Iscrpljivanje OLFM4 gena inhibira rast stanica i povećava osjetljivost prema vodikovom peroksidu i čimbenik tumorske nekroze alfa-inducirane apoptoze u stanicama raka želuca

Iscrpljivanje OLFM4 gena inhibira rast stanica i povećava osjetljivost prema vodikovom peroksidu i čimbenik tumorske nekroze alfa-inducirane apoptoze u stanicama raka želuca pregled apstraktna pregled pozadini pregled Human olfactomedin 4 (OLFM4) gen je jedan izlučen glikoprotein češće poznat kao anti-apoptotičke molekule GW112. OLFM4 se utvrdi da je često doreguliran u mnogim tipovima tumora u ljudi, uključujući rak želuca te se vjeruje da igraju značajnu ulogu u napredovanju raka želuca. Iako je navedeno funkcija OLFM4 u brojnim studijama, novi dokazi snažno ukazuje na stanicu ili tkivo ovisne ulogu OLFM4 u stanični rast i apoptozu. Cilj ovog istraživanja je ispitati ulogu želučanog raka specifične ekspresije OLFM4 u stanični rast i otpornost apoptoze.
Metode pregled OLFM4 ekspresija je eliminiran od strane RNA interferencije u SGC-7901 i MKN45 stanica. proliferacija stanica, sidrište neovisan rast, stanični ciklus i apoptozu karakterizira in vitro. Tumorogenosti analizirana in vivo. Apoptoza i caspase-3 aktivacije kao odgovor na vodikov peroksid (H 2O 2) ili faktora tumorske nekroze-alfa (TNF α) procijenjena je u prisutnosti ili odsutnosti inhibitora kaspaze Z-VAD-FMK.
Rezultati
eliminaciju OLFM4 proteina RNA interferencije u SGC-7901 i MKN45 stanica značajno inhibira torn smjeru in vitro i in vivo indukcijom stanica G1 uhićenja (svi p < 0,01). OLFM4 obaranje nije pokrenuo očite staničnoj apoptozi, ali povećava H 2O 2 i TNF α inducirana apoptoza i caspase-3 aktivnosti (sve P 0,01). Tretman Z-VAD-FMK prigušuje kaspaze-3, aktivnosti i značajno preinačio H 2O 2 i TNF α inducirane apoptoze u OLFM4 obaranje stanicama (svi p 0,01).
Zaključak
Naša studija pokazuje da iscrpljivanje OLFM4 značajno inhibira torn smjeru od raka želuca SGC-7901 i MKN45 stanica. Blokiranje OLFM4 izraz može senzibilizirati želučane stanice raka u H 2O 2 ili TNF α tretman povećanjem kaspaze-3 ovisan apoptozu. Kombinacija strategije koja se temelji na OLFM4 liječenju inhibicija i antitumorski lijekovi mogu pružiti terapeutski potencijal u želučanom intervencije protiv raka.
Ključne riječi pregled Rak želuca Olfactomedin 4 RNK rastu smetnje staničnoj apoptozi Otpornost na pozadini pregled Human OLFM4 (olfactomedin 4, također poznat kao HGC-1, GW112), izvorno nazvan kloniranih ljudskih iz mijeloidne stanica prekursora nakon stimulacije granulocita faktor stimulacije kolonija [1], je jedan izlučen glikoprotein više uobičajeno poznat kao anti-apoptoze molekula GW112 [2, 3]. OLFM4 obično se izražava u koštanoj srži, prostate, tankog crijeva, želuca, debelog crijeva i gušterače [1, 4]. Nakon toga, povećan OLFM4 razina je također pronađen u epitelnim kriptama upaljene sluznice kolona upalnih bolesti crijeva [5] i želučanom biopsije inficiranih Helicobacter pylori [6, 7]. U novije vrijeme, reguliraju prema gore ekspresiju OLFM4 je opisana u pluća i [8] dojke, prostate [3], želuca [3, 9] i gušterače karcinomi [8, 9], kao i u adenoma [10-14]. pregled je sugerirao da se OLFM4 uključeni u stanični proces apoptoze, kao što su i tumorskog rasta [2]. Iako je istražen stanični funkcija OLFM4, ovi rezultati ne uvijek podudaraju. Pojačanom ekspresijom OLFM4 Pokazano je da se olakša miša tumora prostate Strano-C1 stanični rast u sinergičkih C57 /BL6 miševa [2], ali inhibira rak prostate PC-3, proliferacije stanica ljudske [15]. Osim toga, regulira prema gore OLFM4 pokazali snažnu anti-apoptotski djelovanje u miša limfnog vena endotelnih Švec stanica i ljudska adenokarcinoma HeLa stanica [1, 2], dok nedavna otkrića predložili proapoptotski učinak OLFM4 u ljudske mijeloične leukemije HL-60 ćelija [16 ]. Dokazi iz ovih studija sugerira taj uloge OLFM4 u kontroli staničnog rasta i apoptozu može ovisiti o stanicu ili tkivo [10, 13-15]. Do danas, međutim, vrlo ograničeni podaci koji se odnose na ulogu OLFM4 u rastu stanica i apoptoze profilima želučanih stanica raka je objavljen.
