Regulácia uvoľňovanie Amylin z kultivovaných králičieho žalúdka nariadenia fundusu slizničnej cells

uvoľňovanie Amylin z kultivovaných králičích žalúdočných fundusu slizničných buniek
abstraktné
pozadia
Amylin (ostrovčekov amyloid polypeptidov) je hormón s navrhovanými role pri regulácii glukózy homeostázy, žalúdočné motora a sekrečnú funkcie a žalúdočným. V žalúdočnej sliznici Amylin je zistené, ko-lokalizovaný s somatostatínu v D-buniek. Faktory regulujúci žalúdočné uvoľňovanie Amylin sú neznáme. V tejto štúdii sme skúmali regulácie uvoľňovania Amylin zo žalúdočnej sliznice buniek v primárnej kultúre. Králičie fundic slizničnej bunky obohatené pre D-buniek protiprúdom elutriační boli kultivované po dobu 40 hodín. Amylin a somatostatínové uvoľňovanie po dobu 2 hodín v odpovedi na agonistami boli hodnotené.
Výsledky
Amylin uvoľňovanie bola značne zvýšená aktiváciou proteín kinázy C sa forbol-12-myristát-13-acetátu, adenylátcyklázy s Forskolin a výškou intracelulárneho vápnika s A23187. Cholecystokinín (CCK), adrenalín a glukagónu podobný peptid-1 (GLP-1), každá stimulované uvoľňovanie Amylin v spôsobom závislým od dávky. Maximálna CCK-stimulované uvoľňovanie bola väčšia ako jeden adrenalínu alebo GLP-1, aj keď účinky posledných dvoch bola zvýšená isobutylmethylxanthine. Stimulované uvoľňovanie Amylin bola významne inhibovaná karbacholom (o 51-59%) a oktreotidu (o 33-42%). vydanie somatostatín vyrovnal že Amylin.
Závery
model kultivované D-cell poskytuje prostriedky pre štúdium uvoľňovania Amylin. sekrécia Amylin je stimulovaná receptora závislé a -independent aktiváciou Ca 2 + /proteín kinázy C a adenylátcyklázy dráh. Inhibícia zahŕňa aktiváciu muskarínových receptorov a auto-regulácia somatostatínu.
Pozadie
Amylin (ostrovčekov amyloid polypeptidov) je peptid kyseliny 37-amino prevažne vyjadrený v pankrease Langerhansových ostrovčekov [1, 2]. Amylin bol tiež lokalizovaný v celom zažívacom trakte [3], a v mozgu [4]. Oveľa nedávna práca sa zamerala na fyziológiu pankreasu Amylin; Zdá sa, že čo-čo-skladovať a vylučovaný s inzulínom v pankreatických B-buniek peptid [5, 6], menšia časť je ko-lokalizovaný s somatostatínu v pankreasu D-buniek [7].
Amylin sú pokladané funkcie ako hormón regulujúci glukózovej homeostázy. Amylin inhibuje bazálnej a inzulínom stimulovanej glykogénu v potkaním kostrovom svale [8, 9]; inhibuje inzulín, somatostatín a sekréciu glukagónu z izolovaných ostrovčekov pankreasu a intaktné perfundovaného pankreasu a znižuje postprandiálnu glukagónu a vylučovanie inzulínu [10-12]. Amylin môže prispieť aj na glykémiu tým, že spomaľuje vyprázdňovanie žalúdka [13]. Okrem toho sa tieto fyziologické role, Amylin sa predpokladá, že hrá významnú úlohu v patogenéze diabetes mellitus. To je hlavnou zložkou amyloidní usadenín v ostrovčekoch pacientov s non-inzulín dependentný diabetes mellitus [1, 2], a nedostatok Amylin môže prispieť k zlyhaniu kontroly glykémie typické diabetes závislý na inzulíne [14] a v štúdiách na zvieratách zdá sa, že Amylin sám vyvolať inzulínovú rezistenciu [15].
