L'esaurimento delle OLFM4 gene inibisce la crescita delle cellule e aumenta la sensibilizzazione di perossido di idrogeno e fattore di necrosi tumorale-alfa indotta-apoptosi nelle cellule di cancro gastrico

L'esaurimento delle OLFM4 gene inibisce la crescita delle cellule e aumenta la sensibilizzazione di perossido di idrogeno e fattore di necrosi tumorale-alfa indotta-apoptosi nelle cellule di cancro gastrico
Abstract
sfondo
umana olfactomedin 4 gene (OLFM4) è una glicoproteina secreta più comunemente noto come la molecola anti-apoptotico GW112. OLFM4 si trova ad essere spesso up-regolato in molti tipi di tumori umani tra cui il cancro gastrico e si è creduto a svolgere un ruolo significativo nella progressione del cancro gastrico. Anche se la funzione di OLFM4 è stato indicato in molti studi, recenti evidenze suggeriscono fortemente una cellula o di un tessuto a seconda del tipo di ruolo OLFM4 nella crescita cellulare e apoptosi. Lo scopo di questo studio è quello di esaminare il ruolo delle gastrica espressione cancro-specifica del OLFM4 nella crescita cellulare e la resistenza all'apoptosi.
Metodi
OLFM4 espressione è stato eliminato da RNA interference in SGC-7901 e le cellule MKN45. La proliferazione cellulare, la crescita ancoraggio-indipendente, del ciclo cellulare e l'apoptosi sono stati caratterizzati in vitro. Tumorigenicità è stato analizzato in vivo. L'apoptosi e caspasi-3 attivazione in risposta al perossido di idrogeno (H 2O 2) o fattore di necrosi tumorale alfa (TNF α) sono state valutate in presenza o assenza di inibitori caspasi Z-VAD-FMK.
Risultati
L'eliminazione di proteine ​​OLFM4 da RNA interference in SGC-7901 e le cellule MKN45 inibisce significativamente tumorigenicità sia in vitro che in vivo per induzione dell'arresto cella G1 (tutti p < 0,01). OLFM4 atterramento non ha innescato evidente l'apoptosi delle cellule, ma è aumentato H 2O 2 o TNF apoptosi α-indotta e caspasi-3 attività (tutti p < 0,01). Trattamento di Z-VAD-FMK attenuato l'attività della caspasi-3 e invertita in modo significativo l'H 2O 2 o TNF α-indotta l'apoptosi nelle cellule atterramento OLFM4 (tutti p < 0,01).
Conclusione
il nostro studio suggerisce che la deplezione di OLFM4 inibisce significativamente tumorigenicità del cancro gastrico SGC-7901 e le cellule MKN45. Blocco OLFM4 espressione può sensibilizzare le cellule di cancro gastrico per H 2O 2 o TNF α trattamento aumentando caspasi-3 apoptosi dipendente. Una strategia combinazione basata su OLFM4 trattamento di inibizione e antitumorali farmaci può fornire potenziale terapeutico nell'intervento cancro gastrico.
Parole
cancro gastrico Olfactomedin 4 RNA interferenza crescita cellulare apoptosi resistenza Sfondo
OLFM4 umana (olfactomedin 4, noto anche come HGC-1, GW112), originariamente definito umano clonato da cellule precursori mieloidi dopo la stimolazione dei granulociti fattore stimolante le colonie [1], è una glicoproteina secreta più comunemente conosciuta come la molecola anti-apoptotica GW112 [2, 3]. OLFM4 è normalmente espresso nel midollo osseo, prostata, piccolo intestino, stomaco, colon e del pancreas [1, 4]. Successivamente, l'aumento OLFM4 livelli sono stati trovati anche a livello dell'epitelio cripta della mucosa del colon infiammato di malattie infiammatorie croniche intestinali [5] e nelle biopsie gastriche con infezione da Helicobacter pylori [6, 7]. Più recentemente, up-regolati OLFM4 espressione è stata descritta nel polmone e della mammella [8], prostatico [3], gastrica [3, 9] e tumori pancreatici [8, 9] nonché negli adenomi colorettali [10-14].
