Reglering av amylin-frisättning från odlade kanin gastric fundic slemhinneceller

Reglering av amylin-frisättning från odlade kanin gastric fundic slemhinneceller Bild Sammanfattning
Bakgrund
Amylin (ö-amyloidpolypeptid) är ett hormon med föreslagna roller i regleringen av glukoshomeostas, gastric motor och sekretoriska funktion och gastro. I magslemhinnan amylin finns samlokaliserade med somatostatin i D-celler. De faktorer som reglerar gastric amylin frisättning är okända. I denna studie har vi undersökt regleringen av amylin-frisättning från magslemhinnan celler i primärkultur. Kanin fundic mukosala celler anrikade på D-celler genom motflöde elutriation odlades under 40 timmar. Amylin och somatostatin frisättning under 2 timmar som svar på agonister bedömdes.
Resultat
amylin-frisättning signifikant förbättras genom aktivering av proteinkinas C med forbol-12-myristat-13-acetat, adenylatcyklas med forskolin och förhöjning av intracellulärt kalcium med A23187. Kolecystokinin (CCK), epinefrin och glukagon-liknande peptid-1 (GLP-1) var och en stimulerad amylin frisättning på ett dos-beroende sätt. Maximal CCK-stimulerad frisättning var större än både adrenalin eller GLP, en, även när effekterna av de två sistnämnda har förbättrats genom isobutylmetylxantin. Stimulerad amylin frisättning signifikant hämmas av karbakol (med 51-59%) och oktreotid (med 33-42%). Somatostatin frisättning parallellt den hos amylin.
Slutsatser
odlade D-cellmodell ger ett medel för att studera amylin release. Amylin utsöndring stimuleras genom receptorberoende och -oberoende aktivering av Ca 2 + /proteinkinas C och adenylatcyklas vägar. Hämning innebär aktivering av muskarinreceptorer och automatisk reglering av somatostatin.
Bakgrund
Amylin (ö-amyloidpolypeptid) är en 37-aminosyrapeptid främst uttryck i pankreas Langerhanska öarna [1, 2]. Amylin har också lokaliserats hela magtarmkanalen [3] och i hjärnan [4]. Mycket senare arbete har fokuserat på fysiologi av pankreas amylin; peptiden verkar vara co-lagras och co-utsöndras med insulin i bukspottkörteln B-celler [5, 6], är en mindre andel samlokaliserade med somatostatin i pankreas D-celler [7].
Amylin tros funktion som en hormonreglerande glukoshomeostas. Amylin hämmar basal och insulinstimulerad glykogensyntes i råtta skelettmuskel [8, 9]; det hämmar insulin, somatostatin och glukagonsekretionen från isolerade pankreasöar och intakt perfusion bukspottkörteln och minskar postprandial glukagon och insulinutsöndring [10-12]. Amylin kan också bidra till glykemisk kontroll genom att fördröja gastrisk tömning [13]. Det Utöver dessa fysiologiska roller, är amylin tros spela viktig roll i patogenesen av diabetes mellitus. Det är den viktigaste komponenten i de amyloidavsättningar i öama av patienter med icke-insulinberoende diabetes mellitus [1, 2] och brist på amylin kan bidra misslyckandet av glykemisk kontroll som är typisk för insulinberoende diabetes [14] och i djurstudier amylin sig förefaller inducera insulinresistens [15]. Review, en mängd olika fysiologiska effekter på mag-tarmkanalen har också beskrivits. Parenteral administrering av amylin har en anorectant effekt [13], förutom att avsevärt minska gastrisk tömning [16]. En skyddande verkan mot reserpine-, och serotonin-inducerad gastropati har beskrivits [17]. Intravenös amylin är en potent hämmare av basal, pentagastrin och 2-deoxi-D-glukos stimulerad magsyrasekretion i råtta [18] och amylin reducerade syrautsöndring i isolerad mus mage beredning [19] i. En stimulerande effekt på serum gastrin har också rapporterats, även om detta kan ha varit sekundära till hämningen av syrasekretion [20]. I enlighet med dessa åtgärder amylin-bindningsställen har upptäckts hos råtta gastric fundic slemhinna [21]. Inom visas mag-tarmkanalen amylin att samarbeta lokalisera med andra gastrointestinala peptider. Med användning av in situ