U ovoj studiji analizirali smo OLFM4 ekspresije proteina u želučanim stanicama raka i normalnog ljudskog želuca epitelnih GES-1 stanica pomoću Western blottinga. Primjenom plazmida posredovana kratko ukosnica RNA (shRNA) inhibira se OLFM4 ekspresiju u raka želuca sGC 7901 i MKN45 stanica promatrati proliferaciju stanica, faza staničnog ciklusa, apoptoze in vitro i da se odredi njegov tumorogene sposobnost in vivo. Također istraživali apoptoze i kaspaze-3 aktivacije odgovor na citotoksičnim sredstvima, kao što je H 2O 2 i TNF α u prisutnosti ili odsutnosti inhibitora kaspaze Z-VAD-FMK između OLFM4 obaranje stanica i kontrolnih stanica HK .
Methods
stanične kulture, reagensi i miševi pregled Humane stanice raka želuca BGC-823, HGC-27, SGC-7901, MKN28, MKN45 i normalne ljudske epitelne želučani GES-1 stanice uzgajane su DMEM medij (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS, GibcoBRL, USA), 100 U /ml penicilina i 100 ug /mL streptomicina. H 2O 2 i TNF-α dobiveni su od Sigme (St. Louis, MO) i Z-VAD-FMK je kupljen od Calbiochem (San Diego, CA). BALB /C goli (nu /nu) miševa (4-6 tjedana starosti, SPF stupnjeva, 20 ± 3 g) kupljeni su od laboratorijskih životinja Centar za Chongqing medicinskog sveučilišta (Chongqing, Kina). Svi postupci provedeni su u skladu s međunarodno prihvaćenim etičkim smjernicama (NIH publikacija br. 85-23, revidiran 1985.). Pregled plazmida konstruira i stabilna transfekcija pregled shRNA posredovanog RNAi plazmida (pGenesil 1,1-siOLFM4) i izokrenut kontrole plazmid (pGenesil 1,1-HK) su izgrađene srušiti endogene OLFM4 u SGC-7901 i MKN45 stanica. Nakon transfekcije i neomicin (G418) selekcije, OLFM4 knock-down SGC-7901-siOLFM4, MKN45-siOLFM4 stanice i umućeno SGC-7901-HK, kontrolne stanice MKN45-HK su stabilno dobiveno, odnosno (detalji prikazano na dodatne datotečne 1: Dopunski podaci). pregled ekstrakcija RNA i kvantitativnom RT-PCR (QRT-PCR) pregled Ukupna RNA u različitim stanicama ili tumori ksenotransplantati ekstrahira uporabom RNeasy Mini Kit (Qiagen, CA, USA), te je uslijedila sinteze cDNA pomoću ReverTra Ace-a-sinteza prvog lanca cDNA sustav (Toyobo, Osaka, Japan), kao što je opisano prethodno [17]. Kvantitativna realnom vremenu PCR provedena je pomoću 7500 real-time PCR sustav (Applied Biosystems) s SYBR-zelena kao fluorescentne boje (Tovobo, Osaka, Japan) (pojedinosti prikazanih na dodatne datotečne 1: Dodatni podaci). Mnogostrukost promjene u ekspresiji gena su određene primjenom "2 - ddCT". Metode [18] pregled Test stanične proliferacije in vitro i životnu sposobnost stanica mjerenjem
staničnu proliferaciju i preživljavanje stanica se mjeri koristeći staničnu proliferaciju WST-1 kita (Roche ) u skladu s uputama proizvođača. Proliferacija, stanice su nasađene u gustoći od 1 x 10 3 stanica po jažici na ploči s 96 jažica i uzgajane tijekom 5 dana. Optička gustoća (450 nm) je vrijednost detektira korištenjem Microplate Reader (zračni navigacijski sustav, SVAZI) po danu. Svaki test je izveden u tri puta. Kao i za mjerenje stanične vijabilnosti stanice (1 × 10 4 /šupljini) nasađeno je u 200 ul medija u pločicama s 96 jažica. Nakon 12 sati inkubacije, H 2O 2 i TNF α obrađen na naznačenim koncentracijama. Relativna apsorbancija je mjerena kako je opisano u proliferaciji stanica.
