Regulación de la liberación de amilina de conejo cultivadas gástrica fúndica Reglamento de la mucosa cells

de la liberación de amilina de las células de la mucosa fúndica gástricas de conejo cultivadas
Resumen Antecedentes

Amylin (polipéptido amiloide de los islotes) es una hormona con funciones sugeridas en la regulación de la glucosa homeostasis, motora gástrica y la función secretora y la gastroprotección. En la amilina mucosa gástrica se encuentra co-localizada con somatostatina en células D. Los factores que regulan la liberación de amilina gástrica son desconocidos. En este estudio hemos investigado la regulación de la liberación de amilina de las células de la mucosa gástrica en cultivo primario. Conejo células de la mucosa fúndica enriquecidos para células D por elutriación se cultivaron durante 40 horas. se evaluaron Amylin y somatostatina liberación de más de 2 horas en respuesta a los agonistas.
Resultados
liberación Amylin se mejoró significativamente por la activación de la proteína quinasa C con forbol-12-miristato-13-acetato, la adenilato ciclasa con forskolina y la elevación de calcio intracelular con A23187. La colecistoquinina (CCK), la epinefrina y péptido similar al glucagón-1 (GLP-1) cada estimuló la liberación de amilina en una forma dependiente de la dosis. Maximal liberación estimulada por CCK fue mayor que cualquiera de epinefrina o GLP-1, incluso cuando los efectos de los dos últimos se han mejorado por isobutilmetilxantina. liberación de amilina estimulada se inhibió significativamente por carbacol (por 51-59%) y octreotida (por 33-42%). liberación de somatostatina paralela a la de la amilina.
Conclusiones Francia El modelo de células cultivadas D proporciona un medio para estudiar la liberación de amilina. la secreción de amilina es estimulada por dependiente del receptor y la activación -independiente de Ca 2 + /proteína quinasa C y adenilato ciclasa vías. La inhibición implica la activación de los receptores muscarínicos y auto-regulación por somatostatina.
Antecedentes
Amylin (polipéptido amiloide de los islotes) es un péptido de 37 aminoácidos predominantemente expresado en los islotes pancreáticos de Langerhans [1, 2]. La amilina también se ha localizado en todo el tracto gastrointestinal [3] y en el cerebro [4]. Los trabajos más recientes se han centrado en la fisiología de la amilina de páncreas; el péptido parece ser co-almacenado y co-secretada con la insulina en las células B pancreáticas [5, 6], una proporción más pequeña es co-localizada con somatostatina en células D pancreáticas [7].
Amylin se cree que función como una homeostasis de la glucosa de la hormona de regulación. La amilina inhibe la síntesis de glucógeno basal y estimulada por insulina en músculo esquelético de rata [8, 9]; inhibe la insulina, somatostatina y la secreción de glucagón a partir de los islotes pancreáticos aislados y perfundidos páncreas intacto y que reduce glucagón postprandial y la secreción de insulina [10 a 12]. La amilina también puede contribuir al control de la glucemia por ralentizar el vaciado gástrico [13]. Se Además de estas funciones fisiológicas, se cree que la amilina para jugar papel importante en la patogénesis de la diabetes mellitus. Es el componente principal de los depósitos de amiloide en los islotes de los pacientes con diabetes no dependiente de insulina mellitus [1, 2] y la deficiencia de la amilina puede contribuir el fracaso del control glucémico típico de diabetes dependiente de insulina [14] y en estudios con animales propia amilina parece inducir resistencia a la insulina [15].
