El agotamiento de gen OLFM4 inhibe el crecimiento celular y aumenta la sensibilización a peróxido de hidrógeno y factor de necrosis tumoral-alfa inducida por apoptosis en gástrico agotamiento cells

cáncer de gen OLFM4 inhibe el crecimiento celular y aumenta la sensibilización a peróxido de hidrógeno y factor de necrosis tumoral-alfa inducida por apoptosis en gástrico las células cancerosas
Resumen Antecedentes

humano olfactomedin 4 genes (OLFM4) es una glicoproteína secretada más comúnmente conocida como la molécula anti-apoptótica GW112. OLFM4 se encuentra que es con frecuencia hasta reguladas en muchos tipos de tumores humanos, incluyendo el cáncer gástrico y se cree que juega papel importante en la progresión del cáncer gástrico. Aunque la función de OLFM4 se ha indicado en muchos estudios, la evidencia reciente sugiere fuertemente un papel dependiente del tipo de célula o tejido de OLFM4 en el crecimiento celular y la apoptosis. El objetivo de este estudio es examinar el papel de la expresión específica del cáncer gástrico de OLFM4 en el crecimiento celular y la resistencia a la apoptosis.
Métodos
expresión OLFM4 fue eliminado por la interferencia de ARN en el SGC-7901 y las células MKN45. La proliferación celular, el crecimiento independiente de anclaje, ciclo celular y la apoptosis se caracterizaron in vitro. Tumorigenicidad se analizó in vivo. La apoptosis y la caspasa-3 de activación en respuesta a peróxido de hidrógeno (H 2O 2) o factor de necrosis tumoral-alfa (TNF α) se evaluaron en presencia o ausencia de inhibidor de caspasa Z-VAD-fmk.
resultados
La eliminación de la proteína OLFM4 de interferencia por ARN en SGC-7901 y las células MKN45 inhibe significativamente la tumorigenicidad tanto in vitro como in vivo mediante la inducción de la detención G1 celular (todos p < 0,01). OLFM4 caída no provocó apoptosis celular obvio, pero aumentó H 2O 2 o TNF α apoptosis inducida y la actividad de la caspasa-3 (todos P < 0,01). El tratamiento de Z-VAD-fmk atenuado la actividad de caspasa-3 y revertido significativamente el H 2O 2 o TNF α inducida por apoptosis en las células desmontables OLFM4 (todos P < 0,01).
Conclusión
nuestro estudio sugiere que el agotamiento de OLFM4 inhibe significativamente la tumorigenicidad del cáncer gástrico SGC-7901 y las células MKN45. El bloqueo de OLFM4 expresión puede sensibilizar a las células de cáncer gástrico a H 2O 2 o TNF α tratamiento mediante el aumento de la caspasa-3 dependiente de la apoptosis. Una estrategia de combinación basado en OLFM4 tratamiento de inhibición y medicamentos contra el cáncer puede proporcionar un potencial terapéutico en la intervención de cáncer gástrico.
Palabras clave
cáncer gástrico Olfactomedin 4 RNA crecimiento interferencia de la célula resistencia a la apoptosis de fondo
OLFM4 Humano (olfactomedin 4, también conocido como hGC-1, GW112), originalmente denominado humano clonado a partir de células precursoras mieloides después de la estimulación de granulocitos factor estimulante de colonias [1], es una glicoproteína secretada más comúnmente conocida como la molécula anti-apoptótica GW112 [2, 3]. OLFM4 se expresa normalmente en la médula ósea, próstata, intestino delgado, estómago, colon y páncreas [1, 4]. Posteriormente, el aumento de los niveles de OLFM4 también se encontraron en el epitelio de las criptas de la mucosa del colon inflamado de enfermedades inflamatorias del intestino [5] y en biopsias gástricas infectados con Helicobacter pylori [6, 7]. Más recientemente, hasta reguladas expresión OLFM4 se ha descrito en el pulmón y de mama [8], de próstata [3], gástrico [3, 9] y los cánceres de páncreas [8, 9], así como en adenomas colorrectales [10-14].
