceller til H 2O 2 eller TNF α behandling ved at øge caspase-3 afhængig apoptose. En kombination strategi baseret på OLFM4 hæmning og anticancer narkotika behandling kan give terapeutisk potentiale i mavekræft intervention.
Nøgleord
mavekræft Olfactomedin 4 RNA-interferens Cellevækst Apoptose modstand Baggrund
Menneskelig OLFM4 (olfactomedin 4, også kendt som HGC-1, GW112), oprindeligt betegnet human klonet fra myeloide precursorceller efter granulocyt koloni-stimulerende faktor stimulation [1], er et udskilt glycoprotein mere almindeligt kendt som anti-apoptotiske molekyle GW112 [2, 3]. OLFM4 udtrykkes normalt i knoglemarven, prostata, tyndtarm, mave, tyktarm og bugspytkirtel [1, 4]. Efterfølgende steg OLFM4 niveauer blev også fundet i krypten epitel af betændte kolonmucosa af inflammatoriske tarmsygdomme [5] og i gastriske biopsier inficeret med Helicobacter pylori [6, 7]. For nylig er opreguleret OLFM4 ekspression blevet beskrevet i lunge og bryst [8], prostata [3], gastrisk [3, 9] og pancreascancer [8, 9] samt i kolorektale adenomer [10-14].
Det er blevet foreslået, at OLFM4 er involveret i cellulær proces, såsom apoptose og tumorvækst [2]. Selv om den cellulære funktion af OLFM4 er blevet undersøgt, disse resultater ikke altid sammenfaldende. Overekspression af OLFM4 har vist sig at lette muse prostata tumor Tramp-C1 celler vækst i syngene C57 /BL6-mus [2], men inhiberer human prostatacancer PC-3-celleproliferation [15]. Desuden viste opreguleret OLFM4 en stærk anti-apoptotisk aktivitet i mus lymfoide vene endotelceller SVEC celler og humane adenocarcinom HeLa-celler [1, 2], mens de seneste resultater foreslog en proapoptotiske effekt af OLFM4 i humane myeloid leukæmi HL-60 celler [16 ]. Beviser fra disse studier antyder stærkt, at roller OLFM4 i cellevækst kontrol og apoptose kan afhænge af celle- eller vævstypen [10, 13-15]. Til dato, men meget begrænsede data vedrørende rolle OLFM4 i cellevækst og apoptose profiler af mavekræft celler er blevet offentliggjort.
I nærværende undersøgelse, analyserede vi OLFM4 proteinekspression i gastriske cancerceller og normale menneskelige gastrisk epitel GES-1-celler ved Western blotting. Ved anvendelse af plasmid-medieret korte hårnål RNA (shRNA), inhiberede vi OLFM4 ekspression i gastrisk cancer SGC-7901 og MKN45 celler at observere celleproliferation, cellecyklusfase, apoptose in vitro og at vurdere dets tumorigen evne in vivo. Vi udforskede også apoptose og caspase-3-aktivering som reaktion på cytotoksiske midler, såsom H 2O 2 eller TNF α i nærvær eller fravær af caspaseinhibitor Z-VAD-fmk mellem OLFM4 Knockdown celler og HK kontrolceller .
Metoder
cellekultur reagenser og mus
Den menneskelige gastrisk kræftceller BGC-823, HGC-27, SGC-7901, MKN28, MKN45 og humane normale gastriske epitel GES-1 celler blev opretholdt DMEM-medium (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS, GibcoBRL, USA), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. H 2O 2 og TNF-α blev opnået fra Sigma (St. Louis, MO) og Z-VAD-fmk blev indkøbt fra Calbiochem (San Diego, CA). BALB /C nøgen (nu /nu) mus (4-6 uger gamle, SPF grad, 20 ± 3 g) blev købt fra Laboratory Animal Center of Chongqing medicinske universitet (Chongqing, Kina). Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med de internationalt anerkendte etiske retningslinjer (NIH publikation nr. 85-23, revideret 1985).