è stato suggerito che OLFM4 è coinvolto nel processo cellulare come apoptosi e la crescita tumorale [2]. Anche se la funzione cellulare di OLFM4 è stato studiato, questi risultati non sempre coincidenti. Sovraespressione di OLFM4 è stato dimostrato per facilitare il mouse tumore alla prostata Tramp-C1 cellule crescita singenici topi C57 /BL6 [2] ma inibire il cancro prostatico PC-3 proliferazione cellulare umana [15]. Inoltre, up-regolati OLFM4 ha mostrato una forte attività anti-apoptotica nelle cellule SVEC del mouse linfoidi vena endoteliali e cellule HeLa adenocarcinoma umano [1, 2], considerando che i recenti risultati hanno suggerito un effetto pro-apoptotico di OLFM4 nelle cellule HL-60 leucemia mieloide umani [16 ]. L'evidenza da questi studi suggerisce fortemente che i ruoli di OLFM4 nel controllo della crescita cellulare e apoptosi può dipendere dal tipo di cellula o tessuto [10, 13-15]. Fino ad oggi, tuttavia, dati molto limitati riguardanti il ​​ruolo della OLFM4 nella crescita cellulare e profili apoptosi delle cellule di cancro gastrico è stato pubblicato.
Nel presente studio, abbiamo analizzato l'espressione della proteina OLFM4 in cellule di cancro gastrico e normale epiteliali gastriche umane GES-1 le cellule di western blotting. Utilizzando plasmide-mediata RNA breve tornante (shRNA), abbiamo inibito OLFM4 espressione nel carcinoma gastrico SGC-7901 e MKN45 cellule di osservare la proliferazione cellulare, la fase del ciclo cellulare, apoptosi in vitro e per valutare la sua capacità di oncogeno in vivo. Abbiamo anche esplorato l'apoptosi e caspasi-3 attivazione in risposta ad agenti citotossici come H 2O 2 o TNF α in presenza o assenza di inibitori caspasi Z-VAD-FMK tra cellule smontabili OLFM4 e cellule di controllo HK .
Metodi
coltura cellulare, reagenti e topi
Le cellule di cancro gastrico umano BGC-823, HGC-27, SGC-7901, MKN28, MKN45 e normale epiteliali gastriche umane GES-1 le cellule sono state mantenute terreno DMEM (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) contenente 10% di siero fetale bovino (FBS, GibcoBRL, USA), 100 U /ml di penicillina e 100 ug /ml di streptomicina. H 2O 2 e TNF-α sono stati ottenuti da Sigma (St. Louis, MO) e Z-VAD-FMK è stato acquistato da Calbiochem (San Diego, CA). nude (nu /nu) topi BALB /C (4-6 settimane di vita, il grado SPF, 20 ± 3 g) sono stati acquistati da laboratorio Animal Center di Chongqing Medical University (Chongqing, Cina). Tutte le procedure sono state condotte secondo le linee guida etiche riconosciute a livello internazionale (NIH pubblicazione n. 85-23, rivisto 1985)
. Plasmidi costruisce e trasfezione stabile
shRNA-mediata RNAi plasmide (pGenesil 1.1-siOLFM4) e un controllo strapazzate plasmide (pGenesil 1.1-HK) sono stati costruiti per abbattere il OLFM4 endogena in SGC-7901 e le cellule MKN45. Dopo trasfezione e neomicina (G418) selezione, OLFM4 knock-down SGC-7901-siOLFM4, le cellule MKN45-siOLFM4 e strapazzate SGC-7901-HK, cellule di controllo MKN45-HK sono stati stabilmente ottenuti, rispettivamente, (i dettagli riportati in file aggiuntive 1: supplementare dati).
estrazione dell'RNA e RT-PCR quantitativa (qRT-PCR)
RNA totale di cellule o xenotrapianti di tumori vari è stato estratto utilizzando il RNeasy Mini Kit (Qiagen, CA, USA), ed è stata seguita da sintesi del DNA utilizzando il sistema di sintesi del DNA filamento ReverTra Ace-α-prima (Toyobo, Osaka, Giappone), come descritto precedente [17]. Quantitativa real-time PCR è stata effettuata utilizzando 7500 in tempo reale del sistema PCR (Applied Biosystems) con SYBR-Green come colorante fluorescente (Toyobo, Osaka, Giappone) (dati riportati nel file aggiuntive 1: dati supplementari). Fold cambiamenti nell'espressione genica sono stati determinati utilizzando il "2 - DDCT". Metodo [18]
saggio di proliferazione cellulare in vitro di misura e la vitalità delle cellule
la proliferazione cellulare e la vitalità delle cellule sono stati misurati utilizzando proliferazione cellulare WST-1 kit (Roche ) secondo le istruzioni del produttore. Per proliferazione cellulare, le cellule sono state seminate ad una densità di 1 × 10 3 cellule per pozzetto di un 96-pozzetti e coltivate per 5 giorni. Il valore di densità ottica (450 nm) è stato rilevato utilizzando il lettore di micropiastre (Tacan, Swaziland) al giorno. Ciascun test è stato eseguito in triplicato. Per quanto riguarda la misurazione della vitalità cellulare, le cellule (1 × 10 4 /pozzetto) sono state seminate in 200 ml di media in piastre da 96 pozzetti. Dopo 12 ore di incubazione, H 2O 2 o TNF α è stato trattato in concentrazioni indicate. assorbanza relativa è stata misurata come descritto nella proliferazione cellulare.
