Vyčerpanie OLFM4 gén inhibuje bunkový rast a zvyšuje senzibilizáciu na peroxid vodíka a faktor nekrózy nádorov-alfa indukovanej-apoptózy v rakovinových bunkách žalúdku

Vyčerpanie OLFM4 gén inhibuje bunkový rast a zvyšuje senzibilizáciu na peroxid vodíka a faktor nekrózy nádorov-alfa indukovanej-apoptózy v rakovinových bunkách žalúdočných
abstraktné
pozadia
Human olfactomedin 4 génu (OLFM4) secernuje glykoproteín častejšie známy ako anti-apoptotické molekuly GW112. OLFM4 je zistené, že je často up-regulovaná v mnohých typov ľudských nádorov, vrátane karcinómu žalúdka, a to sa verilo, že hrá významnú úlohu v progresii rakoviny žalúdka. Hoci funkcia OLFM4 bolo uvedené v mnohých štúdiách, nedávny dôkaz silne naznačuje, typu v závislosti na bunkovej alebo tkanivovej rolu OLFM4 rastu buniek a apoptózy. Cieľom tejto štúdie je preskúmať úlohu rakovinou žalúdka špecifickú expresiu OLFM4 rastu buniek a odolnosť proti apoptóze.
Metódy
OLFM4 výraz bol vylúčený RNA interferencie v SGC-7901 a MKN45 buniek. bunková proliferácia, ukotvenie Rast nezávislý, bunkového cyklu a apoptóza boli charakterizované in vitro. Karcinogenity bola analyzovaná in vivo. Apoptóza a kaspázy-3 aktivácia ako odpoveď na peroxid vodíka (H 2O 2), alebo tumor nekrotizujúci faktor-alfa (TNF α) sa hodnotila v prítomnosti alebo neprítomnosti inhibítora kaspázy Z-VAD-fmk.
Výsledky
elimináciu OLFM4 proteínu RNA interferencie v SGC-7901 a MKN45 buniek významne inhibuje tumorigeničnosti oba in vitro a in vivo indukcii bunkovej G1 zástavy (všetky P < 0,01). OLFM4 knockdown nespustil zrejmý apoptózu buniek, ale zvyšuje H 2O 2 alebo TNF α apoptóza indukovaná a kaspasy-3 aktivita (všetky P 0,01). Liečba Z-VAD-fmk atenuovaný kaspázy-3 a majú podstatne obrátenej H 2O 2 alebo TNF α-indukovanú apoptózu v bunkách porazený OLFM4 (všetky P &0,01). Záver
Naša štúdia naznačuje, že vyčerpanie OLFM4 významne inhibuje tumorigeničnosti rakoviny žalúdka SGC-7901 a MKN45 buniek. Blokovanie OLFM4 výraz možno citlivosť rakovinových buniek žalúdočnej až H 2O 2 alebo TNF α liečby zvýšením kaspasy-3 závislú apoptózu. Kombinácia stratégia založená na OLFM4 inhibícia a protinádorových liečiv liečby môže poskytnúť liečebný potenciál v žalúdku intervencii rakoviny.
Kľúčové
Karcinóm žalúdka Olfactomedin 4 RNA interferencie rastu apoptózu odbojovej pozadí
Human OLFM4 (olfactomedin 4, tiež známy ako HGC-1, GW112), pôvodne nazývaný ľudský klonovaný z myeloidných progenitorových buniek po stimulácii stimulujúci kolónie granulocytov faktora [1], je secernovaný glykoproteín, ktorý je skôr známy ako anti-apoptotický molekuly GW112 [2, 3]. OLFM4 je normálne exprimovaný v kostnej dreni, prostaty, tenkého čreva, žalúdka, hrubého čreva a pankreasu [1, 4]. Následne sa zvýšila OLFM4 hladiny boli tiež nájdené v epitelu krýpt zo zapálenej sliznice hrubého čreva zápalových črevných ochorení, [5], a v žalúdočných biopsiách infikovaných Helicobacter pylori [6, 7]. V poslednej dobe, up-regulovaný OLFM4 expresie bola popísaná v pľúc a prsníka [8], prostaty [3], žalúdka [3, 9] a rakoviny pankreasu [8, 9], rovnako ako u kolorektálneho adenómu [10-14].
bolo navrhnuté, že OLFM4 sa podieľa na bunkovej procesu, ako je napríklad apoptóza a rast nádoru [2]. Aj keď je bunková funkcia OLFM4 bola skúmaná, tieto výsledky nie vždy zhodný. Nadmerná expresia OLFM4 Bolo preukázané, že pre uľahčenie myši nádory prostaty Tramp-C1 bunky rast syngenních C57 /BL6 myší [2], ale inhibuje rakoviny prostaty PC-3 proliferáciu ľudských buniek [15]. Okrem toho up-regulovaný OLFM4 ukázala silnú anti-apoptotické aktivitu v myšiach lymfoidných žily endotelových Svec buniek a ľudských adenokarcinóme Hela bunkách [1, 2], vzhľadom k tomu, nedávna zistenie navrhol proapoptotický účinok OLFM4 v ľudských myeloidnej leukémie HL-60 buniek [16 ]. Dôkazy z týchto štúdií naznačuje, že úloha OLFM4 v riadení bunkového rastu a apoptózy môže závisieť od typu bunky alebo tkanivá [10, 13-15]. Do dnešného dňa však len veľmi málo údajov o úlohe OLFM4 do bunkového rastu a apoptózy profily buniek karcinómu žalúdka bol publikovaný.