Plasmid konstruerer og stabil transfektion
shRNA-medieret RNAi plasmid (pGenesil 1.1-siOLFM4) og en kodet kontrol plasmid (pGenesil 1.1-HK) blev konstrueret til at vælte den endogene OLFM4 i SGC-7901 og MKN45 celler. Efter transfektion og neomycin (G418) udvælgelse, OLFM4 knock-down SGC-7901-siOLFM4, MKN45-siOLFM4 celler og scrambled SGC-7901-HK, MKN45-HK kontrol celler blev stabilt opnåede henholdsvis (detaljer vist i supplerende fil 1: Supplerende data).
RNA-ekstraktion og kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR)
Totalt RNA i forskellige celler eller tumorxenotransplantater blev ekstraheret under anvendelse af RNeasy Mini Kit (Qiagen, CA, USA), og blev efterfulgt af cDNA-syntese ved hjælp af ReverTra Ace-α-første streng cDNA syntese-system (Toyobo, Osaka, Japan) som tidligere beskrevet [17]. Kvantitativ realtids-PCR blev udført under anvendelse 7500 real-time PCR-system (Applied Biosystems) med SYBR-Green som et fluorescerende farvestof (Toyobo, Osaka, Japan) (viste detaljer i supplerende fil 1: Supplerende data). Fold ændringer i genekspression blev bestemt ved anvendelse af "2 - ddCT". Metoden [18]
Celleproliferationsassay in vitro og cellelevedygtighed måling
Celleproliferation og cellelevedygtighed blev målt under anvendelse Celleproliferation WST-1-kittet (Roche ) ifølge producentens instruktioner. For celleproliferation blev celler podet med en tæthed på 1 x 10 3 celler pr brønd af en 96-brønds plader og dyrket i 5 dage. Den optiske densitet (450 nm) værdi blev detekteret ved anvendelse af Microplate Reader (TACAN, Swaziland) per dag. Hvert assay blev udført tre gange. Som til måling af cellelevedygtighed, celler (1 x 10 4 /brønd) blev podet ved 200 pi medier i 96-brønds plader. Efter 12 h inkubation, H 2O 2 eller TNF α behandledes i angivne koncentrationer. Relativ absorbans blev målt som beskrevet i celleproliferation.
Forankringsuafhængig vækst assay
forankringsuafhængig vækst blev udført på blød agar for at afspejle in vitro clonogenicity. Kort beskrevet blev celler (5 x 10 2) fra hver koloni blev suspenderet i 0,3% agar i DMEM og derefter udpladet på størknet agar (0,5%) i 6-brønds plader. Celler blev inkuberet i 2 uger ved 37 ° C i 5% CO 2 før kolonierne blev målt. Antallet af kolonier blev talt ved 200 × forstørrelse til fem tilfældige felter. Hvert assay blev udført tre gange.
Flowcytometrianalyse
flowcytometri (FCM) analyse blev udført for at vurdere cellecyklusprogression eller apoptose. (Detaljer er vist i supplerende fil 1: Supplerende data)
Caspase-assay
enzymatiske aktivitet af caspase-3 og -9 blev målt under anvendelse af et fluorometrisk assay ifølge en fremgangsmåde beskrevet tidligere [8]
Western blot-analyse.
Western blotting blev udført som tidligere [17] beskrevne. Følgende antistoffer blev anvendt til Western blotting: anti-OLFM4 (Abcam, Cambridge, UK) og anti-β-actin (Santa Cruz, CA, USA) Den relative mængde af proteiner blev analyseret under anvendelse Mængde One software (Bio-Rad, Hercules , CA, USA) og normaliseret til den af ​​β-actin (viste detaljer i supplerende fil 1:. Supplerende data)
xenograft tumor model
Fourty nøgne mus blev inddelt i fire grupper tilfældigt. Hver gruppe blev injiceret subkutant i ryggen med suspensionen af ​​200 pi indeholdende 2 × 10 6 celler ovennævnte henholdsvis. Volumenet af xenotransplantater blev serielt målt. Musene blev aflivet efter 35 dage. De xenotransplantater blev udskåret og vejet. De hæmning satser xenografter blev beregnet efter formlen: hæmning rate (%) = 1-betyde vægt (OLFM4 vælte celler-injicerede gruppe eller HK kontrol celler-injicerede gruppe) /gennemsnitlig vægt (HK kontrol celler-injicerede gruppe) × 100%. Derefter tumor væv var genstand for total RNA isolering eller immunhistokemi afsløring.