Anchorage-nezavisna pokusa rasta pregled Anchorage neovisan rast je izveden na mekom agaru odražavaju in vitro clonogenicity. Ukratko, stanice (5 x 10 2) iz svake kolonije su suspendirani u 0,3% agara u DMEM i zatim nasadi na skrućenu agar (0,5%) u 6 jažica. Stanice su inkubirane 2 tjedna na 37 ° C u 5% CO 2 prije nego što se kolonije se mjeri. Broj kolonija broje na povećanje 200 puta pet slučajnih polja. Svaki test je izveden u tri puta.
Protočna citometrijska analiza
protočnom citometrijom (FCM) analiza je provedena za procjenu progresije staničnog ciklusa ili apoptozu. (Pojedinosti prikazan na dodatne datoteke 1: Dodatni podaci) pregled Caspase Test pregled enzimatske aktivnosti kaspaze-3 i 9 je bila mjerena pomoću fluorometrijskih ispitivanja prema prethodno opisanim postupkom [8] pregled Western blot analizom. pregled Western blot ispitivanje je provedeno kao što je ranije opisano [17]. Sljedeći antitijela su korišteni za zapadnoj upijajući: anti-OLFM4 (Abcam, Cambridge, UK) i anti-β-aktin (Santa Cruz, CA, USA) Relativna količina proteina analizirana je pomoću Količina One softvera (Bio-Rad, Hercules , CA, USA) i normalizirana onom ß-aktin (pojedinosti prikazanih na dodatne datotečne 1. Dopunski podaci) pregled modelu ksenografta tumora pregled Četrdeset golim miševima su podijeljeni u četiri grupe nasumce. Svaka grupa je injiciran subkutano u leđa sa suspenzijom od 200 ul koji sadrži 2 × 10 6 stanice što je gore spomenuto, respektivno. Volumen ksenografta serijski je mjerena. Miševi su žrtvovani nakon 35 dana. A xenografte su izdvojeni i izvagani. Stope Inhibicija ksenografta su izračunati prema formuli: Postotak inhibicije (%) = 1-srednje težine (OLFM4 srušiti stanice skupine kojoj je ubrizgan ili upravljački HK stanica skupine kojoj je ubrizgan) /srednja masa (kontrolne HK stanice injektiranja skupinu) × 100%. Tada se tkivo tumora je predmet izdvajanja ukupne RNA i detektiranje imunohistokemijske. Pregled Imunohistokemija (IHH)
OLFM4 proteini u tumorskih ksenograftova su analizirani IHC korištenje zečjeg anti-OLFM4 (Abcam, Cambridge, UK) (detalji prikazani u Dodatni file 1:. Dodatni podaci)
statistikama
podaci iz neovisnih eksperimenata su izraženi kao srednja vrijednost ± SD najmanje tri eksperimenta. Usporedbe između skupina analizirane su dvosmjernog Studentov t-test pregled ili ANOVA, kako je prikladno, i p vrijednosti < 0,05 smatrane su statistički značajnima. Pregled Rezultati
Učinkovito srušiti od OLFM4 gena po plazmida posredovanog siRNA u želučanih stanica raka pregled OLFM4 proteina izraz uzorak ispitan je u rakom želuca BGC-823, HGC-27, SGC-7901, MKN28, MKN45 stanice i normalne GES-1 stanice za kontrolu (Slika 1a). OLFM4 proteina svakako izražava u svim tim želučanih stanica raka i GES-1 stanica. Konkretno, SGC-7901 i MKN45 stanice izražen u odnosu na visokoj razini OLFM4 proteina od ostalih želučanih stanica raka i GES-1 stanica. Stoga, SGC-7901 i MKN45 stanice odabran za daljnja proučavanja. Slika 1 Učinkovito obaranje OLFM4 s RNA interferencije kod raka želuca SGC-7901 i MKN45 stanica. A. Ekspresija OLFM4 proteina u različitim staničnim linijama raka želuca. Ekspresija profila OLFM4 proteina analizirana je pomoću Western upijanja s P-aktin kao internom kontrolom. GES-1 stanice su se kao normalnim kontrolnim stanicama. Izraz B. OLFM4 mRNA u OLFM4 obaranje stanice. Relativna izraz OLFM4 je otkriven QRT-PCR. β-aktin korištena je kao interna kontrola. Mnogostrukost promjene u ekspresiji mRNA OLFM4 su određene uporabom 2-ΔΔCt metode. Izraz C. OLFM4 proteina u OLFM4 obaranje stanice. OLFM4 ekspresija proteina je otkriven Western blota. P-aktin protein je korišten kao internom kontrolom. prikazati će se predstavnici tri pokusa. ** P < 0.01 vs HK kontrolnih stanica skupine (n = 3).