V tejto štúdii sme analyzovali expresiu proteínu v OLFM4 buniek karcinómu žalúdka a normálnej ľudskej žalúdočnej epiteliálne GES-1 buniek westernovým prenosom. Použitie sprostredkovaná plazmidmi krátka vlásenka RNA (zhrnie), my inhibuje OLFM4 výraz v rakoviny žalúdka SGC-7901 a MKN45 bunky pozorovať proliferáciu buniek, fázy bunkového cyklu, apoptózy in vitro a posúdiť jeho karcinogénny kapacitu in vivo. Tiež preskúmal apoptózu a kaspasy-3 aktivácia ako odpoveď na cytotoxické látky, ako je H 2O 2 alebo TNF α, v prítomnosti alebo neprítomnosti inhibítora kaspázy Z-VAD-fmk medzi OLFM4 porazený bunky a kontrolné bunky HK .
Metódy
na bunkových kultúrach, činidlá a myši
ľudské rakovinové bunky žalúdočnej BGC-823, HGC-27, SGC-7901, MKN28, MKN45 a normálne ľudské žalúdočné epitelové GES-1 bunky boli udržiavané médiu DMEM (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) obsahujúcim 10% fetálneho hovädzie sérum (FBS, Gibco BRL, USA), 100 U /ml penicilínu a 100 ug /ml streptomycínu. H 2O 2 a TNF-α boli získané od firmy Sigma (St. Louis, MO) a Z-VAD-fmk bol zakúpený od firmy Calbiochem (San Diego, CA). BALBI /C nude (nu /nu) myší (4-6 týždňov staré, SPF stupeň, 20 ± 3 g) boli zakúpené od pokusného zvieraťa Center Chongqing lekárskej univerzity (Chongqing, Čína). Všetky postupy boli vykonané v súlade s medzinárodne uznávanými etickými smernicami (NIH publikácia č. 85-23, revidované 1985).
Plasmid konštruuje a stabilné transfekcia
zhrnieme sprostredkovanej RNAi plazmidu (pGenesil 1,1-siOLFM4) a rušeným kontroly plazmid (pGenesil 1,1-HK) boli skonštruované tak, aby zraziť endogénneho OLFM4 v SGC-7901 a MKN45 buniek. Po transfekciu a neomycín (G418) výber, OLFM4 knock-down SGC-7901-siOLFM4, MKN45-siOLFM4 bunky a miešaná SGC-7901-HK, kontrolné bunky MKN45-HK boli stabilne získané, respektíve (podrobnosti uvedené v ďalšej súbor 1: Doplnkový dáta).
extrakcie RNA a kvantitatívnej RT-PCR (QRT-PCR)
Celková RNA v rôznych bunkách alebo nádorové xenoimplantáty bola extrahovaná RNeasy Mini Kit (Qiagen, CA, USA), a nasledovala syntézu cDNA pomocou reťazca cDNA syntézu systém ReverTra Ace-alfa-first (Toyobo, Osaka, Japonsko), ako je popísané predchádzajúca [17]. Kvantitatívny real-time PCR bola vykonaná za použitia 7500 real-time PCR systém (Applied Biosystems) s SYBR-green ako fluorescenčným farbivom (Toyobo, Osaka, Japonsko) (podrobnosti zobrazovať v ďalších súboru 1: doplnkové dáta). Záhyb zmeny v génovej expresie boli stanovené s použitím "2 - ddCT". [18] spôsob
testu proliferácie buniek pri meraní in vitro a životaschopnosti buniek
bunkovej proliferácie a životaschopnosti buniek bola meraná s použitím bunkovej proliferácie WST-1 kit (Roche ) podľa inštrukcií výrobcu. Pre proliferáciu buniek, bunky boli schovať v hustote 1 x 10 3 buniek na jamku 96-jamkové doštičky a pestované počas 5 dní. Hodnota optickej hustoty (450 nm) bola detekovaná pomocou Microplate Reader (TACAN, Svazijsko) za deň. Každý test bol vykonaný v troch opakovaniach. Pokiaľ ide o meranie životaschopnosti buniek, bunky (1 x 10 4 /jamku) boli nasadené v množstve 200 ul média vo 96-jamkových doštičkách. Po 12 hodinách inkubácie H 2O 2 alebo TNF α bol ošetrený v indikovaných koncentráciách. Relatívna absorpcia bola meraná, ako je popísané v bunkovej proliferácii.