Immunhistokemi (IHC)
OLFM4 proteiner i tumorxenoplantater blev analyseret ved IHC under anvendelse af kanin-anti OLFM4 (Abcam, Cambridge, UK) (detaljer vist i Yderligere fil 1:. Supplerende data)
Statistik
data fra uafhængige forsøg blev udtrykt som middelværdi ± SD af mindst tre forsøg. Sammenligninger mellem grupper blev analyseret af to-tailed Students t
-test eller ANOVA, hvad der er relevant, og p-værdier < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.
Resultater
Effektiv knock ned af OLFM4 gen ved plasmid-medieret siRNA i gastriske kræftceller
OLFM4 proteinekspression mønster blev undersøgt i mavekræft BGC-823, HGC-27, SGC-7901, MKN28, MKN45 celler og normale GES-1 kontrol celler (Figur 1A). OLFM4 protein absolut udtrykker i alle disse gastriske cancerceller og GES-1-celler. Især SGC-7901 og MKN45 celler udtrykte relativ højt niveau OLFM4 protein end andre gastriske cancerceller og GES-1-celler. Derfor blev SGC-7901 og MKN45 celler valgt til yderligere undersøgelser. Figur 1 Effektiv knockdown af OLFM4 ved RNA-interferens i gastrisk cancer SGC-7901 og MKN45 celler. A. Ekspression af OLFM4 protein i forskellige gastriske cancercellelinier. Ekspressionsprofil af OLFM4 protein blev analyseret under anvendelse af western blotting med β-actin som en intern kontrol. GES-1 celler blev serveret som normale kontrol celler. B. OLFM4 mRNA-ekspression i OLFM4 Knockdown celler. Relativ ekspression af OLFM4 blev påvist ved QRT-PCR. β-actin blev anvendt som en intern kontrol. Fold ændringer i OLFM4 mRNA-ekspression blev bestemt ved anvendelse af 2-ΔΔCt metode. C. OLFM4 proteinekspression i OLFM4 Knockdown celler. OLFM4 proteinekspression blev detekteret ved western blotting. p-actin-protein blev anvendt som en intern kontrol. Repræsentanter for tre eksperimenter er vist. ** P < 0,01 vs HK kontrol celler (n = 3).
At nedregulere OLFM4 udtryk blev et plasmid-medieret shRNA målrettet OLFM4 gen konstrueret til stabilt banke ned OLFM4 udtryk i SGC-7901 og MKN45 celler. Som vist i figur 1B, blev OLFM4 mRNA-niveauer signifikant reduceret i SGC-7901-siOLFM4 og MKN45-siOLFM4 celler sammenlignet med deres HK kontrol eller parentale celler (P < 0,01). Disse resultater blev yderligere bekræftet ved Western blotting-analyse (figur 1C). blev ikke observeret nogen signifikant forskel i OLFM4 udtryk mellem forældre og HK kontrol celler. Niveauerne af mRNA og protein for β-actin var ens blandt de forskellige grupper. Disse resultater antyder, at et plasmid-medieret OLFM4-siRNA specifikt og effektivt kan vælte OLFM4 niveau i gastriske cancerceller. I betragtning af analysen anført ovenfor, derfor OLFM4 vælte celler og HK kontrol celler blev valgt til yderligere undersøgelse.