Regulaciju na dolje OLFM4 izraz, shRNA ciljanje OLFM4 gena plazmid posredovana je izgrađen na stabilno srušiti OLFM4 izraz u SGC-7901 i MKN45 stanica. Kao što je prikazano na slici 1B, razina OLFM4 mRNA su značajno smanjene u SGC-7901-siOLFM4 i MKN45-siOLFM4 stanice, u usporedbi s njihovim HK kontroli ili roditeljskih stanica (P < 0.01). Ti rezultati su dalje potvrđene Western blot analizom (Slika 1C). Nema značajne razlike u OLFM4 izrazu zabilježen je između roditeljskih i HK kontrolnim stanicama. Razine mRNA i proteina za B-aktina su bile slične između različitih skupina. Ovi rezultati ukazuju na to da je plazmid posredovanog OLFM4-siRNA konkretno i učinkovito može srušiti OLFM4 razinu želučanih stanica raka. S obzirom na analizu gore navedeno, dakle, OLFM4 srušiti stanice i kontrolnih stanica HK izabrani su za daljnja istraživanja. Pregled OLFM4 obaranje inhibira proliferaciju želučane stanica raka i učvršćenja neovisan rast in vitro pregled Da bi se odredilo ulogu OLFM4 u želučanom rast tumorskih stanica, ispitali smo učinak OLFM4-siRNA na rast stanica 1-5 dana vremenskoj točki pomoću WST-1 testa. Kao što je prikazano na Slici 2A, u svim dva želučanim staničnim linijama raka, rasta OLFM4 srušiti stanicama je značajno smanjena u usporedbi s kontrolnim stanicama HK od 3. dana (p 0,01). Kako bi se dodatno ispitati važnost OLFM4 u nastanku tumora želuca stanica raka in vitro, proveli smo analize rasta učvršćenja neovisan i našao SGC-7901 i MKN45 stanice koje izražavaju kontrole HK rastao dobro u mekom agaru, formiranje zasebne kolonije. Nasuprot tome, OLFM4 obaranje SGC-7901 i MKN45 stanice pokazivale su dramatično smanjenje broja mekom agaru kolonija (P 0,01) (slika 2b), prikazano transformirati sposobnosti manje nego u kontrolnim stanicama. Ovi podaci ukazuju da knock-down OLFM4 mogu inhibirati proliferaciju želučane stanica raka i učvršćenja neovisan rast in vitro. Slika 2 obaranje OLFM4 inhibira rast sGC 7901 i MKN45 stanica in vitro i in vivo. A. krivulja rasta stanica. proliferacija stanica in vitro je određena krivulja rasta stanica, što se određuje brojanjem stanica (WST-1 u testu) u SGC-7901 stanica (lijevi dio) i MKN45 stanice (donji dio). Vrijednosti OD (450 nm) izračunata je na naznačenim dana i prikazani kao srednja broja stanica (n = 3). B. Anchorage neovisan rast u mekom agaru. Reprezentativne slike tri pokusa prikazani su (gornji panel). Podaci predstavljaju srednji broj kolonija broje na 200 × uvećanja za 5 slučajnih polja (donji prikaz). C. znače volumen tumora nakon supkutana injekcija golih miševa sa HK kontroli ili OLFM4 obaranje stanica izmjerena je u naznačenim vremenskim točkama. D. predstavnik tumora slika u 35 dana nakon supkutane injekcije navedenih stanica. E. Srednja težina tumora (lijevi dio) i inhibitorni stopa (donji dio) kod tumorskih ksenografta. Podaci predstavljaju srednje vrijednosti težina tumora ksenografta (srednja vrijednost ± SD, n = 10). ** P < 0.01 vs HK kontrolna skupina. Pregled Rast-inhibitorni učinak smanjen OLFM4 kod tumorskih ksenografta želučanih
Osim toga, mi također izvodi potkožnog tumora formativnu testa u golim miševima za procjenu suzbijanje rasta učinak dolje regulirano OLFM4 in vivo. Goli miševi su potkožno ubrizgan OLFM4 obaranje ili kontrolnim stanicama HK. Volumeni tumora po 4 dana i mase tumora u 5 tjedana su izmjerene redom nakon supkutane injekcije. Kao što je prikazano na slici 2C-D, bilo volumen tumora i težina tumora proizvesti OLFM4 srušiti SGC-7901 i MKN45 stanica značajno smanjio rast u usporedbi s tumorima proizvedenim u miševa kojima je injektiran HK kontrolnim stanicama transfektirane (p 0,01). Inhibitorna stopa SGC-7901 i MKN45 srušiti stanice skupine kojoj je ubrizgan na rast tumora bio je 40,29%, a 37,48% respektivno (Slika 2E).