hybridisering, immunofluorescens och immunocytokemi, Mulder et al
visade att amylin övervägande samlokaliserade med somatostatin i d-celler från råtta och mus antral mucosa och rått fundic slemhinna [22]. En minoritet av amylin samlokaliserade till separata populationer av gastrin-innehållande celler i antrum och PYY innehållande celler i fundus. Studier i PDX-1 bristfällig möss (som inte utveckla G-celler) visade ingen förändring i gastrisk amylin uttryck, bekräftar övervägande uttryck av amylin i D-celler [23]. Dessa data visar förekomsten av amylin och amylin-receptorer, i kombination med de farmakologiska effekter, föreslog att amylin kan ha en parakrin och /eller hormonreglerande och patofysiologisk roll i magslemhinnan. Men det finns inga studier för att undersöka de inblandade i gastric amylinsekretion processer. Sådana uppgifter är en förutsättning för ytterligare förståelse av gastric amylin fysiologi. Primära kulturer av gastriska och intestinala endokrina celler har använts för att undersöka den fysiologiska och patofysiologiska kontroll över flera gastrointestinala peptider innefattande gastrin, somatostatin, glukagon-liknande peptid-1 (GLP-1) och kolecystokinin (CCK) [24-30]. Samlokaliseringen av amylin med somatostatin gör gastric fundic D-cellpreparat en användbar modell för att undersöka kontrollen av amylinsekretion på cellnivå.
I denna studie har vi undersökt receptor-beroende och receptoroberoende reglering av amylin sekretion från odlade kanin gastriska fundic slemhinneceller. Kolecystokinin, glukagonliknande peptid-1 och epinefrin stimulerad amylin frisättning på ett dosberoende sätt och muskarinreceptor agonist karbakol och somatostatin receptoragonist oktreotid inhiberade amylin release. Somatostatin och amylin frisättning inträffade parallellt.
Resultat
Receptor oberoende stimulering av peptidfrigör
Till en början avgöra om amylin frisättning kunde detekteras från kulturer av kanin fundic celler, potenta receptoroberoende stimuli som används [ ,,,0],26] det totala innehållet cell (TCC) av amylin i den odlade cellpreparatet (801 ± 151 fmol /brunn) var ungefär 4-5 gånger lägre än den för somatostatin (3 768 ± 1325 fmol /brunn). Signifikant stimulering av amylin frisättning inträffade med den aktiva forbolester (forbol-12-myristat-13-acetat, PMA), som aktiverar proteinkinas C (PKC), aktivering av adenylatcyklas med forskolin och förhöjning av intracellulärt kalcium med jonoforen A23187 (Figur 1). Den forbolester var den mest potenta stimulerande, vilket leder till 8,5-faldig ökning av amylin frisättning (basal släppa 2,14 ± 0,8% ökning till 18,5 ± 1,4% av TCC). Forskolin ökad frisättning 3,3 gånger (maximal frisättning 7,2 ± 1,4% av TCC) och A23187 med 1,8 gånger (3,8 ± 0,5% TCC), dessa var betydligt mindre potenta än PMA. Det fanns inga signifikanta skillnader mellan mönstren av somatostatin och amylin frisättning (Fig. 1). Figur 1 Receptor oberoende stimulering av amylin (överst) och somatostatin (botten) från odlade D-celler. Celler stimulerades med forbol-12-myristat-13-acetat 100 nM (PMA), forskolin 10 pM (FSK) och A23187 1 pM under 2 timmar. Resultat uttrycks som% av cellinnehållet av peptid släpps, medelvärde ± SEM, ** P Hotel < 0,01 jämfört med kontroll, * P Hotel < 0,05 vs. kontroll.