Anchorage-nezávislé testu rastu
Anchorage Rast nezávislý bola vykonaná na mäkkom agare, aby odrážal in vitro clonogenicity. Bunky (5 x 10 2) z každej kolónie boli suspendované v 0,3% agare v DMEM a potom nanesené na spevnené agarom (0,5%) v 6-jamkových miskách. Bunky boli inkubované po dobu 2 týždňov pri 37 ° C v 5% CO 2 predtým, ako bola meraná kolónie. Počet kolónií bola počítaná pri 200 x zväčšení päť náhodných polí. Každý test bol vykonaný v troch opakovaniach.
Analýza prietokovou cytometriou
Prietoková cytometria (FCM), analýza bola vykonaná za účelom posúdenia progresie bunkového cyklu alebo apoptózu. (Podrobnosti uvedené v ďalšej oblasti 1: doplňujúce údaje)
Caspase test
enzýmovej aktivity kaspázy-3 a -9 sa merala pomocou testu fluorometricky podľa spôsobu popísaného skôr [8]
Western blot analýzy.
Western blot bola vykonaná, ako bolo opísané skôr [17]. Tieto protilátky boli použité pre western blotting: anti-OLFM4 (abca, Cambridge, UK) a anti-β-aktínu (Santa Cruz, CA, USA) Relatívna množstvo proteínov sa analyzovala s použitím množstva One softvér (Bio-Rad, Hercules , CA, USA) a normalizuje na aktivitu beta-aktínu (detaily uvedené v ďalšej súbor 1 :. Doplňujúce údaje)
modelu xenoimplantátu nádoru
Štyridsať nahé myši boli rozdelené do štyroch skupín v náhodnom poradí. Každá skupina bola injikovaný subkutánne do chrbta sa suspenziou 200 ul s obsahom 2 x 10 6 buniek bolo uvedené vyššie, v danom poradí. Objem xenoimplantátů bola meraná sériovo. Myši boli usmrtené po 35 dňoch. Tieto xenoimplantáty boli vyrezané a zvážené. Inhibičný rýchlosti xenoimplantátům boli vypočítané podľa tohto vzorca: inhibícia sadzba (%) = 1-priemerná hmotnosť (OLFM4 zraziť bunky injekčne skupina alebo kontrolné HK bunky injekčne skupina) /Priemerná hmotnosť (Control HK bunky injekčne Group) × 100%. Potom je nádorové tkanivo bolo predmetom úplnej izolácii RNA alebo zisťovanie imunohistochemického.
Imunohistochémia (IHC)
OLFM4 proteíny v nádorových xenoimplantátů boli analyzované pomocou IHC použitím králičie-anti OLFM4 (abca, Cambridge, UK) (podrobnosti uvedené v ďalší súbor. 1: doplňujúce údaje) štatistiky
dát z nezávislých experimentov boli vyjadrené ako stredná hodnota ± SD najmenej z troch pokusov. Porovnanie medzi skupinami boli analyzované pomocou dvojstranného Studentov
-test alebo ANOVA, podľa potreby a hodnoty p < 0,05 boli považované za štatisticky významné.
Výsledky
efektívne zraziť z OLFM4 génu plazmidu sprostredkovaná siRNA v nádorových bunkách žalúdku
OLFM4 expresie proteínu vzor bol vyšetrovaný v karcinómu žalúdka BGC-823, HGC-27, SGC-7901, MKN28, MKN45 bunky a normálne GES-1 kontrolný bunky (obrázok 1a). OLFM4 proteín rozhodne vyjadruje vo všetkých týchto žalúdočných rakovinových buniek a buniek GES-1. Najmä SGC-7901 a MKN45 bunky vyjadrené relatívne vysokej úrovni OLFM4 bielkovín ako iné žalúdočné rakovinové bunky a GES-1 buniek. Z tohto dôvodu, SGC-7901 a MKN45 bunky boli vybrané pre ďalšie štúdium. Obrázok 1 Efektívne porazený z OLFM4 podľa RNA interferencia u karcinómu žalúdka SGC-7901 a MKN45 buniek. A. Expresia OLFM4 proteínu v rôznych bunkových línií karcinómu žalúdka. Expresia profil OLFM4 proteínu bola analyzovaná pomocou Western blotting s beta-aktínu ako vnútorná kontrola. Bunky GES-1 boli slúžili ako normálne kontrolné bunky. Výraz B. OLFM4 mRNA v bunkách Knockdown OLFM4. Relatívna expresia OLFM4 bola detekovaná QRT-PCR. β-aktínu bol použitý ako vnútorná kontrola. Sklopné zmeny v expresii OLFM4 mRNA boli stanovené metódou 2-ΔΔCt. expresia proteínov C. OLFM4 v Knockdown bunkách OLFM4. Expresia OLFM4 proteín bol detekovaný Western Blot. beta-aktínu proteín bol použitý ako vnútorná kontrola. sú zobrazené zástupcovia troch pokusov. ** P < 0,01 vs. kontrolné bunky HK skupiny (n = 3).