también se han descrito una variedad de efectos fisiológicos en el tracto gastrointestinal. La administración parenteral de la amilina tiene un efecto anorectant [13], además de reducir significativamente el vaciado gástrico [16]. Una acción protectora contra la gastropatía reserpine-, y la serotonina inducida se ha descrito [17]. amilina intravenosa es un potente inhibidor de la basal, pentagastrina y 2-desoxi-D-glucosa estimulada la secreción de ácido gástrico en la rata [18] y la amilina reduce la secreción de ácido en la preparación de estómago de ratón aislado [19]. Un efecto estimulante sobre la gastrina de suero también se ha informado, aunque esto puede haber sido secundario a la inhibición de la secreción de ácido [20]. En consonancia con estas acciones de la amilina sitios de unión han sido detectados en ratas mucosa gástrica fúndica [21]. Dentro de la amilina tracto gastrointestinal parece co-localizar con otros péptidos gastrointestinales. El uso de la hibridación in situ
, inmunofluorescencia e inmunocitoquímica, Mulder et al mostraron que la amilina
predominantemente co-localizada con somatostatina en las células D de rata y la mucosa antral ratón y la rata mucosa fúndica [22]. Una minoría de amilina co-localiza en poblaciones separadas de células que contiene la gastrina en el antro y las células que contienen PYY en el fondo de ojo. Los estudios en PDX-1 ratones deficientes (que no desarrollan células G) no demostraron alteración en la expresión de amilina gástrico, lo que confirma la expresión predominante de amilina dentro de las células D [23]. Estos datos muestran la presencia de receptores de la amilina y amilina, junto con los efectos farmacológicos, se sugiere que la amilina puede tener un paracrino y /o función reguladora y fisiopatológico endocrino en la mucosa gástrica. Sin embargo, no hay estudios sobre los procesos implicados en la secreción de amilina gástrico. Estos datos son un requisito previo para una mayor comprensión de la fisiología gástrica amilina. Se han utilizado cultivos primarios de células endocrinas gástricas e intestinales para examinar el control fisiológico y fisiopatológico de varios péptidos gastrointestinales incluyendo la gastrina, somatostatina, péptido similar al glucagón-1 (GLP-1) y colecistoquinina (CCK) [24-30]. La co-localización de amilina con somatostatina hace que la preparación de células D fúndica gástrica un modelo útil para examinar el control de la secreción de amilina en el nivel celular.
En este estudio hemos examinado dependiente del receptor y receptor independiente de la regulación de la amilina la secreción de las células de la mucosa fúndica gástricas de conejo cultivadas. La colecistoquinina, péptido similar al glucagón-1 y epinefrina estimula la liberación de amilina en una forma dependiente de la dosis y el carbacol agonista del receptor y el receptor de la somatostatina octreótido agonista muscarínico inhibió la liberación de amilina. La somatostatina y la liberación de amilina ocurrieron en paralelo.
Resultados
la estimulación del receptor-independiente de la liberación del péptido
Evaluar inicialmente si la liberación de amilina se pudo detectar a partir de los cultivos de células de conejo fúndica, se utilizaron estímulos independientes del receptor potentes [ ,,,0],26] el contenido total de células (TCC) de la amilina en la preparación de células cultivadas (801 ± 151 fmol /pocillo) fue de aproximadamente 4 a 5 veces menor que la de la somatostatina (3 768 ± 1,325 fmol /pocillo). estimulación significativa de la liberación de amilina se produjo con el éster de forbol activo (forbol-12-miristato-13-acetato, PMA), que activa la proteína quinasa C (PKC), la activación de la adenilato ciclasa con forskolina y la elevación del calcio intracelular con el ionóforo A23187 (Figura 1). El éster de forbol fue el más potente estimulante, dando lugar a 8,5 veces de incremento en la liberación de amilina (basal liberar 2,14 ± 0,8% aumentando a 18,5 ± 1,4% de TCC). Forskolina aumentó 3,3 veces la liberación (liberación máxima de 7,2 ± 1,4% de la CTP) y A23187 en 1,8 veces (3,8 ± 0,5% TCC), éstos fueron notablemente menos potente que la PMA. No hubo diferencias significativas entre los patrones de la somatostatina y amilina de liberación (Fig. 1). Figura 1 la estimulación del receptor independiente de la amilina (arriba) y la somatostatina (parte inferior) a partir de células cultivadas D. Las células fueron estimuladas con forbol-12-miristato-13-acetato 100 nM (PMA), forskolina 10 mM (FSK) y A23187 1 M durante 2 horas. Los resultados se expresan como% del contenido de la celda de péptido liberado, media ± SEM, ** P Hotel < 0,01 frente al control, P * Hotel < 0,05 frente a control.
Estimulación dependiente del receptor
Estudios anteriores han demostrado que la CCK es un potente estimulante de la liberación de la somatostatina [26]. Esto fue confirmado aquí. CCK dosis-dependiente estimula la liberación de amilina de las células cultivadas (Figura 2). estimulación máxima, un aumento de 2,75 veces, la liberación basal de 2,1 ± 0,7% aumentó a 5,9 ± 0,8% TCC, se produjo con CCK 10 nM. Un patrón de respuesta a la dosis similar se observó para la liberación de la somatostatina CCK-estimulado aunque liberación máxima era relativamente más alta para somatostatina (4,4 veces, 1,1 ± 0,1% a 5,2 ± 0,7% TCC) de la amilina (Figura 2). Figura 2 amilina CCK-estimulado (arriba) y la liberación de la somatostatina (parte inferior) a partir de células cultivadas D. células de la mucosa cultivadas se estimulan con CCK durante 2 horas. Los resultados se expresan como% del contenido de la celda de péptido liberado, media ± SEM, * P Hotel < 0,05 frente a control.