Kako bi se dodatno osiguralo OLFM4 izraz indeedly je utišan nakon supkutane injekcije golih miševa, mi također ocjenjuje OLFM4 izraz kod tumorskih ksenografta koriste QRT-PCR i IHC. Slično in vitro, OLFM4 mRNA razine u tumorskih ksenograftova koji su proizvedeni pomoću stanica OLFM4 obaranje i pokazan je značajan pad u odnosu na kontrolne tumore HK ksenografta (p 0,01) (Slika 3A). U skladu s rezultatima QRT-PCR, značajno smanjenje OLFM4 proteina također je uočena kod tumorskih ksenograftova od IHC (P 0,01) (Slika 3B i 3C). Viši siva skala i jači pozitivan signal od strane DAB vizualizacije pronađeni su kod tumorskih ksenografta kontrole HK stanice-ubrizgava grupi. Naprotiv, slabo smeđe obojenje uočeno je u tumorskih ksenograftova od OLFM4 obaranje stanice skupine kojoj je ubrizgan. Osim toga, više velikih nekroze područje je zabilježena u tumorskih ksenograftova koji su proizvedeni pomoću kontrolnih HK stanice zbog brzog rasta kontrolnih HK stanica (Slika 3B gornji panel). Ovi podaci osiguravaju jake naznake da OLFM4 izraz na mRNA i razina proteina stabilno se zaista inhibira in vivo. Uzeti zajedno, i in vitro i in vivo eksperimentima ukazuju da OLFM4 obaranje inhibira rast stanica želuca raka. Slika 3 QRT-PCR i IHH detekcija OLFM4 kod tumorskih ksenografta. A. QRT-PCR za OLFM4 mRNA u tumorskim ksenografta. Preklapanja promjene OLFM4 mRNA određene su pomoću 2-ΔΔCt metode. P-aktin gen je korišten kao internom kontrolom. B. H &E bojanjem (gornji panel) i IHC za OLFM4 proteina (donji prikaz) u tumorskih ksenograftova. prikazani su reprezentativni slike (200 ×). N, nekroze. C. Kvantifikacija analiza OLFM4 izražavanja. Prosječna vrijednost je mjerena od pet nasumce različitih područja pod mikroskopom (400 ×) pomoću slike-Pro Plus v6.0. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SD. ** P < 0.01 vs HK kontrolnoj skupini. Pregled OLFM4 knock-down kašnjenja G1 u S tranzicije, ali ne pokreće očite apoptoze u želučanih stanica raka
obzirom naše uočene inhibitorni učinak na rast stanica in vitro i in vivo, mi tražili da se odredi da li pojačana apoptoza ili odgoditi progresiju staničnog ciklusa bila je povezana s inhibicijom rasta. Prvo smo ocijenili učinak smanjene OLFM4 na progresiju staničnog ciklusa. Kao što je prikazano na slici 4A, i OLFM4 obaranje SGC-7901 i MKN45 stanice pokazuju značajne povećan broj u G1 fazi i smanjio broj u S fazi, za razliku od svojih ćelija HK kontrolu (P 0,01). Nema značajnih razlika u G2 /M-fazi, što znači tipičnu G1 kašnjenje staničnog ciklusa. Slika 4 Procjena distribucije staničnog ciklusa, apoptotičnih stanica i kaspaze-3/9 aktivaciju u OLFM4 srušiti želučanih stanica raka. A. Analiza staničnog ciklusa. Promjene u distribuciji staničnog ciklusa u SGC-7901-HK, SGC-7901-siOLFM4 i MKN45-HK, MKN45-siOLFM4 stanice analizirani su FCM. Podaci predstavljaju srednju vrijednost postotka distribucije faze staničnog ciklusa (n = 3). B. Analiza staničnog apoptoza. Apoptoza je procijenjena s AnnexinV-PE /7-AAD bojenja FCM. Podaci predstavljaju srednju vrijednost postotka apoptotičnih stanica (n = 3). C. kaspaze-3 i -9 aktivacije. Kaspaze-3, prikazani su 9 aktivacije između navedenih stanica. ** P < 0.01 vs HK kontrolnoj skupini.