saggio di crescita ancoraggio-indipendente
crescita ancoraggio-indipendente è stata eseguita su agar morbido in modo da riflettere in vitro clonogenicità. Brevemente, le cellule (5 × 10 2) da ogni colonia sono stati sospesi in 0,3% agar in DMEM e poi placcato su agar solidificato (0,5%) in piatti 6 pozzetti. Le cellule sono state incubate per 2 settimane a 37 ° C in 5% CO 2 prima colonie è stato misurato. Numero di colonie è stato contato a 200 × ingrandimenti per cinque campi aleatori. Ogni test è stato eseguito in triplicato.
Citometria a flusso
citometria a flusso (FCM) analisi è stata effettuata per valutare la progressione del ciclo cellulare o apoptosi. (Dettagli mostrati in file aggiuntive 1: dati supplementari)
caspasi saggio
attività enzimatica della caspasi-3 e -9 è stata misurata usando un test fluorimetrico secondo un metodo descritto in precedenza [8]
analisi Western Blot.
Western blotting è stato eseguito come precedentemente descritto [17]. I seguenti anticorpi sono stati utilizzati per Western blotting: anti-OLFM4 (Abcam, Cambridge, UK) e anti-β-actina (Santa Cruz, CA, USA) La quantità relativa di proteine ​​è stato analizzato utilizzando Quantity One software (Bio-Rad, Hercules , CA, USA) e normalizzati a quello di β-actina (dati riportati nel file aggiuntive. 1: dati supplementari)
modello di tumore dello xenotrapianto
Quaranta topi nudi sono stati divisi in quattro gruppi in modo casuale. Ogni gruppo è stato iniettato per via sottocutanea nella parte posteriore con la sospensione di 200 ml contenenti 2 × 10 6 celle di cui sopra, rispettivamente. Il volume di eterotrapianti è stata misurata in serie. I topi sono stati sacrificati dopo 35 giorni. Gli xenotrapianti sono stati asportati e pesati. I tassi di inibizione di xenotrapianti sono stati calcolati secondo la formula: tasso di inibizione (%) = 1-peso medio (OLFM4 abbattere le cellule-iniettate gruppo e di controllo HK cellule-iniettato gruppo) /peso medio (gruppo di controllo HK cellule-iniettato) × 100%. Poi, il tessuto tumorale è stato oggetto di isolamento RNA totale o la rilevazione immunoistochimica.
Immunoistochimica (IHC)
OLFM4 proteine ​​in xenotrapianti tumorali sono stati analizzati mediante IHC utilizzando il coniglio anti OLFM4 (Abcam, Cambridge, UK) (dettagli vedi nell'immagine file aggiuntivo. 1: dati supplementari)
Statistiche
dati da esperimenti indipendenti sono stati espressi come media ± SD di almeno tre esperimenti. I confronti tra i gruppi sono state analizzate con t di Student a due code
-test o ANOVA, a seconda dei casi, e valori di p < 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi.
Risultati
colpo efficiente giù di OLFM4 genica mediante siRNA plasmide-mediata in cellule di cancro gastrico
OLFM4 espressione della proteina modello è stato studiato in cancro gastrico BGC-823, HGC-27, SGC-7901, MKN28, MKN45 cellule e cellule normali di controllo GES-1 (Figura 1A). proteine ​​OLFM4 esprime sicuramente in tutte queste cellule di cancro gastrico e le cellule GES-1. In particolare, SGC-7901 e le cellule MKN45 espressi relativamente alto livello di proteine ​​OLFM4 rispetto ad altre cellule di cancro gastrico e cellule GES-1. Pertanto, SGC-7901 e le cellule MKN45 sono stati scelti per ulteriori studi. Figura 1 atterramento efficiente di OLFM4 da RNA interference nel cancro gastrico SGC-7901 e le cellule MKN45. A. Espressione di proteine ​​OLFM4 in varie linee cellulari di cancro gastrico. profilo di espressione di proteine ​​OLFM4 è stato analizzato utilizzando western blotting con β-actina come controllo interno. cellule GES-1 sono stati serviti come normali cellule di controllo. espressione B. OLFM4 mRNA nelle cellule atterramento OLFM4. espressione relativa di OLFM4 è stato rilevato dal qRT-PCR. β-actina è stato utilizzato come controllo interno. Fold variazioni di espressione OLFM4 mRNA sono stati determinati con il metodo 2-ΔΔCt. espressione della proteina C. OLFM4 nelle cellule atterramento OLFM4. espressione della proteina OLFM4 è stato rilevato mediante western blotting. proteina beta-actina è stato utilizzato come controllo interno. sono mostrati i rappresentanti di tre esperimenti. ** P < 0.01 vs HK gruppo cellule di controllo (n = 3).