Activación de los receptores acoplados a ciclasa adenilato, ya sea con epinefrina o péptido similar al glucagón-1 condujo a un pequeño aumento dependiente de la dosis tanto en la somatostatina (aumento máximo 1,44 y 1,35 veces, respectivamente) y la liberación de amilina (1,36 y 1,25 veces, respectivamente, y) (Figuras 3 y 4). Figura 3 Efecto de la epinefrina sobre la amilina (arriba) y la liberación de la somatostatina (parte inferior) a partir de células cultivadas D. Las células se estimularon con concentraciones crecientes de epinefrina (EPI) en presencia o ausencia de isobutilmetilxantina 100 mM (IBMX) durante 2 horas. Los resultados se expresan como% del contenido de la celda de péptido liberado, media ± SEM, * P Hotel < 0,05 frente al control.
Figura 4 Efecto del péptido similar al glucagón-1 en la amilina (arriba) y la liberación de la somatostatina (parte inferior) a partir de células cultivadas D. Las células se estimularon con concentraciones crecientes de péptido similar al glucagón-1 (GLP) en presencia o ausencia de isobutilmetilxantina 100 M (IBMX) durante 2 horas. Los resultados se expresan como% del contenido de la celda de péptido liberado, media ± SEM, * P Hotel < 0,05 frente al control.
Las respuestas a la epinefrina y el GLP-1 se mejoraron por la administración conjunta con el inhibidor de la fosfodiesterasa isobutilmetilxantina (IBMX) (100 M). liberación de amilina basal fue de 2,0 ± 0,2% TCC y máxima liberación incrementada-IBMX 3,2 ± 0,2% con epinefrina TCC a 100 mM y 3,2 ± 0,3% TCC con GLP-1 a 10 nM. liberación de somatostatina basal (1,1 ± 0,1% TCC) aumentó a 2,7 ± 0,1% con epinefrina TCC + IBMX y 2,1 ± 0,4% TCC con GLP-1 + IBMX. Estos eran aún significativamente menor que la liberación de CCK-estimulado. No hubo diferencias en el patrón o la relación de la somatostatina y de amilina respuestas (Figuras 3 y 4).
Regulación inhibidora de la liberación de amilina
El tratamiento con el análogo de la somatostatina octreótido produce pequeñas pero no significativas reducciones tanto amilina basal ( por 14%) y la somatostatina basal (18%) de la secreción (Figura 5). El carbacol no tuvo ningún efecto evidente en cualquiera de amilina basal o la secreción de somatostatina (Figura 5). liberación de amilina estimulada por CCK se inhibió significativamente por octreotide (por 42%) y el agonista muscarínico carbacol (por 51%). Del mismo modo epinefrina (con IBMX) estimulada por la liberación de amilina se inhibió en un 33% en octreotida y el 59% por carbacol (ambos p Hotel < 0,05). Como se muestra en la figura 6, un patrón similar se observó con la liberación de la somatostatina. Figura 5 Efecto de la octreotida y el carbacol sobre la liberación de amilina y somatostatina basal a partir de células cultivadas D. D-células fueron estimuladas ya sea con octreotide 10 nM (OCT) o carbacol 100 M (CBH) durante 2 horas y la liberación de amilina y somatostatina evaluado. Resultados expresados ​​como% del contenido celular de péptido liberado, media ± SEM.
Figura 6 efectos inhibitorios de octreotida y carbacol en amilina estimulada por agonista (arriba) y la liberación de la somatostatina (parte inferior). D-células fueron estimuladas ya sea con CCK 10 nM o epinefrina con isobutilmetilxantina ambos 100 M (EPI) en combinación con octreotide 10 nM (OCT) o carbacol 100 M (CBH) durante 2 horas. Los resultados se expresan como% del contenido de la celda de péptido liberado, media ± SEM, * P Hotel < 0,05 liberación.