Bi se utvrdilo je li apoptoza je uključen u ovaj inhibicije rasta, što sljedeći put izvedena staničnoj apoptozi analizu. Zanimljivo, smanjena OLFM4 izraz ne može doći do značajnih promjena u apoptozi (slika 4b), što je u skladu s analizom staničnog ciklusa koja prikazuje bez ikakvog sub-G1 fazu u testiranim stanicama. Kako bi se dodatno ispitati promjene apoptotičnih signala, kaspaza-3 /-9 aktivnost je također identificiran pomoću pokusa kolorimetrijskih aktivacije. Oba kaspaze-3 i -9 aktivacije ne pokazuje značajne promjene nakon obaranje OLFM4 u SGC-7901 i MKN45 stanica (Slika 4c). Ovi rezultati sugeriraju da dolje reguliranje OLFM4 može vršiti inhibitorski efekt na rast stanica regulira progresiju staničnog ciklusa ne uključuje apoptozu u stanicama raka želuca, pregled brisanje OLFM4 senzibilizira želučanih stanica raka na H2O2 ili TNF alfa apoptozi
Drugačija učinak H 2O 2 ili TNF α na apoptozu između OLFM4 srušiti i stanice za kontrolu HK također je istražen. OLFM4 srušiti odnosno kontrolnih stanica HK se pomiješa s 10, 100 i 1000 uM H <2O sub> 2 ili 5, 10 i 50 ng /ml TNF-alfa pojedinačno. Sposobnost stanica za život i apoptoza su ocijenjeni. Kao što je prikazano na slici 5A-D, smanjenje ovisan o dozi u vijabilnost zabilježeno je H <2O pod> 2 i TNF α tretirane OLFM4 oboriti stanice. Nadalje, tretiranje 10 uM H 2O 2 (Slika 5A-B) ili 10 ng /ml (Slika 5C-D) dovela je do značajnog smanjenja stanične vijabilnosti u OLFM4 srušiti stanice TNF alfa u odnosu HK kontrolne stanice (P < 0.01). Od posebnog interesa je nalaz da OLFM4 obaranje stanice nego kontrolne stanice HK tretira s 10 ~ 1000 iM H 2O 2 pokazao je više istaknutih apoptoze postotke u odnosu na one tretirane s PBS Mock (P < 0,01) ( slika 5A-B). Slični rezultati su također vidjeli u TNF a-tretirana OLFM4 obaranje stanica (Slika 5C-D). Drugim riječima, OLFM4 srušiti poboljšanu H 2O 2 i TNF α inducirana apoptoza u želučanim stanicama raka, što ukazuje na brisanje OLFM4 se SGC-7901 i MKN45 stanice osjetljivijima na liječenje H 2O 2 ili TNF α. Slika 5 Odgovor OLFM4 obaranje SGC-7901 i MKN45 stanica na apoptozu inducira agenata H 2 O 2 ili TNF su a. OLFM4 stupa i kontrolne stanice HK su tretirane s H2O2 (A i B), ili TNF alfa (C i D), kako pokazuje doza za 12 h. Stanična vijabilnost mjerena je WST-1 testa (A-D lijeve snimke) i izraženo u OD vrijednosti srednje (450 nm) (n = 3). Postotak apoptotičnih stanica određena je FCM (A-D desne snimke) i izražen u postotku znači apoptoze (n = 3). * P < 0,05, ** P < 0.01 vs HK kontrolnoj skupini. Pregled kaspaze-3 aktivnosti je uključena u H2O2 ili TNF a-inducirana apoptoza u OLFM4 knock-down stanice