OLFM4 knockdown hæmmer mavekræft celledeling og forankringsuafhængig vækst in vitro
at bestemme rolle OLFM4 i gastrisk cancercellevækst, undersøgte vi virkningen af ​​OLFM4-siRNA på cellevækst ved 1-5 dages tidspunktet ved WST-1 assay. Som vist i figur 2A, i alle to gastriske cancercellelinier, væksten af ​​OLFM4 banke ned celler blev signifikant reduceret sammenlignet med HK kontrolceller fra dag 3 (P < 0,01). For yderligere at undersøge betydningen af ​​OLFM4 i tumorigenese af gastrisk kræft celler in vitro, vi udført forankringsuafhængige vækst analyser og fundet SGC-7901 og MKN45 celler, der udtrykker HK kontroller voksede godt i blød agar, der danner forskellige kolonier. I modsætning hertil OLFM4 knockdown SGC-7901 og MKN45 celler udviste en dramatisk reduktion i antallet af blød agar kolonier (P < 0,01) (Figur 2B), der viser transformerende evner mindre end kontrolcellerne. Disse data indikerede, at knock-down af OLFM4 kunne inhibere gastrisk cancer celleproliferation og forankringsuafhængig vækst in vitro. Figur 2 knockdown af OLFM4 inhiberer væksten af ​​SGC-7901 og MKN45 celler in vitro og in vivo. A. Cell vækstkurve. Celleproliferation in vitro blev vurderet ved kurve cellevækst som bestemt ved tælling af celleantal (WST-1 assay) i SGC-7901 celler (venstre felt) og MKN45 celler (højre panel). OD-værdien (450 nm) blev talt på de angivne dage og præsenteres som den gennemsnitlige celleantal (n = 3). B. forankringsuafhængig vækst i blød agar. Repræsentative billeder af tre eksperimenter blev vist (øvre panel). Dataene repræsenterer middeltallet af kolonier optalt ved 200 ganges forstørrelse for 5 tilfældige felter (nederste panel). C. Den gennemsnitlige tumorvolumen efter subkutan injektion af nøgne mus med HK kontrol eller OLFM4 Knockdown celler blev målt ved de angivne tidspunkter. D. repræsentant tumorer billeder på 35 dage efter subkutan injektion af angivne celler. E. gennemsnitlige tumorvægt (venstre felt) og inhibitorisk rate (højre panel) i tumorxenotransplantater. Dataene repræsenterer gennemsnittet tumorvægt af xenotransplantater (gennemsnit ± SD, n = 10). ** P < 0,01 vs. HK kontrolgruppe.
Væksthæmmende effekt af nedsat OLFM4 i gastriske tumorxenotransplantater
Endvidere udførte vi også subkutan tumor formative assay i nøgne mus for at evaluere vækstsuppression virkning nedreguleres OLFM4 in vivo. Nøgne mus blev subkutant injiceret med OLFM4 knockdown eller HK kontrolceller. Tumorvolumener pr 4 dage og tumorvægt på 5 uger blev målt henholdsvis efter subkutan injektion. Som vist i figur 2C-D, også tumorvolumen eller tumorvægt produceret af OLFM4 vælte SGC-7901 og MKN45 celler var signifikant reduceret vækst i forhold til tumorer produceret i mus injiceret med HK kontrol-transficerede celler (P < 0,01). Den hæmmende på SGC-7901 og MKN45 banke ned celler-injicerede gruppe på tumorvækst var 40,29% og 37,48% (figur 2E).