se ha sugerido que OLFM4 está implicado en procesos celulares tales como el crecimiento y la apoptosis tumoral [2]. Aunque la función celular de OLFM4 se ha investigado, estos resultados no siempre coincidentes. La sobreexpresión de OLFM4 se ha demostrado que facilita la próstata tumor vagabundo-C1 crecimiento celular de ratón en ratones singénicos C57 /BL6 [2], pero inhibir el cáncer de próstata PC-3 proliferación celular humana [15]. Por otra parte, OLFM4 hasta regulado mostró una fuerte actividad anti-apoptótica en células SVEC linfoide de ratón vena endoteliales y de adenocarcinoma humano células HeLa [1, 2], mientras que los últimos hallazgos sugieren un efecto proapoptótico de OLFM4 en células HL-60 de leucemia mieloide humanos [16 ]. La evidencia de estos estudios sugiere fuertemente que los roles de OLFM4 en el control del crecimiento celular y la apoptosis pueden depender de la célula o tipo de tejido [10, 13-15]. Hasta la fecha, sin embargo, muy pocos datos sobre el papel de OLFM4 en el crecimiento celular y la apoptosis perfiles de células de cáncer gástrico ha sido publicada.
En el presente estudio, analizamos la expresión de proteínas OLFM4 en células de cáncer gástrico y normales del epitelio gástrico humano GES-1 mediante Western Blot. El uso de ARN de horquilla corta mediada por plásmidos (shRNA), inhibimos OLFM4 expresión en el cáncer gástrico SGC-7901 y MKN45 células para observar la proliferación celular, la fase del ciclo celular, la apoptosis in vitro y para evaluar su capacidad tumorigénico in vivo. También exploramos la apoptosis y la caspasa-3 de activación en respuesta a agentes citotóxicos tales como H 2O 2 o α TNF en presencia o ausencia de inhibidor de caspasa Z-VAD-fmk entre desmontables células OLFM4 y control de las células HK .
Métodos
cultivo celular, reactivos y ratones
Las células de cáncer gástrico humano BGC-823, HGC-27, SGC-7901, MKN28, MKN45 y normales del epitelio gástrico humano GES-1 Las células se mantuvieron medio DMEM (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS, Gibco BRL, EE.UU.), 100 U /ml de penicilina y 100 g /ml de estreptomicina. H 2O 2 y se obtuvieron TNF-α de Sigma (St. Louis, MO) y Z-VAD-fmk se adquirió de Calbiochem (San Diego, CA). (Nu /nu) de ratones Balb /c desnudos (4-6 semanas de edad, el grado de SPF, 20 ± 3 g) fueron adquiridos de Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad Médica de Chongqing (Chongqing, China). Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices éticas aceptadas internacionalmente (NIH publicación no. 85-23, revisado en 1985).
Plásmido construye y transfección estable
shRNA mediada RNAi plásmido (1,1-pGenesil siOLFM4) y un control mezclado plásmido (pGenesil 1,1-HK) se construyeron para derribar el OLFM4 endógeno en SGC-7901 y las células MKN45. Después de la selección de transfección y neomicina (G418), OLFM4 knock-down SGC-7901-siOLFM4, las células MKN45-siOLFM4 y revueltos SGC-7901-HK, se obtuvieron de forma estable células control MKN45-HK, respectivamente (datos que aparecen en el archivo adicional 1: Suplementario datos). la extracción de RNA
y RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR)
ARN total en células o xenoinjertos de tumores distintos se extrajo usando el kit RNeasy Mini (Qiagen, CA, EE.UU.), y fue seguido por la síntesis de ADNc utilizando el sistema de síntesis de cDNA ReverTra Ace-α-primero (Toyobo, Osaka, Japón) como anterior se describe [17]. Cuantitativa en tiempo real PCR se realizó con 7500 sistema de PCR en tiempo real (Applied Biosystems) con SYBR-Green como un colorante fluorescente (Toyobo, Osaka, Japón) (datos que aparecen en el archivo adicional 1: Los datos suplementarios). Plegables cambios en la expresión génica se determinaron utilizando el "2 - DDCT". Método de [18] Ensayo de proliferación celular in vitro
y la viabilidad celular medida
la proliferación celular y la viabilidad celular se midió utilizando kit de proliferación celular WST-1 (Roche ) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la proliferación de células, las células se sembraron a una densidad de 1 x 10 3 células por pocillo de una placas de 96 pocillos y se cultivaron durante 5 días. El valor de la densidad óptica (450 nm) se detectó usando el lector de microplacas (Tacan, Swazilandia) por día. Cada ensayo se realizó por triplicado. En cuanto a la medición de la viabilidad celular, las células (1 × 10 4 /pocillo) se sembraron a 200 l de medios de comunicación en placas de 96 pocillos. Después de 12 h de incubación, H 2O 2 o TNF α fue tratado en las concentraciones indicadas. La absorbancia relativa se midió como se describe en la proliferación celular.