Agonista estimulada vs. relevante Discusión
Este es el primer estudio que examina la liberación de amilina de la mucosa gástrica a nivel celular. Los resultados demostraron que la amilina no sólo se almacena en las células de la mucosa gástrica, sino también que los agonistas fisiológicos putativo regula la liberación del péptido. Estudios anteriores han localizado la amilina en el estómago utilizando transferencia Northern [31, 32], inmunocitoquímica [33], radioinmunoensayo [3] y en situ
hibridación [22], pero la liberación de amilina gástrico no se ha demostrado previamente.
la mayoría de amilina fúndica gástrico parece ser localizados con somatostatina en células D [22] Por lo tanto, hemos utilizado el modelo de células D de conejo cultivadas para investigar los agentes que controlan la liberación celular de la amilina y comparar esto con la secreción de somatostatina.
los estudios iniciales con agentes potentes conocidos para activar directamente la secreción del péptido a partir de células endocrinas de una manera independiente del receptor [26] los ésteres de forbol (por ejemplo, un PMA) activar directamente la proteína quinasa C en la capa interna de la membrana celular; esto a su vez activa los procesos celulares necesarios para la exocitosis. PMA era un potente estimulante tanto de la somatostatina y amilina secreción. El ionóforo de calcio A23187, lo que aumenta los niveles de calcio intracelular ([Ca 2 +] i]) la liberación de amilina también estimulado, aunque fue significativamente menos potente que la PMA. Esto es similar a las respuestas observadas en el antro humano [26] y las células D fúndica caninos [30] donde se cree que el aumento de la [Ca 2 +] i es principalmente de facilitación en lugar de estimular directamente la secreción. la activación directa de la adenilato ciclasa con forskolina también estimuló la liberación de amilina. Por lo tanto los estudios iniciales demostraron que la liberación de amilina podría ser estimulada por la activación de cualquiera de los dos principales vías de señalización intracelulares conocidos para mejorar la secreción del péptido. Después de haber decidido que estas vías estaban activos, hemos explorado el que los agentes fisiológicos podrían estimular la secreción de amilina de una manera dependiente del receptor.
Colecistoquinina-8 produjo un aumento dependiente de la dosis de amilina y la secreción de somatostatina. CCK es conocido por ser un potente in vitro
estimulante de la liberación de la somatostatina de células D antrales y fúndica [26, 30, 34]. Una respuesta a la dosis similar se observó para la amilina, aunque el incremento global fue ligeramente mayor en el caso de la somatostatina de la amilina. Aún se necesitan más estudios para determinar si esto representa una piscina separada de la somatostatina secretada específicamente después de la estimulación con CCK. D-cells fúndica parecen expresar los receptores de ambos CCK-1 (CCK A) y CCK-2 (gastrina /CCK B) [35]. La activación de estos receptores provoca la activación de la fosfolipasa C, la liberación de diacylglerol e inositol 1,4,5-trifosfato y la posterior elevación de la [Ca 2 +] i y la activación de PKC, que conduce a la liberación del péptido [36 ]. Estos resultados son consistentes con los resultados para la estimulación A23187 y PMA. Por lo tanto parece que CCK puede actuar como un estimulante fisiológico de la liberación de amilina.
Epinefrina y GLP-1 producido pequeños aumentos dependientes de la dosis en la amilina y la secreción de somatostatina. Este efecto podría ser mejorada por co-tratamiento con el inhibidor de la fosfodiesterasa IBMX, que inhibe cAMP desglose y amplifica las respuestas generadas por receptores acoplados a la adenilato ciclasa. Sin embargo, las respuestas fueron todavía significativamente menor que las observadas con la activación del Ca vía 2 + /PKC por cualquiera de CCK o PMA. diferencias similares en las sensibilidades se han descrito en antral humano [26] y fúndica canino [30] D-células.
Las influencias inhibidoras predominan descritos hasta ahora en las células D fúndica son agonistas muscarínicos [37, 38] y la autorregulación por somatostatina en sí [39, 40]. Las respuestas se informó aquí están en consonancia con los datos sobre la liberación de la somatostatina de células D fúndica caninos [30, 37]. En contraste, los receptores muscarínicos son estimulador de las células D antrales [41], lo que probablemente refleja una diferencia específica de la función. El presente estudio confirma las acciones inhibitorias tanto de la somatostatina octreótido-análogo agonista muscarínico carbacol y contra la liberación de somatostatina. Se observó una inhibición similar de la liberación de amilina estimulada. Esto sugiere que in vivo
inhibición de la liberación de amilina implica de entrada parasimpático y la regulación autocrina por la somatostatina.