Di down-regolare l'espressione OLFM4, un shRNA mira gene OLFM4 plasmide-mediata è stato costruito per battere in modo stabile verso il basso espressione OLFM4 in SGC-7901 e le cellule MKN45. Come mostrato nella Figura 1B, i livelli di mRNA OLFM4 sono stati significativamente ridotti in SGC-7901-siOLFM4 e le cellule MKN45-siOLFM4 rispetto al loro controllo HK o cellule parentali (P < 0,01). Questi risultati sono stati ulteriormente confermati mediante analisi western blotting (Figura 1C). è stata osservata alcuna differenza significativa espressione OLFM4 tra le cellule di controllo parentale e HK. I livelli di mRNA e proteine ​​per la β-actina erano simili tra i diversi gruppi. Questi risultati suggeriscono che un plasmide-mediata OLFM4-siRNA possono specificatamente ed efficiente abbattere livello OLFM4 in cellule di cancro gastrico. Alla luce dell'analisi sopra indicato, di conseguenza, OLFM4 abbattere le cellule e le cellule di controllo HK sono stati scelti per ulteriori indagini.
OLFM4 atterramento inibisce la proliferazione delle cellule del cancro gastrico e la crescita ancoraggio-indipendente in vitro
Per determinare il ruolo di OLFM4 in gastrica la crescita delle cellule del cancro, abbiamo studiato l'effetto di OLFM4-siRNA sulla crescita delle cellule al punto di tempo 1-5 giorni da WST-1 test. Come mostrato in Figura 2A, in tutte le due linee di cellule di cancro gastrico, la crescita di OLFM4 abbattere cellule è stata significativamente ridotta rispetto alle cellule di controllo HK dal giorno 3 (P < 0.01). Per esaminare ulteriormente l'importanza di OLFM4 nella tumorigenesi di cellule di cancro gastrico in vitro, abbiamo effettuato test di crescita ancoraggio-indipendente e abbiamo trovato SGC-7901 e le cellule che esprimono MKN45 controlli HK cresciuti bene in soft agar, formando colonie distinte. Al contrario, OLFM4 knockdown SGC-7901 e cellule MKN45 mostravano una drastica riduzione del numero di colonie in agar morbido (P < 0.01) (Figura 2B), mostrando trasformando capacità inferiori a quelle delle cellule di controllo. Questi dati hanno indicato che knock-down di OLFM4 potrebbe inibire la proliferazione delle cellule tumorali gastriche e la crescita ancoraggio-indipendente in vitro. Figura 2 knockdown del OLFM4 inibisce la crescita di SGC-7901 e cellule MKN45 in vitro e in vivo. curva di crescita delle cellule A.. La proliferazione cellulare in vitro è stata valutata mediante curva di crescita delle cellule, come determinato contando il numero di cellulare (WST-1 test) nelle cellule SGC-7901 (pannello di sinistra) e le cellule MKN45 (pannello di destra). Il valore di OD (450 nm) è stato conteggiato nei giorni indicati e presentato come il numero di cellule media (n = 3). B. crescita ancoraggio-indipendente in soft agar. Immagini rappresentative della tre esperimenti sono stati mostrati (pannello superiore). I dati rappresentano il numero medio di colonie contate a 200 × ingrandimenti per 5 campi aleatori (pannello inferiore). C. Il volume medio del tumore dopo l'iniezione sottocutanea di topi nudi con il controllo HK o cellule atterramento OLFM4 è stata misurata nei punti di tempo indicato. D. Rappresentante tumori immagini a 35 giorni dopo l'iniezione sottocutanea di cellule indicate. E. medio peso del tumore (pannello di sinistra) e il tasso di inibizione (pannello di destra) in xenotrapianti tumorali. I dati rappresentano il peso del tumore medio di xenotrapianti (media ± SD, n = 10). ** P < 0.01 vs HK gruppo di controllo.
Effetto Crescita-inibitorio di diminuita OLFM4 in xenotrapianti di tumori gastrici
Inoltre, abbiamo anche effettuato per via sottocutanea tumore saggio formativo in topi nudi per valutare l'effetto di soppressione della crescita del down-regolato OLFM4 in vivo. topi nudi sono stati iniettati sottocute con OLFM4 atterramento o cellule di controllo HK. volumi tumorali per 4 giorni e il peso del tumore a 5 settimane sono stati misurati rispettivamente dopo iniezione sottocutanea. Come mostrato nella Figura 2C-D, se il volume del tumore o tumore peso prodotto da OLFM4 abbattere SGC-7901 e cellule MKN45 erano significativamente ridotta crescita rispetto ai tumori prodotte in topi iniettati con cellule di controllo trasfettate HK (P < 0.01). Il tasso di inibizione della SGC-7901 e MKN45 abbattere le cellule a iniezione gruppo sulla crescita del tumore era 40.29% e il 37.48%, rispettivamente (Figura 2E).