For yderligere at sikre OLFM4 udtryk indeedly tavshed efter subkutan injektion af nøgne mus, vi også evalueret OLFM4 ekspression i tumorxenografter vha QRT-PCR og IHC. Tilsvarende in vitro, OLFM4 mRNA-niveau i tumorxenotransplantater fremstillet af OLFM4 knockdown-celler viste også en signifikant nedgang i forhold til HK kontroltumorer xenotransplantater (P < 0,01) (figur 3A). I overensstemmelse med resultaterne af QRT-PCR, blev signifikant reduktion af OLFM4 protein også observeret i tumorxenotransplantater ved IHC (P < 0,01) (figur 3B og 3C). Højere gråskala og stærkere positivt signal ved DAB visualisering blev fundet i tumorxenoplantater af HK kontrol celler-injicerede gruppe. Tværtimod var svag brun farvning observeret i tumorxenoplantater af OLFM4 Knockdown celler-injicerede gruppe. Desuden blev flere store nekrose region observeret i tumorxenoplantater produceret af HK kontrol celler på grund af en hurtig vækst i HK kontrol celler (figur 3B øverste panel). Disse data forudsat en stærk indikation af, at OLFM4 udtryk på mRNA og protein niveauer er stabilt hæmmede faktisk in vivo. Taget under et, både in vitro og in vivo forsøg antyder, at OLFM4 knockdown hæmmer væksten af ​​gastriske cancerceller. Figur 3 QRT-PCR og IHC påvisning af OLFM4 i tumorxenotransplantater. A. QRT-PCR for OLFM4 mRNA i tumorxenotransplantater. Fold ændringer i OLFM4 mRNA blev bestemt under anvendelse af 2-ΔΔCt metode. p-actin-genet blev anvendt som en intern kontrol. B. H &E-farvning (øvre panel) og IHC for OLFM4 protein (nederste panel) i tumorxenotransplantater. Repræsentative billeder (200 ×) er vist. N, nekrose. C. Kvantificering analyse af OLFM4 ekspression. Den gennemsnitlige værdi blev målt fra fem tilfældigt forskellige områder under lup (400 ×) ved hjælp af Image-Pro Plus V6.0. Data blev udtrykt som gennemsnit ± SD. ** P < 0,01 vs. HK kontrolgruppe.
OLFM4 knock-down forsinkelser G1 til S overgang, men ikke udløser indlysende apoptose i gastriske kræftceller
Givet vores observerede hæmmende virkning på cellevækst in vitro og in vivo, vi søgte at bestemme hvorvidt øget apoptose eller forsinket cellecyklusprogression var forbundet med væksthæmning. Vi først evalueret effekten af ​​nedsat OLFM4 på cellecyklusprogression. Som vist i figur 4A, både OLFM4 knockdown SGC-7901 og MKN45 celler viste signifikante forøgede antal i G1-fasen og nedsat antal i S-fase, i modsætning til deres HK kontrolceller (P < 0,01). Der blev ikke observeret nogen signifikante forskelle i G2 /M-fase, hvilket indikerer en typisk G1 forsinkelse af cellecyklus. Figur 4 Vurdering af cellecyklusfordeling, apoptotiske celler og caspase-3/9 aktivering i OLFM4 knockdown gastriske cancerceller. A. Cell cyklus analyse. Ændringer i cellecyklus distribution af SGC-7901-HK, SGC-7901-siOLFM4 og MKN45-HK, blev MKN45-siOLFM4 celler analyseret af FCM. Dataene repræsenterer gennemsnittet procentdel af celle-cyklus fasefordeling (n = 3). B. Cell apoptose analyse. Apoptose blev vurderet med AnnexinV-PE /7-AAD-farvning af FCM. Dataene repræsenterer gennemsnittet apoptotiske celleprocenten (n = 3). C. Caspase-3 og -9 aktiveringer. Caspase-3, er vist 9 aktiveringer mellem angivne celler. ** P < 0,01 vs. HK kontrolgruppe.
At bestemme om apoptose er involveret i denne væksthæmning, vi næste udført celle apoptose analyse. Interessant nok kunne reduceres OLFM4 ekspression ikke medfører væsentlige ændringer i apoptose (figur 4B), hvilket er i overensstemmelse med cellecyklusanalyse viser tilsyneladende uden sub-G1-fasen i de testede celler. For yderligere at undersøge ændringer af apoptotiske signaler, blev caspase-3 /-9 aktivitet også identificeret ved kolorimetriske aktivering assays. Både caspase-3 og -9 aktiveringer viste ingen signifikante ændringer efter knockdown af OLFM4 i SGC-7901 og MKN45 celler (Figur 4C). Disse resultater antyder, at nedregulering af OLFM4 kan udøve en inhiberende virkning på cellevækst ved regulering cellecyklusprogression ikke indebærer apoptose i gastriske cancerceller.