ensayo de crecimiento independiente de anclaje
crecimiento independiente del anclaje se realizó en agar blando para reflejar clonogenicidad in vitro. Brevemente, las células (5 × 10 2) de cada colonia se suspendieron en agar 0,3% en DMEM y después se sembraron en agar solidificado (0,5%) en placas de 6 pocillos. Las células se incubaron durante 2 semanas a 37 ° C en 5% de CO 2 se midió antes de las colonias. Número de colonias se contó a 200 × magnificación durante cinco campos al azar. Cada ensayo se realizó por triplicado.
Citometría de flujo La citometría de flujo análisis
se realizó (FCM) análisis para evaluar la progresión del ciclo celular o apoptosis. (Datos que aparecen en el archivo adicional 1: Los datos suplementarios)
ensayo de caspasa
la actividad enzimática de la caspasa-3 y -9 se midió utilizando un ensayo fluorométrico de acuerdo con un método descrito anteriormente [8]
Western blot.
Western Blot se realizó como se describió anteriormente [17]. Los siguientes anticuerpos fueron utilizados para la transferencia de Western: anti-OLFM4 (Abcam, Cambridge, Reino Unido) y anti-β-actina (Santa Cruz, CA, EE.UU.), se analizó la cantidad relativa de las proteínas usando Quantity One Software (Bio-Rad, Hercules , CA, EE.UU.) y se normalizó a la de β-actina (datos que aparecen en el archivo adicional 1:. Data)
modelo de tumor de xenoinjerto
Cuarenta ratones desnudos fueron divididos en cuatro grupos al azar. Cada grupo se inyectó por vía subcutánea en el dorso con la suspensión de 200 l que contienen 2 × 10 6 células mencionado, respectivamente. El volumen de xenoinjertos se midió en serie. Los ratones se sacrificaron después de 35 días. Los xenoinjertos se extirparon y se pesaron. Las tasas de inhibición de xenoinjertos se calcularon según la fórmula: tasa de inhibición (%) = 1-peso medio (OLFM4 derribar las células con inyección de grupo o de control HK células con inyección de grupo) /peso (grupo con inyección de células de control HK) significa × 100%. A continuación, el tejido tumoral fue objeto de aislamiento RNA total o la detección inmunohistoquímica.
La inmunohistoquímica (IHC)
OLFM4 proteínas en xenoinjertos de tumor se analizaron por IHC usando conejo anti OLFM4 (Abcam, Cambridge, Reino Unido) (detalles mostrados en archivo adicional 1:. los datos suplementarios) estadísticas
datos de experimentos independientes se expresaron como la media ± SD de al menos tres experimentos. Las comparaciones entre grupos se analizaron mediante la t de Student de dos colas
alltests o ANOVA, según el caso, y los valores de P < 0,05 fueron considerados estadísticamente significativos.
: Resultados de la detonación eficiente abajo del gen OLFM4 de siRNA mediada por plásmidos en células de cáncer gástrico
OLFM4 patrón de expresión de la proteína se investigó en el cáncer gástrico BGC-823, HGC-27, SGC-7901, MKN28, MKN45 células y células de control GES-1 normales (Figura 1A). proteína OLFM4 expresa definitivamente en todas estas células de cáncer gástrico y células GES-1. En particular, SGC-7901 y las células expresan la proteína MKN45 OLFM4 alto nivel relativo de otras células de cáncer gástrico y células GES-1. Por lo tanto, SGC-7901 y las células MKN45 se eligieron para estudios adicionales. Figura 1 caída eficiente de OLFM4 de interferencia por ARN en el cáncer gástrico SGC-7901 y las células MKN45. A. Expresión de la proteína OLFM4 en diversas líneas celulares de cáncer gástrico. perfil de expresión de proteína OLFM4 se analizó mediante transferencia de western con β-actina como control interno. células GES-1 sirvieron como control de las células normales. B. expresión mRNA OLFM4 en desmontables células OLFM4. expresión relativa de OLFM4 fue detectado por QRT-PCR. β-actina se utilizó como control interno. Plegables cambios en la expresión OLFM4 ARNm se determinaron utilizando el método 2-ΔΔCt. expresión de la proteína C en OLFM4 desmontables células OLFM4. expresión de la proteína OLFM4 se detectó por Western Blot. proteína beta-actina se utilizó como control interno. Se muestran los representantes de los tres experimentos. ** P < 0,01 frente al grupo de control de las células HK (n = 3).