rad fyziologických účinkov na gastrointestinálny trakt boli tiež popísané. Parenterálnej podávanie Amylin má anorectant účinok [13], okrem toho, že významne znižuje vyprázdňovanie žalúdka [16]. Ochranný účinok proti reserpine-, a serotonín-indukovanej gastropatia bola opísaná [17]. Intravenóznej Amylin je silným inhibítorom bazálnu, pentagastrín a 2-deoxy-D-glukózy stimulovanú sekréciu žalúdočnej kyseliny u potkanov [18] a Amylin znižuje sekréciu kyseliny v izolovanom myší žalúdku prípravy [19]. Povzbudzujúci účinok na hladinu gastrínu je tiež popísaná, i keď to môže byť sekundárne na inhibíciu sekrécie kyseliny [20]. V súlade s týmito akciami boli zistené Amylin-väzbové miesta v potkaním žalúdočnej sliznice fundusu [21]. V objavia Amylin gastrointestinálny trakt čo-lokalizovať s ďalšími gastrointestinálnymi peptidy. Použitím in situ hybridizácia
, imunofluorescencie a imunocytochémia, Mulder a kol
ukázala, že Amylin prevažne spoločne lokalizované s somatostatínu v D-bunkách potkanov a myší antrálnej sliznice a potkania fundusu sliznicu [22]. Menšina Amylin ko-lokalizovaný do oddelených populáciách buniek gastrín obsahujúce v dutine a bunky PYY obsahujúce v očnom pozadí. Štúdie u PDX-1 myší s deficitom (ktoré sa nevyvíjajú G-buniek) preukázané žiadne zmeny v žalúdku Amylin výrazu, čo potvrdzuje prevládajúci expresiu Amylin v rámci D-buniek [23]. Tieto dáta ukazujú na prítomnosť Amylin a Amylin receptory, spojený s farmakologickými účinkami, naznačujú, že Amylin môže mať parakrinný a /alebo endokrinné regulácia a patofyziologický úlohu v žalúdočnej sliznici. Existujú však žiadne štúdie skúmajúce procesy zapojené do žalúdočnej sekrécie Amylin. Tieto údaje sú predpokladom pre ďalšie pochopenie žalúdočné Amylin fyziológie. Primárne kultúry žalúdočné a črevné endokrinných buniek, ktoré boli použité pre skúmať fyziologických a patofyziologických kontrolu niekoľkých gastrointestinálnych peptidov, vrátane gastrín, somatostatín, glukagónu podobný peptid-1 (GLP-1) a cholecystokinín (CCK) [24-30]. Ko-lokalizácia Amylin s somatostatínu je žalúdočnej fundusu prípravy D-CELL užitočný model, skúmať riadenie sekrécie Amylin na bunkovej úrovni.
V tejto štúdii sme skúmali receptor-dependentný a receptor-nezávislú reguláciu Amylin sekrécia z kultivovaných králičích žalúdočnej sliznice fundu buniek. Cholecystokinín, glukagónu podobný peptid-1 a adrenalín stimulované uvoľňovanie Amylin v závislosti na dávke a muskarínových receptorov agonistami karbacholom a somatostatín receptor agonista oktreotid inhibuje uvoľňovanie Amylin. Somatostatín a uvoľňovanie Amylin došlo paralelne.
Výsledky
receptorom nezávislé stimulácia uvoľňovania peptidu
Pre počiatočné posúdenie, či uvoľňovanie Amylin, ktorú je možné detekovať z kultúr buniek králičích fundu, boli použité silné podnety receptora nezávislé [ ,,,0],26] celkový obsah buniek (TCC), Amylin na prípravu kultivovaných buniek (801 ± 151 fmol /jamku) bola približne 4-5-krát nižšia ako u somatostatínu (3 768 ± 1325 fmol /jamku). Významné stimulácia uvoľňovania Amylin nastal s aktívnym forbolesterem (forbol-12-myristát-13-acetát, PMA), ktorý aktivuje proteín kinázy C (PKC), aktiváciu adenylátcyklázy pomocou Forskolin a zvýšenie intracelulárneho vápnika s ionofórmi A23187 (viď obr 1). Forbol ester bol najúčinnejší stimulant, čo viedlo k 8,5 násobnému zvýšeniu uvoľňovania Amylin (bazálny uvoľní 2,14 ± 0,8% zvýšiť na 18,5 ± 1,4% z TCC). Forskolin zvýšenému uvoľňovanie 3,3 násobne (maximálna uvoľňovanie 7,2 ± 1,4% TCC) a A23187 1,8 násobne (3,8 ± 0,5% TCC), títo boli výrazne menej účinný ako PMA. Neboli zistené žiadne významné rozdiely medzi vzormi somatostatínu a uvoľňovanie Amylin (obr. 1). Obrázok 1 receptoru nezávislé stimulácia Amylin (hore) a somatostatín (dole) z kultivovaných D-buniek. Bunky boli stimulované forbol-12-myristát-13-acetátu (PMA 100 nM), 10 uM Forskolin (FSK) a A23187 1 uM počas 2 hodín. Výsledky vyjadrené ako% obsahu buniek peptidu uvoľneného, ​​priemer ± SEM, ** P
< 0,01 versus kontrola, * P Hotel < 0,05 versus kontrola.