Per assicurare ulteriore espressione OLFM4 è indeedly a tacere dopo l'iniezione sottocutanea di topi nudi, abbiamo anche valutato OLFM4 espressione in xenotrapianti di tumori con qRT-PCR e IHC. Allo stesso modo in vitro, il livello OLFM4 mRNA in xenotrapianti tumorali prodotte dalle cellule OLFM4 atterramento anche mostrato una significativa diminuzione rispetto a HK tumori di controllo xenotrapianti (P ​​< 0,01) (Figura 3A). Coerentemente con i risultati di qRT-PCR, significativa riduzione delle proteine ​​OLFM4 è stata anche osservata in xenotrapianti tumorali IHC (P < 0.01) (Figura 3B e 3C). Superiore scala di grigi e segnale più forte positivo per la visualizzazione DAB sono stati trovati in xenotrapianti di tumori del gruppo di controllo HK cellule-iniettato. Al contrario, debole colorazione marrone è stata osservata in xenotrapianti tumorali del gruppo smontabili OLFM4 cellule-iniettato. Inoltre, più grande regione di necrosi è stata osservata in xenotrapianti tumorali prodotte dalle cellule di controllo HK a causa di una rapida crescita di cellule di controllo HK (Figura 3B pannello superiore). Questi dati hanno fornito una forte indicazione che OLFM4 espressione a livello di mRNA e livelli di proteine ​​sono stabilmente inibito in effetti in vivo. Presi collettivamente, sia in vitro che in vivo suggeriscono che OLFM4 knockdown inibisce la crescita di cellule di cancro gastrico. Figura 3 qRT-PCR e IHC rilevamento di OLFM4 in xenotrapianti tumorali. A. qRT-PCR per OLFM4 mRNA in xenotrapianti tumorali. Fold cambiamenti nella OLFM4 mRNA sono stati determinati con il metodo 2-ΔΔCt. gene beta-actina è stato utilizzato come controllo interno. B. H & E colorazione (pannello superiore) e IHC per OLFM4 proteine ​​(pannello inferiore) in xenotrapianti tumorali. sono mostrati Immagini rappresentative (200 ×). N, necrosi. Analisi C. La quantificazione di espressione OLFM4. Il valore medio è stato misurato da cinque a caso diversi campi sotto il microscopio (400 ×) con i tasti più V6.0 Immagine-Pro. I dati sono stati espressi come media ± SD. ** P < 0,01 vs gruppo di controllo HK.
OLFM4 knock-down ritardi G1 a S di transizione, ma non faccia evidente apoptosi nelle cellule di cancro gastrico
dato il nostro effetti inibitori osservati sulla crescita cellulare in vitro e in vivo, abbiamo cercato di determinare sia migliorato l'apoptosi o la progressione del ciclo cellulare in ritardo è stato associato con l'inibizione della crescita. In primo luogo abbiamo valutato l'effetto di diminuzione OLFM4 sulla progressione del ciclo cellulare. Come mostrato in Figura 4A, sia OLFM4 knockdown SGC-7901 e cellule MKN45 mostrato significativi numeri aumentata in fase G1 e diminuita numeri in fase S, in contrasto con le loro cellule HK controllo (P < 0,01). Nessuna differenza significativa è stata osservata in G2 /M-fase, che indica un ritardo tipico G1 del ciclo cellulare. Figura 4 valutazione della distribuzione del ciclo cellulare, apoptosi delle cellule e della caspasi-3/9 attivazione OLFM4 abbattere cellule di cancro gastrico. A. analisi del ciclo cellulare. Cambiamenti nella distribuzione del ciclo cellulare di SGC-7901-HK, SGC-7901-siOLFM4 e MKN45-HK, cellule MKN45-siOLFM4 sono stati analizzati mediante FCM. I dati rappresentano la percentuale media di distribuzione di fase del ciclo cellulare (n = 3). B. analisi delle cellule apoptosi. L'apoptosi è stata valutata con AnnexinV-PE /7-AAD colorazione da FCM. I dati rappresentano la percentuale di cellule apoptotiche medio (n = 3). C. caspasi-3 e attivazioni -9. Caspasi-3, sono mostrati 9 attivazioni tra le cellule indicate. ** P < 0,01 vs gruppo di controllo HK.