A regular a la baja la expresión OLFM4, un gen de orientación OLFM4 shRNA mediada por plásmidos se construyó para golpear de forma estable por la expresión OLFM4 en SGC-7901 y las células MKN45. Como se muestra en la Figura 1B, los niveles de ARNm de OLFM4 se redujeron significativamente en células MKN45-siOLFM4 SGC-7901-siOLFM4 y en comparación con su control HK o células parentales (P < 0,01). Estos resultados fueron confirmados por análisis de Western Blot (Figura 1C). No se observó diferencia significativa en la expresión OLFM4 entre las células de control parental y HK. Los niveles de ARNm y proteínas para la β-actina fueron similares entre los diferentes grupos. Estos resultados sugieren que una mediada por plásmidos OLFM4-siRNA específica y eficientemente puede derribar a nivel OLFM4 en células de cáncer gástrico. Dado el análisis se ha indicado anteriormente, por lo tanto, OLFM4 derribar las células y las células de control HK se eligieron para análisis adicionales.
OLFM4 knockdown inhibe la proliferación de células de cáncer gástrico y el crecimiento independiente de anclaje in vitro
Para determinar el papel de OLFM4 en gástrico el crecimiento de las células cancerosas, se investigó el efecto de OLFM4-siRNA en el crecimiento de las células en el punto de tiempo de 1-5 días por WST-1 ensayo. Como se muestra en la Figura 2A, en todas las dos líneas celulares de cáncer gástrico, el crecimiento de OLFM4 derribar las células se redujo significativamente en comparación con células de control HK de día 3 (P < 0,01). Para examinar aún más la importancia de OLFM4 en el proceso tumoral de las células de cáncer gástrico in vitro, llevamos a cabo ensayos crecimiento independiente de anclaje y encontramos SGC-7901 y las células que expresan MKN45 controles HK crecieron bien en agar blando, formando colonias distintas. Por el contrario, OLFM4 knockdown SGC-7901 y las células MKN45 mostraron una reducción dramática en el número de colonias en agar blando (P < 0,01) (Figura 2B), que muestra la transformación de capacidades inferiores a las de las células de control. Estos datos indicaron que derribo de OLFM4 podría inhibir la proliferación de células de cáncer gástrico y el crecimiento independiente de anclaje in vitro. Figura 2 desmontables de OLFM4 inhibe el crecimiento de SGC-7901 y las células MKN45 in vitro e in vivo. curva de crecimiento de la célula A.. La proliferación celular in vitro se evaluó mediante la curva de crecimiento celular, como se determina contando el número de células (WST-1 de ensayo) en las células SGC-7901 (panel izquierdo) y las células MKN45 (panel derecho). El valor de OD (450 nm) se contó en los días indicados y se presenta como el número de células de medias (n = 3). B. Crecimiento independiente de anclaje en agar blando. Imágenes representativas de tres experimentos se muestran (panel superior). Los datos representan la media del número de colonias contadas a 200 × magnificación para 5 campos aleatorios (panel inferior). C. El volumen medio del tumor después de la inyección subcutánea de ratones desnudos con el control de HK o desmontables células OLFM4 se midió a los puntos de tiempo indicados. D. Representante tumores imágenes en 35 días después de la inyección subcutánea de células indicadas. E. peso medio del tumor (panel izquierdo) y tasa de inhibición (panel derecho) en xenoinjertos tumorales. Los datos representan el peso medio del tumor de xenoinjertos (media ± SD, n = 10). ** P < 0.01 vs. HK grupo de control.
Efecto inhibidor del crecimiento de la disminución de OLFM4 en xenoinjertos de tumor gástrico
Por otra parte, también se realizó el ensayo de formación de tumor subcutáneo en ratones desnudos para evaluar el efecto de supresión del crecimiento de OLFM4 reguladas en vivo. Los ratones desnudos se inyectaron por vía subcutánea con OLFM4 knockdown o células de control HK. Los volúmenes tumorales por 4 días y el peso del tumor en 5 semanas se midieron respectivamente después de la inyección subcutánea. Como se muestra en la Figura 2C-D, si el volumen del tumor o tumor de peso producido por OLFM4 derribar SGC-7901 y las células MKN45 habían reducido significativamente el crecimiento en comparación con los tumores producidos en ratones inyectados con células de control transfectadas con HK (P < 0,01). La tasa de inhibición del SGC-7901 y MKN45 derribar las células con inyección de grupo en el crecimiento del tumor fue de 40.29% y 37.48%, respectivamente (Figura 2E).