Receptora závislú stimuláciu
Predchádzajúce štúdie preukázali, že CCK je silným stimulantom uvoľňovanie somatostatínu [26]. To tu bola potvrdená. CCK v závislosti na dávke stimulované uvoľňovanie Amylin z kultivovaných buniek (obrázok 2). Maximálna stimulácia, čo predstavuje nárast o 2,75 krát, 2,1 ± 0,7% bazálnu uvoľňovanie zvýšila na 5,9 ± 0,8% TCC, nastal s CCK 10 nM. Podobná reakcia na dávke vzor bol pozorovaný u CCK-stimulované uvoľňovanie somatostatínu aj Maximálna uvoľňovanie bolo relatívne vyššie pre somatostatín (4,4 násobne, 1,1 ± 0,1% na 5,2 ± 0,7% TCC) než Amylin (obrázok 2). Obrázok 2 CCK-stimulovanej Amylin (hore) a somatostatín (dole) uvoľnenie z kultivovaných D-buniek. Kultivované bunky sliznice boli stimulované s CCK po dobu 2 hodín. Výsledky vyjadrené ako% obsahu buniek peptidu uvoľneného, ​​priemer ± SEM, * P
< 0,05 versus kontrola.
Aktivácia adenylátcyklázy-receptorov spriahnutých s buď adrenalínu alebo glukagónu podobný peptid-1 vedie k závislosti na dávke malé zvýšenie v oboch somatostatínu (maximálny nárast 1,44 a 1,35 násobne) a uvoľňovanie Amylin (1,36 a 1,25 a násobne) (obrázky 3 a 4). Obrázok 3 Účinok adrenalínu na Amylin (hore) a somatostatín (dole) uvoľnenie z kultivovaných D-buniek. Bunky boli stimulované so zvyšujúcimi sa koncentráciami epinefrínu (EPI) v prítomnosti alebo neprítomnosti isobutylmethylxanthine 100 uM (IBMX) počas 2 hodín. Výsledky vyjadrené ako% obsahu buniek peptidu uvoľneného, ​​priemer ± SEM, * P
< 0,05 versus kontrola.
Obrázok 4 Účinok glukagónu podobný peptid-1 na Amylin (hore) a somatostatín (dole) uvoľnenie z kultivovaných D-buniek. Bunky boli stimulované s rastúcou koncentráciou glukagónu podobný peptid-1 (GLP), v prítomnosti alebo neprítomnosti isobutylmethylxanthine 100 uM (IBMX) počas 2 hodín. Výsledky vyjadrené ako% obsahu buniek peptidu uvoľneného, ​​priemer ± SEM, * P
< 0,05 versus kontrola.
Reakcia na adrenalín a GLP-1 bola zvýšená pri súčasnom podávaní s isobutylmethylxanthine inhibítorom fosfodiesterázy (IBMX) (100 um). Bazálna uvoľňovanie Amylin bola 2,0 ± 0,2% TCC a maximálna IBMX zvýšeným uvoľňovaním 3,2 ± 0,2% TCC s adrenalínom na 100 um a 3,2 ± 0,3% TCC s GLP-1 pri 10 nM. Bazálna somatostatín uvoľňovanie (1,1 ± 0,1% TCC) sa zvýšil na 2,7 ± 0,1% TCC s adrenalínom + IBMX a 2,1 ± 0,4% TCC s GLP-1 + IBMX. Tie boli stále výrazne nižšie ako CCK-stimulovanej uvoľňovania. Neboli zistené žiadne rozdiely v štruktúre alebo pomer somatostatínových a Amylin odpovedí (obrázky 3 a 4).