Sletning af OLFM4 sensibiliserer gastriske cancerceller til H2O2 eller TNF α-induceret apoptose
den tydelige effekt af H 2O 2 eller TNF α på apoptose mellem OLFM4 banke ned og HK kontrol celler blev også undersøgt. OLFM4 banke ned eller HK kontrolceller blev behandlet med 10, 100 og 1000 uM H 2O 2 eller 5, 10 og 50 ng /ml TNF α hhv. Cellelevedygtighed og apoptose blev vurderet. Som vist i figur 5A-D, blev en dosisafhængig formindskelse i cellelevedygtighed observeret i H 2O 2 eller TNF α-behandlede OLFM4 vælte celler. Desuden behandling af 10 uM H 2O 2 (figur 5A-B) eller 10 ng /ml TNF a (figur 5C-D) førte til en betydelig reduktion i cellernes levedygtighed i OLFM4 vælte celler i forhold til HK kontrolceller (P < 0,01). Af særlig interesse er den konstatering, at OLFM4 Knockdown celler snarere end HK kontrol celler behandlet med 10 ~ 1000 uM H 2O 2 udstillet mere fremtrædende apoptotiske procenter i forhold til gruppen behandlet med PBS mock (P < 0,01) ( Figur 5A-B). Lignende resultater blev også set i TNF a-behandlede OLFM4 Knockdown celler (figur 5C-D). Med andre ord, OLFM4 vælte forbedret H 2O 2 eller TNF α-induceret apoptose i gastriske cancerceller, hvilket indikerer deletion af OLFM4 gjort SGC-7901 og MKN45 celler mere følsomme over for behandling af H 2O 2 eller TNF α. Figur 5 Reaktion af OLFM4 knockdown SGC-7901 og MKN45 celler til apoptose-inducerende midler H 2 O 2 eller TNF a. OLFM4 knockdown og HK kontrolceller blev behandlet med H2O2 (A og B) eller TNF α (C og D) som angivet doser i 12 timer. Cellelevedygtighed blev målt ved WST-1 assay (A-D venstre paneler) og udtrykt i gennemsnitlige OD-værdi (450 nm) (n = 3). Procentdelen af ​​apoptotiske celler blev bestemt ved FCM (A-D højre paneler) og udtrykt i betyde apoptotisk procentdel (n = 3). * P < 0,05, ** P < 0,01 vs. HK kontrolgruppe.
Caspase-3-aktivitet er involveret i H2O2 eller TNF α-induceret apoptose i OLFM4 knock-down celler
Ovennævnte resultater viste, at banke ned af OLFM4 kan øge H 2O 2 eller TNF α-stimuleret apoptose. For yderligere at undersøge, om caspase-3 aktiveres i H 2O 2 eller TNF α-induceret apoptose i OLFM4 Knockdown celler, vi næste opdaget caspase-3 aktivering i H 2O 2 eller TNF a-behandlede celler under anvendelse kolorimetrisk assay. Som vist i figur 6A, behandling af H 2O resulterede 2 eller TNF α i langt mere forøgelse af caspase-3-aktivitet i OLFM4 Knockdown celler end HK kontrolceller (P < 0,01), hvilket antyder caspase-3-aktivitet er involveret i H 2O 2 eller TNF α-induceret apoptose i OLFM4 knockdown-celler. For yderligere at kontrollere, om H 2O 2 eller TNF α-induceret apoptose er afhængig af caspase-3 aktivitet, Z-VAD-FMK, en caspaseinhibitoren blev brugt før behandlingen af ​​H 2O 2 eller TNF α. Forbehandling af Z-VAD-fmk signifikant svækket H 2O 2 eller TNF α-induceret celle apoptose samt caspase-3-aktivitet i både OLFM4 knockdown celler (P < 0,01) (figur 6C-D ), hvilket indikerer, at H 2O 2 eller TNF α-induceret apoptose er caspase-3 afhængig i OLFM4 knockdown-celler. Figur 6 Involvering af caspase-3-aktivitet i H 2 O 2 eller TNF α-induceret apoptose i OLFM4 knockdown SGC-7901 og MKN45 celler. (A-B) Øget caspase-3-aktivitet i H2O2 eller TNF a-behandlede OLFM4 knockdown-celler. OLFM4 Knockdown og HK-kontrolceller blev behandlet med 10 pM H2O2 (A) eller 10 ng /ml TNF α (B) i 12 timer. Caspase-3-aktivitet blev målt ved anvendelse kolorimetrisk assay og udtrykt i fold ændringer. ** P < 0,01 versus PBS mock gruppe (n = 3). (C-D) Tilbageført celle apoptose med caspase inhibitor i OLFM4 knockdown-celler. Celler blev behandlet med H2O2 eller TNF α alene med angivne doser som ovenfor nævnt eller forbehandlet med 20 pM Z-VAD-fmk 2 timer før H2O2 eller TNF α behandling. Procentdelen af ​​apoptotiske celler blev bestemt ved FCM. Data repræsenterer middelværdier ± SD fra tre uafhængige eksperimenter. ** P < 0,01 vs. H2O2 (C) eller TNF α (D) -behandlede OLFM4 celler gruppe knockdown.