Para asegurar aún más la expresión OLFM4 se indeedly silenciado después de la inyección subcutánea de ratones desnudos, también evaluado OLFM4 expresión en xenoinjertos de tumores utilizando QRT-PCR y IHC. De manera similar in vitro, el nivel de mRNA OLFM4 en xenoinjertos de tumores producidos por OLFM4 desmontables células también mostró una disminución significativa en comparación con los tumores de control HK xenoinjertos (P < 0,01) (Figura 3A). En consonancia con los resultados de QRT-PCR, también se observó una reducción significativa de proteína OLFM4 en xenoinjertos tumorales por IHC (P < 0,01) (Figura 3B y 3C). escala de grises más alto y más fuerte señal positiva por la visualización DAB se encontraron en xenoinjertos tumorales del grupo con inyección de células de control de Hong Kong. Por el contrario, se observó tinción débil de color marrón en xenoinjertos de tumor de grupo inyectado-desmontables células OLFM4. Además, se observó más grande región necrosis en xenoinjertos de tumores producidos por las células de control HK debido a un rápido crecimiento de las células de control HK (panel superior Figura 3B). Estos datos proporcionan una fuerte indicación de que OLFM4 expresión en ARNm y los niveles de proteína se inhibe de forma estable en efecto in vivo. Tomado en conjunto, tanto in vitro e in vivo sugieren que OLFM4 knockdown inhibe el crecimiento de células de cáncer gástrico. Figura 3 Detección QRT-PCR y de IHC OLFM4 en xenoinjertos tumorales. A. QRT-PCR para ARNm OLFM4 en xenoinjertos tumorales. Plegables cambios en OLFM4 ARNm se determinaron utilizando el método 2-ΔΔCt. gen de la ß-actina se utilizó como control interno. B. H & E tinción (panel superior) y IHC para OLFM4 proteínas (panel inferior) en xenoinjertos tumorales. se muestran imágenes representativas (200 ×). N, necrosis. C. Análisis de cuantificación de la expresión OLFM4. El valor medio se midió a partir de cinco campos diferentes al azar bajo el microscopio (400 ×) V6.0 utilizando el Image-Pro Plus. Los datos se expresan como media ± desviación estándar. ** P < 0,01 frente al grupo de control HK.
OLFM4 derribo retrasos G1 a S transición, pero no desencadena la apoptosis obvia en células de cáncer gástrico
ha dado nuestro observado efectos inhibitorios sobre el crecimiento celular in vitro e in vivo, hemos tratado de determinar si aumento de la apoptosis o la progresión del ciclo celular retardada se asoció con la inhibición del crecimiento. En primer lugar, se evaluó el efecto de la disminución de OLFM4 en la progresión del ciclo celular. Como se muestra en la figura 4A, tanto OLFM4 knockdown SGC-7901 y las células MKN45 mostraron números crecientes significativos en la fase G1 y los números se redujeron en la fase S, en contraste con sus células HK de control (P < 0,01). No se observaron diferencias significativas en el /M-fase G2, indicando un retraso G1 típico de ciclo celular. Figura 4 Evaluación de la distribución del ciclo celular, apoptosis y la caspasa-3 de activación /9 en OLFM4 derribar células de cáncer gástrico. A. Análisis del ciclo celular. Los cambios en la distribución del ciclo celular de las SGC-7901-HK, SGC-7901-siOLFM4 y MKN45-HK, células MKN45-siOLFM4 fueron analizados por FCM. Los datos representan la media del porcentaje de distribución de fase del ciclo celular (n = 3). análisis de apoptosis de las células B.. La apoptosis se estimó con AnnexinV-PE /7-AAD tinción de FCM. Los datos representan el porcentaje medio de las células apoptóticas (n = 3). C. caspasa-3 y -9 activaciones. La caspasa-3, se muestran 9 activaciones entre las células indicadas. ** P < 0,01 frente al grupo de control HK.