K down-reguláciu expresie OLFM4, je zhrnieme zacielenie génu OLFM4 plazmid sprostredkované bola konštruovaná tak, aby stabilne zraziť OLFM4 expresiu v SGC-7901 a MKN45 buniek. Ako je ukázané na obrázku 1B, hladiny mRNA OLFM4 boli významne znížené v SGC-7901-siOLFM4 a MKN45-siOLFM4 buniek v porovnaní s ich kontrolou HK alebo rodičovských buniek (P 0,01). Tieto výsledky boli ďalej potvrdená western blot analýzou (obrázok 1C). Žiadny významný rozdiel v OLFM4 expresie bola pozorovaná medzi rodičovskými a HK kontrolných buniek. Hladiny mRNA a proteín pre beta-aktínu boli podobné medzi rôznymi skupinami. Tieto výsledky naznačujú, že plazmid sprostredkovaná OLFM4-siRNA špecificky a účinne zraziť úroveň OLFM4 do buniek karcinómu žalúdka. S ohľadom na analýze uvedenej, teda OLFM4 zraziť bunky a kontrolné bunky HK boli vybrané pre ďalšie vyšetrovanie.
OLFM4 porazený inhibuje žalúdočné proliferáciu rakovinových buniek a ukotvenie nezávislý rast in vitro
Pre stanovenie role OLFM4 v žalúdočnej rakovina rast buniek, sme skúmali účinok OLFM4-siRNA na rast buniek v deň 1-5 časovom bode WST-1 test. Ako je ukázané na obrázku 2A, vo všetkých dvoch žalúdočné rakovinové bunkové línie, rast OLFM4 zraziť buniek bola významne znížená v porovnaní s kontrolnými bunkami HK z 3 (P 0,01). Ďalej skúmať význam OLFM4 pri vzniku nádorov rakovinových buniek žalúdka in vitro sme vykonali testy rastu ukotvenie nezávislý a našiel SGC-7901 a MKN45 bunky exprimujúce ovládacích prvkov HK rástol dobre v mäkkom agare, tvoriť odlišné kolónie. Na rozdiel od toho OLFM4 knockdown SGC-7901 a MKN45 bunky vykazovali dramatické zníženie počtu kolónií mäkkom agare (P 0,01) (Obrázok 2B), čo ukazuje transformáciu schopnosti menšie ako kontrolné bunky. Tieto údaje naznačujú, že príklep z OLFM4 môže inhibovať proliferáciu rakovinových buniek žalúdočnej a ukotvenie nezávislý rast in vitro. Obrázok 2 Vyradenie OLFM4 inhibuje rast SGC-7901 a MKN45 buniek in vitro a in vivo. A. Bunkový rast krivky. proliferácie buniek in vitro bola stanovená krivka rastu buniek, ako bolo určené sčítaním počtu buniek (WST-1 test) v SGC-7901 buniek (ľavý panel) a MKN45 bunky (pravý panel). Hodnota OD (450 nm) bolo počítané na uvedené dni a prezentované ako priemerné počty buniek (n = 3). B. Anchorage nezávislý rast na mäkkom agare. Reprezentatívne obrazy troch pokusov boli ukazované (horný panel). Údaje predstavujú stredné počet kolónií počítaných na 200 × zväčšenie 5 náhodných polí (spodný panel). C. Stredná objem nádoru po subkutánnej injekcii u nahých myší s HK ovládania alebo porazený buniek OLFM4 bola meraná v uvedených časových bodoch. D. Reprezentatívny nádory obrázkov na 35 dní po subkutánnej injekcii uvedených buniek. Hmotnosť E. Mean tumor (ľavý panel) a inhibičné rýchlosť (pravý panel) v štepov tumorov z cudzej. Údaje predstavujú stredná hmotnosť nádoru z xenoimplantátů (priemer ± SD, n = 10). ** P < 0,01 vs. HK kontrolná skupina.
Growth-inhibičný účinok znížil OLFM4 v žalúdočných štepov tumorov z cudzej
Okrem toho sme tiež hral podkožného nádoru formatívne testu u holých myší vyhodnotiť potlačenie rastu účinok down-regulované OLFM4 in vivo. Nahých myší bolo subkutánne podali OLFM4 Knockdown alebo kontrolných buniek HK. Nádorové objemy za 4 dni a hmotnosť nádoru v 5 týždňoch boli merané v tomto poradí po subkutánnej injekcii. Ako je ukázané na obrázku 2C-D, či je objem nádoru alebo nádoru hmotnosť vyrobenej OLFM4 zraziť SGC-7901 a MKN45 buniek sa významne znížil rast v porovnaní s nádormi vyrobených u myší injikovaných bunkami kontrolných transfekciou HK (P 0,01). Inhibičný miera SGC-7901 a MKN45 zraziť bunky injekčne skupina na rast nádoru bola 40,29% a 37,48% v uvedenom poradí (obr 2E).