Gore navedeni rezultati pokazuju da srušiti od OLFM4 mogla povećati H 2O 2 ili TNF α-stimulirana apoptoza. Kako bi se dodatno provjeriti je li kaspaze-3 je aktiviran u H 2O 2 ili TNF α-inducirana apoptoza u OLFM4 obaranje stanice, što sljedeći put otkrivena kaspaze-3 aktiviranje u H 2O 2 ili TNF a-pomiješa stanica pomoću kolorimetrijskog ispitivanja. Kao što je prikazano na slici 6A, obrada H 2O 2 i TNF α rezultiralo mnogo više povećanje kaspaze-3, aktivnosti u OLFM4 obaranje stanica nego kontrolne stanice HK (P 0,01), što upućuje na kaspaze-3, aktivnosti sudjeluje u H <2O pod> 2 i TNF α inducirane apoptoze u OLFM4 obaranje stanicama. Dalje verifikacije li 'H sub> 2O 2 i TNF α-inducirana apoptoza je ovisna o kaspaze-3 aktivnosti, Z VAD-FMK, inhibitor kaspaze je korištena prije liječenja H 2O 2 ili TNF α. Predobrada Z-VAD-FMK značajno prigušuje H 2O 2 i TNF α inducirane apoptoze stanica, kao kaspaze-3 aktivnost u oba OLFM4 obaranje stanice (P 0,01) (Slika 6C-D ), što znači da je H 2O 2 i TNF α inducirana apoptoza je caspase-3 ovisi u OLFM4 obaranje stanicama. Slika 6 Uključenost kaspaze-3 aktivnosti u H 2 O 2 ili TNF α-inducirana apoptoza u OLFM4 obaranje SGC-7901 i MKN45 stanice. (A-B) Povećana kaspaze-3 aktivnosti u H2O2 ili TNF OLFM4 obaranje stanice a-liječiti. OLFM4 stupa i HK-kontrolnih stanica se pomiješa s 10 uM H2O2 (A) ili 10 ng /ml TNF-alfa (B) tijekom 12 sati. Kaspaze-3 aktivnosti je mjerena pomoću kolorimetrijskog ispitivanja i izražena u mnogostrukost promjene. ** P < 0.01 u usporedbi s PBS mock skupina (n = 3). (C-D) obrnuto stanica apoptoze inhibitor kaspaze u OLFM4 obaranje stanice. Stanice su tretirane s H2O2 ili TNF a samo s označenim dozama kao što je gore spomenuto ili pretretirane s 20 uM Z-VAD-FMK 2 sata prije H2O2 i TNF alfa liječenja. Postotak apoptičnih stanica određena je FCM. Podaci predstavljaju srednju vrijednost ± SD iz tri neovisna pokusa. ** P < 0.01 vs H2O2 (C) ili TNF-a (D) tretiranih OLFM4 obaranje stanice.
Rasprava pregled Nedavno skupljaju podaci pokazuju OLFM4 često prisutan u mnogim vrstama tumora u ljudi, uključujući rak želuca, te se vjeruje da igraju ključnu ulogu u razvoju i progresiji želučane karcinogeneze [19, 20]. Iako su prethodne studije pokazale da OLFM4 je uključen u apoptoze i tumora rasta, nedavna promatranja sugeriraju da stanica ili tkiva specifična učinci mogu postojati gen OLFM4. Relativno malo zna s obzirom na rast tumora i apoptoze podlozi rak želuca specifične OLFM4 ekspresiju. Za bolje razumijevanje ove uloge promijenjene OLFM4 u ljudskoj raka želuca, eksperimentalna podrška potrebna za provjeru ulogu gena OLFM4 kod raka želuca.
Pokazalo se da je nenormalna ekspresija HGC-1 može se regulirati na transkripcije ili posttranskripcijsko razini [13]. U našim sadašnjim djelima, možemo izravno istraživali OLFM4 proteina izraz uzorak u želučanim stanicama karcinoma i normalnih GES-1 stanica. SGC-7901 i MKN45 stanice izražavanje relativne visoke razine OLFM4 su izabrani za ovu studiju. Budući da se smanjuje ekspresiju ciljnih gena genetskim putem u utvrđenim staničnim linijama je korisno za bolje razumijevanje svoje uloge u održavanju maligni fenotip osobito u analizi gena koji su bitni za stanični preživljavanje [21], generira stabilan klon bazena SGC-7901 i MKN45 eksprimiraju OLFM4-siRNA ili kodiranih kontrolu HK od plazmida bazi siRNA pristupa i potvrđen knock-down učinkovitosti OLFM4 gena u mRNA i proteina pomoću QRT-PCR i Western blot.