Per determinare se l'apoptosi è coinvolto in questa inibizione della crescita, abbiamo accanto condotte analisi apoptosi delle cellule. È interessante notare che, ridotta espressione OLFM4 non poteva comportare cambiamenti significativi nella apoptosi (figura 4B), che è coerente con l'analisi del ciclo cellulare che mostra alcuna fase di apparente sub-G1 nelle cellule testate. Per esaminare ulteriormente le alterazioni dei segnali apoptotici, caspasi-3 /-9 attività è stata anche identificata da saggi di attivazione colorimetrici. Entrambi caspasi-3 e -9 attivazioni non hanno mostrato cambiamenti significativi dopo l'atterramento di OLFM4 in SGC-7901 e le cellule MKN45 (Figura 4C). Questi risultati suggeriscono che la down-regolazione di OLFM4 può esercitare un effetto inibitorio sulla crescita cellulare, regolando la progressione del ciclo cellulare che non prevedono l'apoptosi in cellule di cancro gastrico.
Soppressione di OLFM4 sensibilizza cellule di cancro gastrico a H2O2 o TNF α-indotta l'apoptosi
l'effetto distinto di H 2O 2 o TNF α sulla apoptosi tra OLFM4 abbattere e cellule di controllo HK è stato anche indagato. OLFM4 abbattono o cellule di controllo HK sono stati trattati con 10, 100 e 1000 mM H 2O 2 o 5, 10 e 50 ng /ml TNF α rispettivamente. La vitalità cellulare e l'apoptosi sono stati valutati. Come mostrato in Figura 5A-D, una riduzione dose-dipendente della vitalità cellulare è stata osservata in H 2O 2 o TNF α-trattati OLFM4 abbattere cellule. Inoltre, il trattamento di 10 mM H 2O 2 (Figura 5A-B) o 10 ml TNF alfa (Figura 5C-D) ha portato ad una riduzione significativa della vitalità cellulare in OLFM4 abbattere cellule ng /confrontato con HK cellule di controllo (P < 0,01). Di particolare interesse è la constatazione che OLFM4 cellule atterramento piuttosto che cellule di controllo HK trattate con 10 ~ 1000 mM H 2O 2 esposti percentuali apoptotici più importanti rispetto a quelli trattati con PBS finto (P < 0,01) ( Figura 5A-B). Risultati simili sono stati osservati anche nelle cellule del TNF alfa-trattati OLFM4 atterramento (Figura 5C-D). In altre parole, OLFM4 abbattere maggiore H 2O 2 o TNF α-indotta l'apoptosi nelle cellule di cancro gastrico, che indica la cancellazione di OLFM4 fatto SGC-7901 e le cellule MKN45 più sensibili al trattamento di H 2O 2 o TNF α. Figura 5 Risposta di OLFM4 knockdown SGC-7901 e le cellule MKN45 agli agenti che inducono l'apoptosi H 2 O 2 o TNF alfa. OLFM4 knockdown e cellule di controllo HK sono stati trattati con H2O2 (A e B) o TNF α (C e D) come dosi indicate per 12 h. La vitalità cellulare è stata misurata mediante WST-1 test (pannelli di sinistra A-D) ed espresso in valore medio di OD (450 nm) (n = 3). La percentuale delle cellule apoptotiche è stata determinata da FCM (A-D pannelli a destra) ed espresso in percentuale media di apoptosi (n = 3). * P < 0.05, ** P < apoptosi 0,01 vs gruppo di controllo HK.
caspasi-3 attività è coinvolto in H2O2 o TNF α-indotta in OLFM4 knock-down cellule
I risultati di cui sopra hanno indicato che abbattere di OLFM4 potrebbe aumentare H 2O 2 o TNF α-stimolato l'apoptosi. Per verificare ulteriormente se caspasi-3 è attivata nel H 2O 2 o TNF α-indotta l'apoptosi nelle cellule atterramento OLFM4, abbiamo accanto rilevato attivazione della caspasi-3 in H 2O 2 o TNF alfa-cellule trattate con saggio colorimetrico. Come mostrato nella Figura 6A, il trattamento di H 2O 2 o α TNF comportato più miglioramento della caspasi-3 attività nelle cellule smontabili OLFM4 rispetto alle cellule di controllo HK (P < 0.01), suggerendo l'attività della caspasi-3 è coinvolto nella H 2O apoptosi 2 o TNF α-indotta nelle cellule atterramento OLFM4. Per verificare ulteriormente se H 2O 2 o TNF apoptosi α-indotta dipende da caspasi-3 attività, Z-VAD-FMK, un inibitore della caspasi è stato utilizzato prima del trattamento di H 2O 2 o TNF α. Il pre-trattamento di Z-VAD-FMK significativamente attenuato H 2O 2 o α-indotta l'apoptosi delle cellule TNF, così come l'attività della caspasi-3 in entrambe le OLFM4 cellule knockdown (P < 0,01) (Figura 6C-D ), indicando che H 2O 2 o TNF apoptosi α-indotta è caspasi-3 dipendente in cellule atterramento OLFM4. Figura 6 Il coinvolgimento della caspasi-3 