K ďalšiemu zabezpečiť OLFM4 výraz indeedly umlčaný po podkožnej injekcii u nahých myší, sme tiež hodnotená OLFM4 expresie v nádorových xenografe pomocou QRT-PCR a IHC. Rovnako tak in vitro, na úrovni mRNA OLFM4 v nádorových xenografe produkovaných OLFM4 porazený bunky tiež ukázal výrazný pokles v porovnaní s HK Kontrolné tumory xenoimplantátů (P 0,01) (obrázok 3A). V súlade s výsledkami QRT-PCR, významné zníženie OLFM4 proteínu bola tiež pozorovaná v nádorových xenografe podľa IHC (P 0,01) (obrázok 3B a 3C). Vyššie stupne šedi a silnejší pozitívny signál o DAB vizualizácie boli nájdené v štepov tumorov z cudzej riadiacich HK bunky injekčne skupine. Naopak, slabé hnedé sfarbenie bolo pozorované v nádorových xenografe z OLFM4 porazený bunky injekčne skupine. Ďalej, viac veľkých nekrózy región bol pozorovaný v nádorových xenografe produkovaných HK kontrolných bunkách, v dôsledku rýchleho rastu HK kontrolných buniek (obrázok 3B horný panel). Tieto údaje za predpokladu, naznačujú, že program OLFM4 expresiu na mRNA a množstva bielkoviny sú stabilne inhibuje skutočne in vivo. Prijatá spoločne, a to ako in vitro a in vivo experimentov naznačujú, že OLFM4 knockdown inhibuje rast buniek karcinómu žalúdka. Obrázok 3 QRT-PCR a IHC detekciu OLFM4 v nádorových xenografe. A. QRT-PCR pre OLFM4 mRNA v nádorových xenografe. Sklopné zmeny v OLFM4 mRNA boli stanovené metódou 2-ΔΔCt. beta-aktínu gén bol použitý ako vnútorná kontrola. B. H &E farbenie (horný panel) a IHC pre OLFM4 proteín (dolný panel) v nádorových xenoimplantátů. sú zobrazené reprezentatívne obrazy (200 ×). N, nekróza. C. Kvantifikácia analýza OLFM4 výrazu. Priemerná hodnota bola nameraná z piatich náhodne rôznych odborov pod mikroskopom (400 x) s použitím programu Image-Pro Plus V6.0. Údaje boli vyjadrené ako priemer ± SD. ** P < 0,01 vs. kontrolnej skupine HK.
OLFM4 knock-down spomaľuje G1 do S prechodom, ale nespúšťa apoptózu v zrejmý buniek karcinómu žalúdka
Vzhľadom k tomu, naša pozorované inhibičné účinky na rast buniek in vitro a in vivo, sme sa snažili určiť či zvýšená apoptóza alebo oneskorenie progresie bunkového cyklu bola spojená s inhibíciou rastu. Najprv sme vyhodnotili vplyv zníženej OLFM4 na progresiu bunkového cyklu. Ako je znázornené na obrázku 4A, a to ako OLFM4 porazený SGC-7901 a MKN45 bunky vykazovali výrazné zvýšenie počtu v G1 fáze a znížilo chovy v S fáze, na rozdiel od svojich kontrolných buniek HK (P 0,01). Žiadne významné rozdiely sa nepozorovali v G2 /M-fáza, čo ukazuje typickú G1 oneskorenie bunkového cyklu. Obrázok 4 Posúdenie distribúcie bunkového cyklu, apoptózy buniek a kaspázy 3- /9 aktivácia v OLFM4 zraziť rakovinové bunky žalúdočnej. A. Analýza bunkového cyklu. Zmeny v distribúcii bunkového cyklu SGC-7901-HK, SGC-7901-siOLFM4 a MKN45-HK, MKN45-siOLFM4 Bunky boli analyzované pomocou FCM. Údaje predstavujú stredné percento rozdelenie fáz bunkového cyklu (n = 3). B. Analýza apoptózu buniek. Apoptóza bola odhadnutá s AnnexinV-PE /7-AAD farbenie FCM. Údaje predstavujú stredné percento apoptotické bunky (n = 3). C. kaspasy-3 a -9 aktivácie. Kaspázy-3, sú uvedené 9 aktivácia medzi uvedenými bunkami. ** P < 0,01 vs. kontrolnej skupine HK.