Inhibičný regulácia uvoľňovanie Amylin
zaobchádzanie s analógom somatostatínu oktreotid vyrába malé, ale bez významné zníženie v oboch bazálnej Amylin ( o 14%) a bazálnej somatostatín (o 18%) sekrécia (obrázok 5). Karbacholom nemal žiaden zrejmý vplyv na oboch bazálnej sekrécie Amylin alebo somatostatínu (obrázok 5). CCK-stimulované uvoľňovanie Amylin bola významne inhibovaná oktreotidu (o 42%) a muskarinových agonistov karbacholom (o 51%). Podobne epinefrín (s IBMX) stimulované uvoľňovanie Amylin bola inhibovaná o 33% a 59% oktreotid karbacholom (obaja P
menšie ako 0,05). Ako je znázornené na obrázku 6, podobný vzor bol pozorovaný s uvoľnením somatostatínu. Obrázok 5 Účinok oktreotidu a karbacholom na bazálnej Amylin a somatostatínu prepustenie z kultivovaných D-buniek. D-bunky boli stimulované buď octreotidem 10 nM (OCT) alebo karbacholom 100 um (CBH) po dobu 2 hodín a uvoľňovanie Amylin a somatostatín posúdený. Výsledky vyjadrené ako% obsahu buniek peptidu uvoľneného, ​​priemer ± SEM.
Obrázok 6 inhibičné účinky oktreotid a karbacholom na agonistov Amylin stimulovanej (hore) a somatostatín (dole) uvoľnenie. D-bunky boli stimulované buď s 10 nM CCK alebo adrenalín s oboma isobutylmethylxanthine 100 uM (EPI) v kombinácii s oktreotidu 10 nM (OCT) alebo karbacholom 100 uM (CBH) počas 2 hodín. Výsledky vyjadrené ako% obsahu buniek peptidu uvoľneného, ​​priemer ± SEM, * P
< 0,05 vs. príslušného agonista stimulovanej prepustenie.
Diskusia
Ide o prvú štúdiu, ktorá preverí uvoľňovanie Amylin zo žalúdočnej sliznice na bunkovej úrovni. Výsledky ukázali, že Amylin bol nielen uložená v bunkách žalúdočnej sliznice, ale tiež, že predpokladané fyziologické agonisty regulované uvoľňovanie peptidu. Predchádzajúce štúdie lokalizované Amylin do žalúdka pomocou Northern blotování [31, 32], imunocytochémia [33], radioimunotest [3], a in situ hybridizácia
[22], ale uvoľnenie žalúdočné Amylin nebola preukázaná skôr.
väčšina žalúdočného fundusu Amylin sa zdá byť lokalizované s somatostatínu v rámci D-buniek [22] z tohto dôvodu sme použili model kultivovaný králik D-buniek vyšetrovať agentmi kontrolujúci bunkovú uvoľňovanie Amylin a porovnať to na somatostatínové sekrécie.
Počiatočné štúdie boli vykonané s účinnými látkami je známe, že sa priamo aktiváciu vylučovanie peptidu z endokrinných buniek spôsobom, ktorý je receptorom nezávislé [26] forbol estery (také PMA) priamo aktiváciu proteínkinázy C vo vnútornej vrstve bunkovej membrány; To zase aktivuje bunkové procesy potrebné pre exocytosis. PMA bol silný stimulant ako somatostatínu a Amylin sekréciou. Ionofóry A23187 vápnika, čo zvyšuje hladinu intracelulárneho vápnika ([Ca 2 +] i]) tiež stimulovali uvoľňovanie Amylin, aj keď to bolo významne menej účinný ako PMA. To je podobné ako odpovede pozorované u ľudskej antra [26] a psích fundusu D-buniek [30], kde je veria, že zvýšenie [Ca 2 +] aj je predovšetkým facilitative skôr než priamo stimuluje sekréciu. Priame aktiváciu adenylátcyklázy pomocou Forskolin tiež stimulovali uvoľňovanie Amylin. Preto počiatočné štúdie preukázali, že uvoľnenie Amylin mohol byť stimulovaný aktiváciu jednej z dvoch hlavných vnútrobunkových signálnych dráh je známe, že zvyšujú sekréciu peptidu. Rozhodne, že tieto cesty boli aktívne, sme preskúmali ktorý fyziologické látky by mohli stimulovať Amylin sekrécie spôsobom receptor-dependentný.