Receptor-beroende stimulering
Tidigare studier har visat att CCK är en potent stimulerare av somatostatin frisättning [26]. Detta bekräftades här. CCK dosberoende stimulerad frisättning av amylin från de odlade cellerna (Figur 2). Maximal stimulering, en 2,75-faldig ökning, ökade 2,1 ± 0,7% basal utsläpp till 5,9 ± 0,8% TCC inträffade med CCK 10 nM. En liknande dos svarsmönster sågs för CCK-stimulerad somatostatin frisättning även om maximal frisättning var relativt högre för somatostatin (4,4-faldig, 1,1 ± 0,1% till 5,2 ± 0,7% TCC) än amylin (Figur 2). Figur 2 CCK-stimulerade amylin (överst) och somatostatin (botten) frisättning från odlade D-celler. Odlade mukosala celler stimulerades med CCK i 2 timmar. Resultat uttrycks som% av cellinnehållet av peptid släpps, medelvärde ± SEM, * P Hotel < 0,05 vs. kontroll.
Aktivering av adenylatcyklas-kopplade receptorer med antingen epinefrin eller glukagonlik peptid-1 ledde till en dosberoende liten ökning av både somatostatin (maximal ökning 1,44 och 1,35 faldigt respektive) och amylin frisättning (1,36 och 1,25 och viker respektive) (fig 3 och 4). Figur 3 Effekt av adrenalin på amylin (överst) och somatostatin (botten) frisättning från odlade D-celler. Celler stimulerades med ökande koncentrationer av epinefrin (EPI) i närvaro eller frånvaro av isobutylmetylxantin 100 pM (IBMX) i 2 timmar. Resultat uttrycks som% av cellinnehållet av peptid släpps, medelvärde ± SEM, * P Hotel < 0,05 vs kontroll.
Figur 4 Effekt av glukagonliknande peptid-1 på amylin (överst) och somatostatin (botten) frisättning från odlade D-celler. Celler stimulerades med ökande koncentrationer av glukagon-liknande peptid-1 (GLP) i närvaro eller frånvaro av isobutylmetylxantin 100 ^ M (IBMX) i 2 timmar. Resultat uttrycks som% av cellinnehållet av peptid släpps, medelvärde ± SEM, * P Hotel < 0,05 jämfört med kontroll.
Svaren på adrenalin och GLP-1 förbättras genom samadministrering med fosfodiesterashämmare isobutylmetylxantin (IBMX) (100 M). Basal amylin frisättning var 2,0 ± 0,2% TCC och maximal IBMX utökad frisättning 3,2 ± 0,2% TCC med epinefrin på 100 iM och 3,2 ± 0,3% TCC med GLP-1 vid 10 nM. Basal somatostatin frisättning (1,1 ± 0,1% TCC) ökade till 2,7 ± 0,1% TCC med adrenalin + IBMX och 2,1 ± 0,4% TCC med GLP-1 + IBMX. Dessa var fortfarande betydligt mindre än CCK-stimulerad frisättning. Det fanns inga skillnader i mönstret eller förhållandet mellan somatostatin och amylin svar (figurerna 3 och 4).
Hämmande reglering av amylin frigör
Behandling med somatostatin analog oktreotid producerade små men icke-signifikant minskning i både basal amylin ( med 14%) och basal somatostatin (med 18%) utsöndring (Figur 5). Karbakol hade ingen uppenbar effekt på vare sig basal amylin eller somatostatin utsöndring (Figur 5). CCK-stimulerad amylin frisättning hämmades signifikant av oktreotid (med 42%) och muskarinagonist karbakol (med 51%). På liknande sätt epinefrin (med IBMX) -stimulerad amylin frisättning hämmades med 33% av oktreotid och 59% av karbakol (båda P
< 0,05). Såsom visas i figur 6, var ett liknande mönster som ses med somatostatin release. Figur 5 Effekt av oktreotid och karbakol på basal amylin och somatostatin frisättning från odlade D-celler. D-celler stimulerades med antingen oktreotid 10 nM (oktober) eller karbakol 100 ^ M (CBH) i 2 timmar och frisättning av amylin och somatostatin bedömas. Resultaten uttrycks som% av cellinnehållet av peptid frisätts, medelvärde ± SEM.
Figur 6 Hämmande effekter av oktreotid och karbakol på agonist-stimulerad amylin (överst) och somatostatin (botten) release. D-celler stimulerades med antingen CCK 10 nM eller epinefrin med isobutylmetylxantin båda 100

• Riskfaktorer för djup infiltration i differentierade deprimerad magcancer tidig: förhands analysis
• Differentiell genuttryck i murina gastric fundus saknar interstitiella celler i Cajal