Na určenie, či apoptóza sa podieľa na tejto inhibícia rastu, sme ďalšie vykonaná analýza buniek apoptózu. Je zaujímavé, že znížená expresia OLFM4 nemôže viesť k významným zmenám v apoptóze (obrázok 4B), čo je v súlade s analýzou bunkového cyklu nevykazuje zjavné sub-G1 fáze v testovaných bunkách. Ďalej skúmať zmeny apoptických signálov, kaspázy-3 /-9 aktivita bola tiež identifikovaná kolorimetrickými aktivačnými testy. Oba kaspázy-3 a -9 aktivácia nepreukázali žiadne významné zmeny po Vyradenie OLFM4 v SGC-7901 a MKN45 buniek (obr 4C). Tieto výsledky naznačujú, že down-regulácia OLFM4 môže pôsobiť inhibičný účinok na rast buniek tým, že reguluje progresiu bunkového cyklu, ktorá nevyžaduje apoptózu buniek karcinómu žalúdka.
Výmaz OLFM4 senzitizujú žalúdočné rakovinové bunky na H2O2 alebo TNF indukovanej apoptózy
výrazný efekt H 2O 2 alebo TNF α na apoptózu medzi OLFM4 zraziť k zemi a kontrolné bunky HK bol tiež vyšetrovaný. OLFM4 zraziť alebo kontrolné bunky HK boli ošetrené 10, 100 a 1000 uM H 2O 2 alebo 5, 10 a 50 ng /ml TNF a, resp. Životaschopnosť a apoptóza Bunková boli hodnotené. Ako je znázornené na obrázku 5A-D, bol pozorovaný pokles závislý od dávky životaschopnosti buniek v H 2O 2 alebo TNF α-spracuje OLFM4 zraziť bunky. Okrem toho, liečenie 10 uM H 2O 2 (Obrázok 5A-B) alebo 10 ng /ml TNF a (5C-D), viedlo k významnému zníženiu životaschopnosti buniek v OLFM4 zraziť bunky v porovnaní s HK kontrolné bunky (P 0,01). Zvlášť zaujímavé je zistenie, že OLFM4 porazený bunky skôr než kontrolné bunky HK ošetrené 10 ~ 1000 um H 2O 2 vykazoval výraznejšie apoptózy percenta v porovnaní s pacientmi liečenými PBS falošný (P < 0,01) ( obrázok 5A-B). Podobné výsledky boli tiež pozorované u TNF porazený bunkách alfa ošetrených OLFM4 (5C-D). Inými slovami, OLFM4 zraziť zvýšenú H 2O 2 alebo TNF α-indukovanú apoptózu v rakovinových bunkách žalúdka, čo ukazuje deléciu OLFM4 vyrobená SGC-7901 a MKN45 bunky citlivejšie na liečbu H 2O 2 alebo TNF α. Obrázok 5 Odozva OLFM4 porazený SGC-7901 a MKN45 buniek apoptózu indukujúcich činidiel H 2 O 2 alebo TNF alfa. OLFM4 porazený a kontrolné bunky HK boli ošetrené H2O2 (A a B) alebo TNF (C a D), ako je uvedené dávkach počas 12 hodín. Životaschopnosť buniek bola meraná pomocou WST-1 test (A-D ľavej panely) a vyjadrí sa v Stredná hodnota OD (450 nm) (n = 3). Percento apoptotických buniek bola stanovená FCM (pravé panely A-D) a vyjadrené v percentách priemernej apoptotické (n = 3). * P < 0,05, ** P < 0,01 vs. kontrolnej skupine HK.
Kaspasy-3 aktivita je zapojená do H2O2 alebo TNF indukovanú apoptózu v OLFM4 knock-down bunky
Vyššie uvedené výsledky ukazujú, že zraziť z OLFM4 by sa mohol zvýšiť H <2o sub> 2 alebo TNF α-stimulovanej apoptózu. Aby sa preverilo, či je aktivovaná kaspázy-3 v H 2O 2 alebo TNF α-indukovanej apoptózy v Knockdown bunkách OLFM4, máme ďalšie zistená aktivácia kaspasy-3 v H 2O 2 alebo TNF a-ošetrené bunky za použitia kolorimetrického testu. Ako je znázornené na obrázku 6A, liečbu H 2O 2 alebo TNF α za následok oveľa väčšiu zvýšenie kaspázy-3 aktivity v porazený bunkách OLFM4 než kontrolné bunky HK (P 0,01), čo naznačuje, kaspasy-3 aktivitu podieľa sa na H 2O 2 alebo TNF α-indukovanej apoptózy u buniek knockdown OLFM4. Pre ďalšie overenie, či H 2O 2 alebo TNF α-indukovanú apoptosu, je závislá na kaspázy-3 aktivity, Z-VAD-fmk, inhibítor kaspázy bol použitý pred začiatkom liečby H 2O 2 alebo TNF α. Predúprava Z-VAD-fmk významne zoslabený H 2O 2 alebo TNF α-indukovanú apoptózu buniek, rovnako ako kaspázy-3 činnosť v oboch OLFM4 porazený buniek (P 0,01) (obrázok 6C-D ), čo naznačuje, že H 2O 2 alebo TNF α apoptóza indukovaná je kaspázy-3 závislej knockdown bunkách OLFM4. Obrázok 6 Zapojenie kaspázy-3 aktivity v H 2 O 2 alebo TNF α-indukovanú apoptózu v OLFM4 porazený SGC-7901 a MKN45 bunky. (A-B) Zvýšené kaspázy-3 aktivitu v H2O2 alebo TNF-ošetrené bunky knockdown OLFM4. OLFM4 knockdown a HK-kontrolné bunky boli ošetrené 10 uM H2O2 (A) alebo 10 ng /ml TNF a (B) po dobu 12 hodín. Kaspázy-3 aktivita bola meraná s použitím kolorimetricky a vyjadrí sa v prehybu zmeny. ** P < 0,01 oproti PBS mock skupina (n = 3). (C-D) na reverznej apoptózu buniek inhibítorom kaspázy v bunkách knockdown OLFM4. Bunky boli ošetrené samotným H2O2 alebo TNF sa uvedených dávkach ako je uvedené vyššie, alebo vopred ošetrené 20 uM Z-VAD-fmk 2 hodiny pred H2O2 alebo TNF liečby. Percento apoptotických buniek bola stanovená FCM. Dáta predstavujú priemer ± SD z troch nezávislých experimentov. ** P < 0,01 vs. H2O2 (C) alebo TNF (D) -treated OLFM4 porazený bunky skupinu.