Bajo todas las condiciones estudiadas somatostatina y amilina se secretan en paralelo, como se puede esperar si son co-almacenada en gránulos de secreción. La insulina y amilina se co-secretados de las células ß pancreáticas, secreción normalmente se produce en paralelo [42-44], pero la secreción diferencial ha sido reportado en modelos experimentales de diabetes mellitus [45, 46]. Se necesitan más estudios para definir mejor la relación entre la secreción y acción de la amilina gástrica y la somatostatina. En los islotes pancreáticos aislados los dos péptidos parecen tener un papel cooperativo en la regulación de la secreción de péptido: imunoneutralisation combinado de la amilina y la somatostatina como resultado una mayor mejora de la secreción de insulina y glucagón de neutralización de ya sea solo [10]. Será interesante examinar si resultados similares se observan con las funciones gástricas.
Liberación post-prandial de CCK intestinal y GLP-1 inhiben el vaciado gástrico y la secreción de ácido [13, 47]. Estos efectos son aunque para ser meditaron al menos en parte a través de intermediarios liberados de la célula D en lugar de mediante la inhibición directa de la célula parietal secretoras de ácido [48]. Se creía que la somatostatina fue el único intermedio pero los resultados del presente estudio sugieren que la regulación paracrina por amilina de parietal, ECL- y otras células endocrinas puede tener un papel en las respuestas de integración a las comidas. La inhibición de la amilina inducida por la histamina liberada de rata segmentos de la mucosa fúndica in vitro
fue mediado a través de aumento de la liberación de la somatostatina [19] pero el uso de un antagonista del receptor de somatostatina selectivos Rossowski et al
mostró in vivo en ratas
que una porción de las acciones ácido-inhibitorias tanto de la amilina y el péptido relacionado adrenomedulina eran somatostatina-independiente [49]. Las funciones específicas de la amilina en la fisiología gástrica requieren una aclaración adicional, pero estos datos sugieren que la amilina lanzado a nivel local es directamente capaz de regular las funciones de las mucosas. México La respuesta a la epinefrina y carbacol sugieren que la inervación autónoma puede regular la secreción de amilina. El balance global in vivo
dependería después de la entrada relativa de los sistemas adrenérgicos muscarínicos y estimulantes inhibitorios, combinado con endocrina y paracrina local y posiblemente factores luminales circulante.
Conclusión
Este estudio describe la caracterización inicial de los factores que regulan la liberación de amilina gástrico. Hemos demostrado que la liberación de amilina puede ser estimulada por la estimulación del receptor dependiente de cualquiera de los Ca + /PKC y la liberación de amilina adenilato ciclasa /cAMP vías y que péptidos fisiológicamente relevantes y mediadores neuronales pueden mejorar 2. Esto apoya la hipótesis de que la amilina puede módulo de funciones de la mucosa gástrica. Este estudio confirma que los cultivos a corto plazo de las células enriquecidas por elutriación proporcionarán un modelo para explorar la liberación fisiopatológico de la amilina gástrica y proporcionar una ruta de entender mejor el papel de la amilina en la regulación de la motora gástrica y la función secretora.
Métodos
Materiales
Matrigel se obtuvo de universal Biológicos (Londres, Reino Unido), octreotida de Novartis (Surrey, Reino Unido) y F12 de Ham /medio de cultivo de Eagle modificado por Dulbecco (50:50, v: v), la glutamina, la sal equilibrada de Hanks solución y suero de ternera fetal se adquirieron de Gibco (Paisley, UK). Sulfatadas colecistoquinina-8 (CCK), GLP-1 humano y todos los demás reactivos se obtuvieron de Sigma (Poole, UK). Aislamiento
cultivo de células y
cultivos primarios de células de la mucosa fúndica de conejo gástrico enriquecidas para células D se obtenido como se describe anteriormente [39, 48]. Brevemente, conejo mucosa fúndica fue sometido a EDTA secuencial y digestión con colagenasa. La suspensión de células resultante se enriquece para células D por elutatriation contracorriente usando un rotor Beckman JE estándar 5.0 como se describe anteriormente. La fracción enriquecida en células D se resuspendió en medio de cultivo completo (F12 de Ham medio /de Dulbecco modificado de Eagle de cultivo (50:50, v: v), que contiene glutamina 2 mM, 10 mM HEPES pH 7,4, 0,22% de NaHCO 3, 10% de suero bovino fetal, 1 mg /l de hidrocortisona, 8 mg /l de insulina, 100 mg /l de penicilina, 100 mg /l de gentamicina, 100 mg /l de estreptomicina) y se cultivaron en placas de cultivo de tejidos de 24 Matrigel recubiertos con [50] a una densidad de 1 × 10 6 células /pocillo durante 40 horas en una atmósfera de 5% de CO 2, 95% de aire a 37 ° C.