Para determinar si la apoptosis está implicada en esta inhibición del crecimiento, A continuación realizó un análisis de la apoptosis celular. Curiosamente, la expresión reducida OLFM4 no podría dar lugar a cambios significativos en la apoptosis (Figura 4B), que es coherente con el análisis del ciclo celular que muestra ninguna fase sub-G1 evidente en las células de la prueba. De examinar más a alteraciones de las señales de apoptosis, la actividad de caspasa-3 /-9 también fue identificado por ensayos colorimétricos de activación. Tanto la caspasa-3 y -9 activaciones no mostraron cambios significativos después de la caída de OLFM4 en SGC-7901 y las células MKN45 (Figura 4C). Estos resultados sugieren que la regulación por disminución de OLFM4 puede ejercer un efecto inhibidor sobre el crecimiento celular mediante la regulación de la progresión del ciclo celular no implica la apoptosis en células de cáncer gástrico.
Supresión de OLFM4 sensibiliza a las células de cáncer gástrico a H2O2 o TNF α apoptosis inducida
el efecto distinto de H 2O 2 o TNF α en la apoptosis entre OLFM4 derribar y también fue investigado las células de control HK. OLFM4 derribo o células de control se trataron con HK 10, 100 y 1000 mM H 2O 2 o 5, 10 y 50 ng /ml de TNF α, respectivamente. se evaluaron la viabilidad celular y la apoptosis. Como se muestra en la Figura 5A-D, se observó una disminución dependiente de la dosis en la viabilidad celular en H 2O 2 o TNF α tratados OLFM4 derribar las células. Además, el tratamiento de 10 mM H 2O 2 (Figura 5A-B) o 10 ml alpha (Figura 5C-D) condujo a una reducción significativa de la viabilidad celular en OLFM4 derribar células ng /TNF en comparación con HK las células de control (P < 0,01). De particular interés es el hallazgo de que OLFM4 desmontables células en lugar de células de control HK tratados con 10 ~ 1,000 M H 2O 2 exhibieron más prominentes porcentajes de apoptosis en comparación con los tratados con PBS mock (P < 0,01) ( Figura 5A-B). Resultados similares se observaron en las células del TNF alfa-tratada OLFM4 desmontables (Figura 5C-D). En otras palabras, OLFM4 derribar mejorada H 2O 2 o TNF apoptosis α-inducida en células de cáncer gástrico, indicando la eliminación de OLFM4 hecho SGC-7901 y las células MKN45 más sensibles al tratamiento de H 2O 2 o TNF α. Figura 5 Respuesta de OLFM4 desmontables células MKN45 SGC-7901 y para los agentes inductores de apoptosis H 2 O 2 o TNF alfa. OLFM4 desmontables y control de las células HK se trataron con H2O2 (A y B) o α TNF (C y D) como dosis indicadas durante 12 h. La viabilidad celular se midió por ensayo de WST-1 (paneles de la izquierda A-D) y se expresa en el valor medio de DO (450 nm) (n = 3). El porcentaje de las células apoptóticas se determinó mediante FCM (A-D paneles de la derecha) y se expresa en el porcentaje medio de apoptosis (n = 3). * P < 0,05, ** P < apoptosis 0,01 vs grupo control HK.