attività in H 2 O 2 o TNF α-indotta l'apoptosi in OLFM4 knockdown SGC-7901 e le cellule MKN45. (A-B) L'aumento dell'attività della caspasi-3 nelle cellule atterramento OLFM4 alfa-trattati H2O2 o del TNF. cellule OLFM4 abbattibili e HK-controllo sono stati trattati con 10 mM H2O2 (A) o 10 ng /ml TNF α (B) per 12 h. attività di caspasi-3 è stata misurata mediante saggio colorimetrico ed espresso in cambiamenti piega. ** P < 0,01 contro PBS gruppo finto (n = 3). (C-D) invertito l'apoptosi delle cellule da inibitore della caspasi nelle cellule atterramento OLFM4. Le cellule sono state trattate con H2O2 o TNF da solo α con dosi indicate come sopra menzionato o pretrattati con 20 mM Z-VAD-FMK 2 ore prima di H2O2 o TNF α trattamento. La percentuale di cellule apoptotiche è stata determinata da FCM. I dati rappresentano i mezzi ± SD di tre esperimenti indipendenti. ** P < 0.01 vs H2O2 (C) o α TNF (D) -treated OLFM4 atterramento gruppo cellule
. Discussione
dati accumulando recentemente dimostrato OLFM4 è spesso sovraespresso in molti tipi di tumori umani tra cui il cancro gastrico, ed è stato creduto di svolgere un ruolo cruciale nello sviluppo e nella progressione della carcinogenesi gastrica [19, 20]. Anche se gli studi precedenti hanno dimostrato che OLFM4 è coinvolto in apoptosi e la crescita tumorale, recenti osservazioni suggeriscono anche che possano esistere effetti di cellule o tessuto-specifici per il gene OLFM4. si sa relativamente poco per quanto riguarda la crescita del tumore e l'apoptosi sottostante espressione OLFM4 cancro-specifica gastrico. Per ottenere una migliore comprensione di questo ruolo per la OLFM4 alterato nel cancro gastrico umano, supporto sperimentale è necessario per convalidare il ruolo del gene OLFM4 nel cancro gastrico.
È stato dimostrato che l'espressione anormale di HGC-1 può essere regolata a livello trascrizionale o posttranscriptional [13]. Nelle nostre opere presenti, abbiamo studiato direttamente OLFM4 proteine ​​pattern di espressione nelle cellule tumorali gastriche e normali GES-1 le cellule. SGC-7901 e le cellule che esprimono MKN45 relativi alti livelli di OLFM4 sono stati scelti per questo studio. Poiché riducendo l'espressione gene bersaglio con mezzi genetici in linee cellulari stabilizzate è utile per una migliore comprensione del suo ruolo nel mantenimento del fenotipo maligno particolarmente nell'analisi geni che sono essenziali per la sopravvivenza cellulare [21], abbiamo generato piscine cloni stabili di SGC-7901 e MKN45 esprimendo OLFM4-siRNA o il controllo HK strapazzate dall'approccio siRNA plasmide-based e ha confermato l'efficienza knock-down di OLFM4 genica a livello di mRNA e livelli di proteina da qRT-PCR e Western blotting.
nostre opere presenti dimostrano che svolge un OLFM4 ruolo essenziale nella gastrico tumorigenesi cancro. Knockdown di OLFM4 inibisce la proliferazione cellulare e la capacità di crescita ancoraggio-indipendente in vitro. modello di tumore xenotrapianto in vivo implica anche che è diminuita OLFM4 può inibire la crescita tumorale delle cellule di cancro gastrico umano. Questi risultati indicano che OLFM4 gioca un ruolo cruciale nella proliferazione cellulare delle cellule di cancro gastrico. I nostri risultati hanno anche osservato che knock-down di OLFM4 non ha influenzato il tasso di apoptosi e caspasi-3 e 9 attivazioni in OLFM4 cellule knockdown, suggerendo che l'apoptosi potrebbe non essere il meccanismo alla base l'inibizione della crescita tumorale. Così, abbiamo postulato che l'espressione OLFM4 non è essenziale per la sopravvivenza delle cellule del cancro, che è in accordo con una recente osservazione che topi knock-out genetici per OLFM4 mostrano normale sviluppo e fenotipi ematopoietiche [17]. Per caratterizzare ulteriormente il meccanismo alla base della crescita, abbiamo effettuato analisi del ciclo cellulare e dimostrato che l'inibizione dell'espressione OLFM4 indotto cellule di cancro gastrico ad accumularsi in fase G1 del ciclo cellulare, suggerendo che down-regolato OLFM4 possono esercitare un effetto inibitorio sulla crescita cellulare da una progressione del ciclo cellulare meccanismo di regolazione che non prevedono l'apoptosi in cellule di cancro gastrico.