Diskussion
nylig akkumulerende data viste OLFM4 ofte overudtrykkes i mange typer humane tumorer, herunder mavecancer, og det mentes at spiller en afgørende rolle i udviklingen og progressionen af ​​gastrisk carcinogenese [19, 20]. Skønt tidligere undersøgelser har vist, at OLFM4 er involveret i apoptose og tumorvækst, nylige observationer antyder også, at celle- eller vævsspecifikke virkninger kan eksistere for OLFM4 genet. Relativt lidt er kendt om tumorvækst og apoptose underliggende gastrisk cancer-specifik OLFM4 ekspression. For at få en bedre forståelse af denne rolle for den ændrede OLFM4 i human gastrisk cancer, er eksperimentel støtte, som kræves for at validere rolle OLFM4 genet i mavekræft.
Det har vist sig, at unormal udtryk for HGC-1 kan reguleres på det transskriptionelle eller posttranskriptionel niveau [13]. I vores nuværende værker, vi direkte undersøgt OLFM4 proteinekspression mønster i gastriske cancerceller og normale GES-1 celler. SGC-7901 og MKN45 celler, der udtrykker relative høje OLFM4 niveauer blev valgt til denne undersøgelse. Siden reducere target genekspression ved genetiske midler etablerede cellelinjer er nyttigt for en bedre forståelse af sin rolle i at opretholde den maligne fænotype især i at analysere gener, der er afgørende for cellulær overlevelse [21], der genereres vi stabile klon puljer af SGC-7901 og MKN45 udtrykker OLFM4-siRNA eller krypteret HK kontrol fra plasmid-baserede siRNA tilgang og bekræftede knock-down effektivitet OLFM4 genet på mRNA og protein niveauer ved QRT-PCR og western blotting.
Vores nuværende værker viser, at OLFM4 spiller en væsentlig rolle i mavekræft tumorigenese. Knockdown af OLFM4 hæmmer celledeling og forankringsuafhængig vækst evne in vitro. Xenograft tumor model in vivo indebærer også, at faldet OLFM4 kan inhibere tumorvækst af humane gastriske cancerceller. Disse resultater indikerer, at OLFM4 spiller en afgørende rolle i celleproliferation af gastriske cancerceller. Vores resultater bemærkede også, at knock-down af OLFM4 påvirkede ikke hastigheden af ​​apoptose og caspase-3 og 9 aktiveringer i OLFM4 knockdown celler, hvilket antyder, at apoptose er måske ikke den mekanisme, der ligger til grund hæmning af tumorvækst. Således har vi postulerer, at OLFM4 ekspression ikke er essentiel for cancercelleoverlevelse, hvilket er i overensstemmelse med en nylig observation, at genetiske knock-out-mus for OLFM4 viser normal udvikling og hæmatopoietiske fænotyper [17]. Til yderligere karakterisering af mekanismen bag væksthæmning, udførte vi cellecyklusanalyse og demonstrerede, at inhibering af OLFM4 ekspression induceret gastriske cancerceller til at akkumulere i G1-fasen af ​​cellecyklussen, hvilket antyder, at nedreguleres OLFM4 kan udøve en inhiberende virkning på cellevækst med en mekanisme regulerer cellecyklusprogression ikke indebærer apoptose i gastriske kræftceller.