caspasa-3 actividad está involucrada en H2O2 o TNF α inducida en OLFM4 knock-down células
Los resultados anteriores indicaron que derribo de OLFM4 podría aumentar H 2O 2 o TNF α-estimuló la apoptosis. A fin de verificar si la caspasa-3 se activa en el H 2O 2 o TNF apoptosis α inducida en las células desmontables OLFM4, el próximo detectó la activación de la caspasa-3 en H 2O 2 o TNF a-células tratadas usando un ensayo colorimétrico. Como se muestra en la Figura 6A, el tratamiento de H 2O 2 o α TNF dio como resultado mucho más mejora de la actividad de caspasa-3 en células desmontables OLFM4 que las células de control HK (P < 0,01), lo que sugiere la actividad de caspasa-3 está involucrado en el H 2O apoptosis inducida por α 2 o TNF en las células desmontables OLFM4. A fin de verificar si H 2O 2 o TNF apoptosis α inducida depende de la caspasa-3 actividad, Z-VAD-FMK, un inhibidor de la caspasa se utilizó antes de que el tratamiento de H 2O 2 o TNF α. Pre-tratamiento de la Z-VAD-fmk significativamente atenuada H 2O 2 o TNF apoptosis de las células α inducida, así como la actividad de caspasa-3 en ambos OLFM4 desmontables células (P < 0,01) (Figura 6C-D ), indicando que H 2O 2 o TNF α apoptosis inducida es la caspasa-3 depende en desmontables células OLFM4. Figura 6 La participación de la actividad de caspasa-3 en H 2 O 2 o TNF α la apoptosis inducida en células OLFM4 caída MKN45 SGC-7901 y. (A-B) Aumento de la actividad de caspasa-3 en las células desmontables OLFM4 alfa-tratadas con H2O2 o TNF. desmontables células OLFM4 y HK-control se trataron con 10 mM H2O2 (A) o 10 ng /ml de TNF α (B) durante 12 h. la actividad de caspasa-3 se midió usando un ensayo colorimétrico y se expresa en cambios veces. ** P < 0,01 frente a PBS grupo mock (n = 3). (C-D) revocó la apoptosis celular por el inhibidor de la caspasa en las células desmontables OLFM4. Las células se trataron con H2O2 o TNF α solas con dosis indicadas como se mencionó anteriormente o pretratado con 20 mM Z-VAD-fmk 2 h antes de H2O2 o TNF α tratamiento. El porcentaje de células apoptóticas fue determinado por FCM. Los datos representan la media ± SD de tres experimentos independientes. ** P < 0,01 frente al H2O2 (C) o TNF α (D) tratados con OLFM4 desmontables grupo de células.
Discusión
Recientemente los datos que se acumulan demostraron OLFM4 frecuencia se sobreexpresa en muchos tipos de tumores humanos, incluyendo el cáncer gástrico, y se creía que era desempeñar un papel crucial en el desarrollo y progresión de la carcinogénesis gástrica [19, 20]. Aunque estudios previos han demostrado que OLFM4 está implicada en el crecimiento tumoral y la apoptosis, las observaciones recientes también sugieren que pueden existir células o tejidos específicos de los efectos para el gen OLFM4. Se sabe relativamente poco acerca del crecimiento del tumor y la expresión específica del cáncer gástrico subyacente apoptosis OLFM4. Para obtener una mejor comprensión de esta función para el OLFM4 alterado en el cáncer gástrico humano, se requiere soporte experimental para validar el papel del gen OLFM4 en el cáncer gástrico.
Se ha demostrado que la expresión anormal de hGC-1 puede ser regulada en el nivel transcripcional o posttranscriptional [13]. En nuestros trabajos actuales, que investigó directamente OLFM4 proteína patrón de expresión en células de cáncer gástrico y GES-1 células normales. SGC-7901 y las células MKN45 que expresan altos niveles de OLFM4 relativos fueron escogidos para este estudio. Desde la reducción de la expresión del gen diana por medios genéticos en líneas celulares establecidas es útil para una mejor comprensión de su papel en el mantenimiento del fenotipo maligno en particular en el análisis de genes que son esenciales para la supervivencia celular [21], se generaron grupos de clones estables de SGC-7901 y MKN45 expresar OLFM4-siRNA o control HK revueltos por el enfoque basado en siRNA plásmido y se confirmó la eficiencia knock-down del gen OLFM4 en mRNA y los niveles de proteína de QRT-PCR y Western Blot.
Nuestros trabajos actuales demuestran que juega un OLFM4 papel esencial en la tumorigénesis del cáncer gástrico. Desmontables de OLFM4 inhibe la proliferación celular y la capacidad de crecimiento independiente de anclaje in vitro. modelo de tumor de xenoinjerto in vivo implica también que la disminución de OLFM4 puede inhibir el crecimiento de tumores de células de cáncer gástrico humano. Estos resultados indican que OLFM4 juega un papel crucial en la proliferación celular de células de cáncer gástrico. Nuestros resultados también observaron que knock-down de OLFM4 no influyó en la tasa de apoptosis y la caspasa-3 y 9 activaciones en OLFM4 desmontables células, lo que sugiere que la apoptosis podría no ser el mecanismo subyacente a la inhibición del crecimiento tumoral. Por lo tanto, postulamos que la expresión OLFM4 no es esencial para la supervivencia de células de cáncer, que es de acuerdo con un reciente observación de que los ratones genéticos de eliminación directa para OLFM4 muestran el desarrollo normal y fenotipos hematopoyéticas [17]. Para caracterizar adicionalmente el mecanismo subyacente a la inhibición del crecimiento, se realizó el análisis del ciclo celular y demostramos que la inhibición de la expresión OLFM4 indujo células de cáncer gástrico para acumular en la fase G1 del ciclo celular, lo que sugiere que OLFM4 regulada hacia abajo puede ejercer un efecto inhibidor sobre el crecimiento celular por una progresión del ciclo celular mecanismo de regulación que no impliquen la apoptosis en células de cáncer gástrico.