Diskusia
V poslednej dobe sa usadzujú dáta ukázali, OLFM4 je často nadmerne exprimovaný u mnohých typov ľudských nádorov vrátane rakoviny žalúdka, a to bolo veril zohrávajú kľúčovú úlohu v rozvoji a progresii žalúdočné karcinogenézy [19, 20]. Aj keď predchádzajúce štúdie ukázali, že OLFM4 sa podieľa na apoptóze a rastu nádorových Nedávne pozorovania tiež ukazujú, že bunkové alebo tkanivové špecifické účinky môžu gén OLFM4 existujú. Relatívne málo je známe o rast nádoru a apoptóze základné karcinómu žalúdka špecifické OLFM4 expresie. Pre lepšie pochopenie tejto úlohe pre zmenené OLFM4 v ľudskom karcinómu žalúdka, je nutné experimentálne podpora pre overenie role génu OLFM4 v karcinómu žalúdka.
Bolo preukázané, že abnormálne expresie HGC-1 môže byť regulovaná na transkripčné alebo posttranskripční úrovni [13]. V našich súčasných prácach, sme skúmali priamo OLFM4 expresie proteínov vzor v rakovinových bunkách žalúdku a normálny GES-1 buniek. SGC-7901 a MKN45 bunky exprimujúce vysokú hladinu relatívnej OLFM4 boli vybrané pre túto štúdiu. Vzhľadom k tomu, zníženie expresie cieľového génu genetickými prostriedkami v zavedených bunkových línií je užitočné pre lepšie pochopenie jeho úlohu v udržiavaní malígny fenotyp najmä pri analýze génov, ktoré sú nevyhnutné pre bunkové prežitie [21], sme vytvorili stabilné klonov bazény SGC-7901 a MKN45 vyjadrenie OLFM4-siRNA alebo miešaná kontrolu HK podľa siRNA prístupom plazmidu na báze a potvrdila knock-down účinnosť OLFM4 génu na mRNA a hladiny proteínu QRT-PCR a westernovým prenosom.
Naše súčasné práce ukazujú, že OLFM4 zohráva zásadnú úlohu v žalúdku rakoviny vzniku nádorov. Vyradenie OLFM4 inhibuje proliferáciu buniek a na ukotvenie nezávislý rast schopnosť in vitro. Modelu xenoimplantátu nádoru in vivo, tiež znamená, že sa znížil OLFM4 môžu inhibovať nádorový rast ľudských buniek karcinómu žalúdka. Tieto výsledky naznačujú, že OLFM4 hrá kľúčovú úlohu v bunkovej proliferácii rakovinových buniek žalúdka. Naše výsledky tiež poznamenal, že knock-down z OLFM4 neovplyvňovali rýchlosť apoptózy a kaspázy-3 a 9 aktiváciou v OLFM4 Knockdown bunkách, čo naznačuje, že apoptóza nemusí byť mechanizmus je základom inhibíciu rastu nádoru. Preto sme sa predpokladať, že výraz OLFM4 nie je podstatné pre prežitie nádorových buniek, čo je v súlade s nedávnym pozorovaním, že genetické knock-out myši pre OLFM4 ukazujú normálny vývoj a hematopoetických fenotyp [17]. Pre ďalšie charakterizáciu mechanizmus stojaci inhibíciu rastu, sme vykonali analýzu bunkového cyklu, a preukázali, že inhibícia OLFM4 expresie indukovanej žalúdočnej rakovinové bunky sa hromadia v G1 fáze bunkového cyklu, čo naznačuje, že down-regulované OLFM4 môže pôsobiť inhibičný účinok na rast buniek o mechanizmus, regulujúci progresiu bunkového cyklu, ktoré nezahŕňajú apoptózu buniek karcinómu žalúdka.