Naš sadašnji radovi pokazuju da OLFM4 ima bitnu ulogu u želučanom nastanku tumora raka. Obaranje OLFM4 inhibira proliferaciju stanica i učvršćenja neovisan sposobnost rasta u uvjetima in vitro. Modelu ksenografta tumora in vivo također implicira da je smanjen OLFM4 može inhibirati rast tumora humanih stanica raka želuca. Ovi rezultati pokazuju da OLFM4 igra ključnu ulogu u proliferaciji stanica želučane stanica raka. Naši rezultati također primijetio da je knock-down OLFM4 ne utječu na brzinu apoptoze i kaspaze-3 i 9 aktivacija u OLFM4 obaranje stanicama, što ukazuje da je apoptoza ne može biti mehanizam u pozadini inhibiciju rasta tumora. Dakle, možemo pretpostaviti da je OLFM4 izraz nije bitan za preživljavanje stanica raka, što je u skladu s nedavnom promatranja da genetski knock-out miševi za OLFM4 pokazuju normalan razvoj i hematopoetskih fenotipova [17]. Za daljnju karakterizaciju mehanizam odgovoran inhibicije rasta, proveli smo analizu staničnog ciklusa te su pokazali da inhibicija OLFM4 ekspresije induciranog želučanog stanice raka da se akumuliraju u G1 fazi staničnog ciklusa, što ukazuje da podregulira OLFM4 može vršiti inhibitorski efekt na rast stanične progresiju staničnog ciklusa mehanizam koji regulira ne uključuju apoptozu u želučanih stanica raka. pregled Otpornost tumorskih stanica na induciranje apoptoze jedan je od glavnih faktora odgovornih za propast mnogih konvencionalnih antitumorskih terapija koje koriste antikancerogena sredstva i zračenje. Stoga, kontrola apoptozu u stanicama karcinoma je od ključne biološke i kliničke važnosti [22, 23]. Anti-apoptoze aktivnost je još jedna važna funkcija gena OLFM4 [2]. Posebno, H 2O 2 inducirana stanična apoptoza je prigušen pomoću ekstracelularne OLFM4 u prostate stanične linije [2]. Štoviše, MKN45 stanica su pokazali sposobnost otpora TNF α-inducirane apoptoze [24]. S obzirom na ove nalaze, mi pretpostavljamo da obaranje OLFM4 izražavanja može poboljšati H 2O 2 ili TNF α-inducirana apoptoza u želučanih stanica raka. Ovdje, pokazali smo da knock-down OLFM4 učinkovito poboljšana apoptoze stanica u odgovoru na H 2O 2 ili TNF a stimulacija u MKN45 kao SGC-7901 stanica, sugerirajući blokiranje OLFM4 može povećati osjetljivost raka želuca stanice na prisutnost H 2O 2 i TNF α.
Kao što je dobro poznato da kaspaze-3, ključni izvršni molekula apoptoze, ima kritičnu ulogu u apoptotičkim procesa u različitim stanice. Se dalje ispitali kaspaze-3 u aktivaciju OLFM4 stupa i kontrolnih stanica HK, u prisutnosti ili odsutnosti inhibitora kaspaze Z-VAD-FMK. Ustanovljeno je da se obrada H 2O 2 ili TNF a značajno je povećana kaspaze-3, aktivnosti u OLFM4 obaranje stanica nego kontrolne stanice HK a prije liječenja sa Z-VAD-FMK reverznim kaspaze-3, aktivnosti i kao H 2O 2 ili TNF alfa-inducirana apoptoza. Rezultati ukazuju da je H 2O 2 i TNF α inducirane apoptoze u OLFM4 obaranje stanicama kaspaze-3 ovisne. Temeljeno na trenutačnim podacima, razumljivo je da se regulira OLFM4 omogućuje želučane stanice raka da se odupre indukcije apoptoze smanjuje osjetljivost na citostatike.
Ustvari, antagonisti OLFM4 su izvijestili da inhibira proliferaciju u drugih vrsta stanice raka kao što su ljudska raka gušterače PANC-1 stanica [8] i ljudska pluća Caner SBC-1 stanica [9]. Međutim, kontroverzni rezultati također su promatrane. Smanjen OLFM4 mRNA inhibiraju PANC-1 stanica proliferacije S u G2 /M fazi zastoja [8], koji je različit od rezultata pokazuje odloženo napredak G1 faze u raka želuca. Neki važni detalji (ili razlozi) može objasniti ovaj nesklad. Prvo, kao što je nedavna studija sugerira, stanica ili tkiva specifična uloga OLFM4 (rak želuca stanice i stanice raka gušterače) može biti uvjerljiva objašnjenja za tu nedosljednost. Najviše pažnje jest OLFM4 ekspresiju na razini mRNA, ali ne i razina proteina u PANC-1 stanicama uspješno mjerena je pomoću RT-PCR [8], dok većina nedavno izvješće Kim et al. su pokazali da Panc-1 stanice nema ekspresiju mRNA OLFM4 [25], što ukazuje na ekspresije i ulogu OLFM4 gena u PANC-1 stanica je potrebna daljnja potvrda.
Unatoč OLFM4 prigušenje je pokazano da imaju inhibitorski učinak na rast stanica, a A smanjen otpor H 2O 2 i TNF α liječenja u želučanom stanicama raka ne eliminira da drugi mehanizmi također može biti regulirana OLFM4 i doprinosi inhibiciju rasta i kontrole za signalizaciju apoptoze, s obzirom na preslušavanja mreže , Doista, OLFM4, meta gen NF-kB puta [16, 17, 25], je također pokazala negativan utjecaj povratne veze na H.pylori pregled aktivacije infekcijom izazvane NF-kB u HEK 293 T-stanica [6]

• receptor epidermalnog faktora rasta strukturne promjene u želučanom cancer
• Iskazi COX-2 i VEGF-C u rak želuca: korelacija s limfangiogeneze i prognostički implications