resistenza delle cellule tumorali per l'induzione di apoptosi è uno dei principali fattori responsabili per il fallimento di molte terapie anticancro convenzionali che utilizzano agenti antitumorali e radiazioni. Pertanto, il controllo apoptosi nelle cellule tumorali è di importanza biologica e clinica critica [22, 23]. Attività anti-apoptotica è un'altra importante funzione di OLFM4 gene [2]. In particolare, H 2O apoptosi cellulare 2-indotta è stata attenuata da overexpressed OLFM4 in una linea di cellule di cancro prostatico [2]. Inoltre, le cellule MKN45 hanno dimostrato la capacità di resistenza all'apoptosi TNF α-indotta [24]. Alla luce di questi risultati, si ipotizza che atterramento di espressione OLFM4 potrebbe migliorare H apoptosi 2O 2 o TNF α-indotta in cellule di cancro gastrico. Qui, abbiamo dimostrato che knock-down di OLFM4 migliorare efficacemente l'apoptosi delle cellule in risposta a H 2O 2 o TNF α stimolazione MKN45 così come le cellule SGC-7901, suggerendo il blocco OLFM4 può aumentare la suscettibilità del cancro gastrico cellule alla presenza di H 2O 2 o TNF α.
Come è ben noto che la caspasi-3, una chiave molecola esecutivo della via apoptotica, gioca un ruolo fondamentale nei processi apoptotici in una varietà di cellule. Abbiamo esaminato ulteriormente caspasi-3 attivazione OLFM4 atterramento e cellule di controllo HK, in presenza o assenza di inibitori della caspasi Z-VAD-FMK. Abbiamo osservato che il trattamento di H 2O 2 o TNF alfa significativamente up-regolati caspasi-3 attività nelle cellule atterramento OLFM4 rispetto alle cellule di controllo HK, mentre il pre-trattamento con Z-VAD-FMK invertito l'attività della caspasi-3, come pure come H 2O 2 o TNF apoptosi α-indotta. I risultati indicano che H apoptosi 2O 2 o TNF α-indotta nelle cellule atterramento OLFM4 è caspasi-3 dipendenti. Sulla base dei dati attuali, è concepibile che up-regolato OLFM4 permette alle cellule di cancro gastrico resistere apoptosi diminuendo la suscettibilità ai farmaci antitumorali.
Infatti, antagonisti di OLFM4 sono stati riportati per inibire la proliferazione di altri tipi di le cellule tumorali come il cancro al pancreas umani PANC-1 le cellule [8] e Caner polmone umano SBC-1 le cellule [9]. Tuttavia, sono anche stati osservati risultati controversi. Diminuzione OLFM4 mRNA inibisce PANC-1 le cellule proliferazione da S a G2 /M fase di arresto [8], che è diverso dai nostri risultati mostrano ritardato il progresso fase G1 nel cancro gastrico. Alcuni dettagli importanti (o motivi) potrebbero spiegare questa discrepanza. In primo luogo, come recenti studi hanno suggerito, un ruolo di cellula o tessuto specifico di OLFM4 (cellule di cancro gastrico e le cellule tumorali del pancreas), può essere una spiegazione convincente di questa discrepanza. La più notevole è, OLFM4 espressione a livello di mRNA, ma non a livello di proteine ​​nelle PANC-1 le cellule è stata misurata con successo utilizzando RT-PCR [8], mentre l'ultima relazione da Kim et al. ha dimostrato che PANC-1 le cellule non ha espressione dell'mRNA OLFM4 [25], che indica il pattern di espressione e il ruolo del gene in OLFM4 PANC-1 le cellule hanno bisogno di ulteriori conferme.
Nonostante OLFM4 silenziamento è stato dimostrato che un effetto inibitorio sulla crescita cellulare e un diminuzione della resistenza alle H 2O 2 o TNF α trattamento in cellule di cancro gastrico, non è eliminata che altri meccanismi possono essere regolate da OLFM4 e contribuisce alla inibizione della crescita e segnalazione di controllo apoptosi, considerando il crosstalk della rete . Infatti, OLFM4, un gene bersaglio di NF-kB percorso [16, 17, 25], ha anche dimostrato un effetto di feedback negativo sulla H. pylori
infezione indotta da attivazione di NF-kB in HEK 293 cellule T [6],

• del fattore di crescita epidermico recettore alterazioni strutturali in gastriche cancer
• Espressioni di COX-2 e VEGF-C nel carcinoma gastrico: correlazioni con linfoangiogenesi e implications