Resistance af tumorceller til induktion af apoptose er en af ​​de vigtigste faktorer, der er ansvarlige for den fejlslagne mange konventionelle anticancer terapier, der bruger anticancer midler og stråling. Derfor apoptose kontrol i cancerceller er af afgørende biologiske og kliniske betydning [22, 23]. Anti-apoptotisk aktivitet er en anden vigtig funktion af OLFM4 genet [2]. Især blev H 2O 2-induceret cellulær apoptose svækket ved overudtrykt OLFM4 i en prostatacancer-cellelinie [2]. Desuden har MKN45 celler blevet vist en evne til resistens over for TNF α-induceret apoptose [24]. På baggrund af disse resultater, vi hypotesen, at knockdown af OLFM4 udtryk kan forbedre H 2O 2 eller TNF α-induceret apoptose i mavens kræftceller. Her viste vi, at knock-down af OLFM4 reelt forbedret celle apoptose i respons på H 2O 2 eller TNF α stimulation i MKN45 samt SGC-7901 celler, hvilket tyder på at blokere OLFM4 kan øge modtageligheden for mavekræft celler være tilstedeværelsen af ​​H 2O 2 eller TNF α.
Da det er velkendt, at caspase-3, en central udøvende molekyle ifølge den apoptotiske vej, spiller en kritisk rolle i apoptotiske processer i en række af celler. Vi undersøgte yderligere caspase-3 aktivering i OLFM4 knockdown og HK kontrolceller i nærvær eller fravær af caspaseinhibitor Z-VAD-fmk. Vi observerede, at behandling af H 2O 2 eller TNF-a signifikant opreguleret Caspase-3-aktivitet i OLFM4 Knockdown celler end HK kontrolceller, mens forbehandling med Z-VAD-fmk omvendt caspase-3-aktivitet samt som H 2O 2 eller TNF α-induceret apoptose. Resultaterne indikerer, at H 2O 2 eller TNF α-induceret apoptose i OLFM4 Knockdown celler er caspase-3-afhængig. Baseret på de foreliggende data er det tænkeligt, at opreguleret OLFM4 muliggør gastriske cancerceller til at modstå apoptose induktion ved at formindske følsomheden over for anticancerlægemidler.
Faktisk har antagonister for OLFM4 blevet rapporteret at inhibere proliferationen i andre typer af cancerceller såsom humane pancreas cancer PANC-1 celler [8] og human lunge caner SBC-1-celler [9]. Imidlertid er også blevet observeret kontroversielle resultater. Nedsat OLFM4 mRNA inhiberer PANC-1 celler proliferation af S til G2 /M-fase standsning [8], som er forskellig fra vores resultater viser forsinket G1-fasen fremskridt med gastrisk cancer. Visse vigtige detaljer (eller årsager) kan forklare denne uoverensstemmelse. Først da nyere undersøgelser antydet, kan en celle eller væv specifikke rolle OLFM4 (gastrisk kræftceller og bugspytkirtelkræftceller) være en overbevisende forklaring på denne uoverensstemmelse. Det mest bemærkelsesværdige er, OLFM4 udtryk på mRNA-niveau, men ikke protein niveau i PANC-1 celler blev målt med succes ved hjælp af RT-PCR [8], mens den seneste rapport fra Kim et al. viste, at Panc-1-celler har nogen OLFM4 mRNA-ekspression [25], hvilket indikerer ekspressionsmønsteret og rolle OLFM4 genet i PANC-1-celler kræver yderligere bekræftelse.
Trods OLFM4 silencing blev vist til en inhiberende virkning på cellevækst og en nedsat resistens over for H 2O 2 eller TNF α behandling i gastriske cancerceller, er det ikke slået, at andre mekanismer også kan reguleres ved OLFM4 og bidrager til vækstinhibering og apoptose styresignalering, overvejer krydstale af netværket .

• Epidermal vækstfaktor receptor strukturelle ændringer i gastriske cancer
• Udtryk af COX-2 og VEGF-C i mavekræft: korrelationer med lymphangiogenese og prognostiske implikationer