resistencia de las células tumorales para la inducción de la apoptosis es uno de los principales factores responsables del fracaso de muchos tratamientos contra el cáncer convencionales que utilizan agentes contra el cáncer y la radiación. Por lo tanto, el control de la apoptosis en las células cancerosas es de importancia biológica y clínica crítica [22, 23]. La actividad anti-apoptótica es otra función importante del gen OLFM4 [2]. En particular, H 2O apoptosis celular inducida por 2 fue atenuada por sobreexpresada OLFM4 en una línea celular de cáncer de próstata [2]. Además, las células MKN45 han demostrado una capacidad de resistencia a la apoptosis inducida por TNF α [24]. Teniendo en cuenta estos resultados, la hipótesis de que desmontables de expresión OLFM4 podría mejorar H apoptosis inducida por α 2 o TNF 2O en células de cáncer gástrico. Aquí, mostramos que knock-down de OLFM4 efectivamente aumento de la apoptosis celular en respuesta a H 2O 2 o TNF α estimulación en MKN45 así como las células SGC-7901, lo que sugiere bloqueo OLFM4 puede aumentar la susceptibilidad de cáncer gástrico células a la presencia de H 2O 2 o TNF α.
Como es bien sabido que la caspasa-3, una molécula ejecutivo clave de la vía apoptótica, desempeña un papel fundamental en los procesos de apoptosis en una variedad de las células. Además, examinó la activación de caspasa-3 en OLFM4 desmontables y control de las células HK en presencia o ausencia de inhibidor de caspasa Z-VAD-fmk. Hemos observado que el tratamiento de H 2O 2 o TNF alfa significativamente hasta reguladas actividad de caspasa-3 en células desmontables OLFM4 que las células de control HK mientras que el tratamiento previo con Z-VAD-fmk invierte la actividad de caspasa-3, así como H 2O 2 o TNF α apoptosis inducida. Los resultados indican que H apoptosis inducida por α 2 o TNF 2O en desmontables células OLFM4 es dependiente de caspasa-3. Sobre la base de los datos actuales, es concebible que OLFM4 hasta reguladas permite a las células de cáncer gástrico para resistir la inducción de apoptosis por la disminución de la susceptibilidad a medicamentos contra el cáncer.
De hecho, los antagonistas de OLFM4 se han reportado para inhibir la proliferación de otros tipos de las células de cáncer como el cáncer de páncreas células humanas PANC-1 [8] y células de pulmón humano caner SBC-1 [9]. Sin embargo, también se han observado resultados controvertidos. Disminución OLFM4 mRNA inhibir las células PANC-1 por la proliferación S a G2 /M fase de la detención [8], que es diferente de los resultados que muestran el progreso fase G1 tardía en el cáncer gástrico. Ciertos datos de interés (o razones) podrían explicar esta discrepancia. En primer lugar, ya que estudios recientes sugieren, un papel célula o tejido específico de OLFM4 (células de cáncer gástrico y las células de cáncer de páncreas) puede ser una explicación convincente de esta discrepancia. La más notable es decir, la expresión OLFM4 a nivel de ARNm pero no el nivel de proteína en las células PANC-1 se midió con éxito utilizando RT-PCR [8], mientras que el más reciente informe de Kim et al. mostraron que las células PANC-1 tiene ninguna expresión OLFM4 ARNm [25], lo que indica el patrón de expresión y el papel de gen OLFM4 en las células PANC-1 necesitan confirmación adicional.
pesar OLFM4 silenciamiento se demostró que un efecto inhibidor sobre el crecimiento celular y una disminución de la resistencia a H 2O 2 o TNF α tratamiento en células de cáncer gástrico, no se eliminó que otros mecanismos también pueden ser reguladas por OLFM4 y contribuye a la inhibición del crecimiento y la señalización de control de la apoptosis, teniendo en cuenta la diafonía de la red .

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