Release Estudios
Las células cultivadas se lavaron 3 veces en medio de liberación (solución salina equilibrada de Earl que contenía 0,1% de albúmina de suero bovino, 10 mM HEPES pH 7,4) para eliminar las células muertas y no adherentes. se añadió de nuevo 1 ml de medio de liberación que contiene agonistas de prueba y las células se incubaron durante 2 horas a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO 2, 95% de aire. Después de que el período de liberación, los medios acondicionados se aspiró y se centrifugó para eliminar las células no adherentes. contenido celular total de péptido se extrajo por ebullición en 1 ml de agua destilada. Los medios condicionados y los extractos celulares se almacenaron a -70 ° C hasta su ensayo para el contenido de péptido [30].
medición Péptido
concentraciones de somatostatina se evaluaron por radioinmunoensayo (RIA) con K2 antisuero, como se describe anteriormente [39]. mitad de la inhibición máxima de unión ocurrió a las 2 fmol /tubo y la intra-ensayo y la variación entre ensayos eran 7% y 8% por ciento, respectivamente. concentraciones de amilina se midieron por ELISA directo (Penninsula Laboratories, Belmont, CA, EE.UU.), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ensayo tiene un rango de 0.04-2 ng /ml, y intra-ensayo y la variación inter-ensayo de < 5% y < 14%, respectivamente. El anticuerpo usado tiene 100% de reactividad cruzada con la amilina y amilina-amida pero < 1% de reactividad cruzada con CGRP y la reacción insignificante con otros péptidos biológicamente activos. Todas las muestras experimentales de una única preparación de los animales se sometieron a ensayo en el mismo RIA o ELISA El análisis estadístico.
La liberación del péptido durante el período de 2 horas se expresó como el porcentaje del contenido total de células (TCC), de dicho péptido. Cada condición experimental se ensayó por duplicado y los resultados de una sola preparación animales fueron considerados como N = 1. Los resultados se expresan como la media ± SEM de 3-6 preparaciones de animales separados. Cada placa de 24 pocillos siempre se incluye el control de pozos (basales) y los estimulantes positivos. la liberación del péptido por los estimulantes se comparó con la liberación basal de la placa de 24 relevante. Se usaron análisis unidireccional de varianza y la prueba de la t de Student pareada para determinar la significación. Un valor de p Red de < 0,05 fue considerado significativo
Lista de abreviaturas
CCK:.
Colecistoquinina
ECL-:
Enterocromafines como


GLP-1:
péptido similar al glucagón-1
IAPP:
polipéptido islote amylioid
IBMX:
isobutilmetilxantina
PKC:
proteína quinasa C
PMA:
forbol-12-miristato -13-acetato, TCC, el contenido total de células.
Declaraciones
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado en parte por una beca de formación del Consejo de Investigación médica de ILPB.
Algunas de las los datos se presentaron en forma de resumen en la United European Gastroenterology Week en Birmingham 1997.
los autores originales presentados archivos de imágenes
a continuación se presentan los enlaces a los autores originales presentados archivos de imágenes. 'archivo original para la figura 1 12899_2003_47_MOESM2_ESM.jpeg autores 12899_2003_47_MOESM1_ESM.jpeg Autores archivo original para la figura 2 12899_2003_47_MOESM3_ESM.jpeg autores archivo original para la figura 3 12899_2003_47_MOESM4_ESM.jpeg autores archivo original para el archivo original de la figura 4 12899_2003_47_MOESM5_ESM.jpeg los autores de la figura 5 'archivo original para la figura 6 de los autores 12899_2003_47_MOESM6_ESM.jpeg Autores Aportes
ILPB concebido y diseñado el estudio, realizado el aislamiento de células, la cultura, los experimentos de liberación, inmunoensayos y escribió borrador y la versión final del manuscrito. El fallecido JC concibe el estudio y co-escribió el primer borrador del manuscrito.

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