Rezistencia nádorových buniek na indukciu apoptózy, je jedným z hlavných faktorov, zodpovedných za zlyhanie mnohých konvenčných protinádorovej terapie, ktoré používajú prípravky účinné proti rakovine a žiarenia. Preto regulácia apoptózy v rakovinových bunkách je kritické biologické a klinický význam [22, 23]. Anti-apoptotické aktivitu je ďalšiu dôležitú funkciu OLFM4 génu [2]. Najmä, H 2O 2-indukovanú bunkovú apoptózu bol zmiernený nadmerne exprimované OLFM4 v Rakovina prostaty bunkové línie [2]. Okrem toho, MKN45 bunky boli preukázali schopnosť odolnosti proti TNF α-indukovanej apoptózy [24]. Vzhľadom na tieto výsledky, sme hypotézu, že Vyradenie OLFM4 expresie môže zvýšiť H 2O 2 alebo TNF α-indukovanú apoptózu buniek karcinómu žalúdka. Tu sme ukázali, že knock-down z OLFM4 účinne zvýšenú apoptózu buniek v reakcii na H 2O 2 alebo TNF a stimulácia v MKN45, ako aj SGC-7901 buniek, čo naznačuje, že blokuje OLFM4 môže zvýšiť citlivosť karcinómu žalúdka bunky na prítomnosť H 2O 2 alebo TNF α.
Ako je dobre známe, že kaspázy-3, čo je kľúčový výkonný molekula apoptotické dráhy, hrá rozhodujúcu úlohu v apoptotických procesov v rôznych buniek. Ďalej sme skúmali aktivácie kaspázy-3 v OLFM4 Knockdown a kontrolných buniek HK v prítomnosti alebo neprítomnosti inhibítora kaspázy Z-VAD-fmk. Pozorovali sme, že liečba H 2O 2 alebo TNF významne up-regulovaný kaspasy-3 aktivity v Knockdown bunkách OLFM4 než kontrolné bunky HK, zatiaľ čo predpríprave Z-VAD-FMK obráteného kaspázy-3 aktivita rovnako ako H 2O 2 alebo TNF alfa apoptózy indukovanej. Výsledky ukazujú, že H 2O 2 alebo TNF α-indukovanú apoptózu v bunkách porazený OLFM4 je kaspázy-3 závislé. Na základe súčasných údajov na báze, je možné, že up-regulovaný OLFM4 umožňuje buniek karcinómu žalúdka sa brániť indukcii apoptózy znížením náchylnosť k liečiv proti rakovine.
V skutočnosti majú antagonisti OLFM4 Uvádza sa, že inhibuje proliferáciu v iných typoch rakovinové bunky ako ľudských nádorových buniek pankreasu Pancé-1 [8] a ľudské pľúcne bunky Caner SBC-1 [9]. Avšak, boli pozorované tiež kontroverzné výsledky. Znížila OLFM4 mRNA inhibujú Pancé-1 buniek proliferáciu S do G2 /M fáze, zástavy [8], ktorá sa líši od výsledkov znázorňujúci meškanie pokroku G1 fázy v karcinómu žalúdka. Niektoré dôležité detaily (či dôvody) by mohlo vysvetliť tento rozpor. Po prvé, ako nedávne štúdie ukázali, bunky alebo tkanivá špecifická úloha OLFM4 (rakovina žalúdka bunky a pankreatické nádorové bunky), môže byť presvedčivé vysvetlenie tohto rozdielu. Najpozoruhodnejšie je, OLFM4 expresie na úrovni mRNA, ale nie na úrovni proteínov v bunkách Pancé-1 bola úspešne meraná pomocou RT-PCR [8], vzhľadom k tomu, najnovšie správy Kim et al. ukázal, že Panc-1 bunky nemá expresiu mRNA OLFM4 [25], čo znamená, expresné vzor a úloha OLFM4 génu v bunkách Pancé-1 je potrebné ďalšie potvrdenie.
cez OLFM4 tlmenie hluku bolo preukázané, že inhibičný účinok na rast buniek a k zníženie rezistencie na H 2O 2 alebo TNF α liečby v buniek karcinómu žalúdka, nie je vylúčená, že iné mechanizmy môžu byť tiež regulované OLFM4 a prispieva k inhibíciu rastu a riadiace apoptózu signalizáciu, s ohľadom na presluch siete , V skutočnosti, OLFM4, cieľový gén NF-kB dráhy [16, 17, 25], tiež ukázali negatívne spätné účinky na aktiváciu NF-kB H. pylori
infekcie vyvolané v HEK 293 T-buniek [6],

• receptor epidermálneho rastového faktora štrukturálne zmeny v žalúdku cancer
• Prejavy COX-2 a VEGF-C u karcinómu žalúdka: korelácia s Lymfangiogeneze a prognostické dôsledky