Cholecystokinín-8 produkoval na dávke závislé zvýšenie sekrécie Amylin a somatostatín. CCK je známe, že je účinný in vitro
stimulant uvoľňovania somatostatínu z antrálnej a fundusu D-bunkách [26, 30, 34]. Podobná reakcia bola pozorovaná na dávke pre Amylin, hoci celkový prírastok bol o niečo väčší, než pre somatostatín Amylin. Ďalšie štúdie bude potrebné určiť, či toto predstavuje samostatný bazén somatostatínu špecificky vylučovaného po stimulácii CCK. Fundu D-bunky sa objaví vyjadriť ako CCK-1 (CCK A) a CCK-2 (gastrínu /CCK B) receptory [35]. Aktivácia týchto receptorov vyvoláva aktiváciu fosfolipázy C, uvoľňovanie diacylglerol a inositol 1,4,5-trisfosfat a následnú výškou [Ca 2 +] i a aktivácia PKC, čo vedie k uvoľneniu peptidu [36 ]. Tieto výsledky sú v súlade s výsledkami pre A23187 a PMA stimulácie. Z tohto dôvodu sa zdá, že CCK môže pôsobiť ako fyziologický stimulátor uvoľňovanie Amylin.
Adrenalín a GLP-1 vyrobené malé zvýšenie v závislosti na dávke Amylin a sekrécie somatostatínu. Tento efekt by mohol byť zvýšená súčasného podávania s inhibítorom fosfodiesterázy IBMX, ktorá inhibuje odbúravanie cAMP a zosilňuje odpoveď generované adenylátcyklázy spriahnutých receptorov. Avšak odpovede boli stále výrazne menšie ako zmeny pozorované s aktiváciou Ca 2 + /PKC dráhy buď CCK alebo PMA. Podobné rozdiely v citlivosti boli popísané v ľudskej antra [26] a psie fundusu [30] D-buniek.
Prevládajúce inhibičné vplyvy Doteraz popísané na fundusu D-buniek sú muskarínové agonisty [37, 38] a samoregulácia podľa somatostatínové sama [39, 40]. Odpovede tu uvádzané sú v súlade s údajmi o uvoľňovaní somatostatínu z psích fundusu D-buniek [30, 37]. Naproti tomu, muskarínové receptory sú stimulačné na antrálnej D-buniek [41], čo pravdepodobne odráža špecifický rozdiel vo funkcii. Súčasná štúdia potvrdila inhibičné akcie oboch somatostatín-analógové oktreotid a muskarinových agonisty karbacholom pred uvoľnením somatostatínu. Podobná inhibícia stimulované uvoľňovanie Amylin bola pozorovaná. To naznačuje, že in vivo
inhibícia uvoľňovania Amylin zahŕňa parasympatickej vstup a autokrinný regulácie od somatostatínu.
Za všetkých podmienok študoval somatostatín a Amylin boli vylučované paralelne, ako možno očakávať, že v prípade, že sú súčasne uložené v sekrečných granulách. Inzulín a Amylin sú spoločne vylučované z pankreatických beta-buniek, sekréciu normálne vyskytuje v paralelnom [42-44], ale rozdiel sekrécia bola popísaná v experimentálnej modely diabetes mellitus [45, 46]. Ďalšie štúdie bude potrebné presnejšie definovať vzťah medzi sekréciou a akciami žalúdočné Amylin a somatostatín. V izolovaných ostrovčekoch pankreasu objavia dva peptidy mať kooperatívny úlohu v regulácii sekréciu peptidu: kombinovaný imunoneutralisation Amylin a somatostatín malo za následok väčšiu zvýšenie sekrécie inzulínu a glukagónu ako neutralizáciu buď samotného [10]. Bude zaujímavé skúmať, či podobné výsledky sú videné s žalúdočnými funkciami.
Postprandiálne uvoľňovanie črevnej CCK a GLP-1 inhibujú vyprázdňovanie žalúdka a sekréciu kyseliny [13, 47]. Tieto účinky sú však byť meditoval aspoň čiastočne cez medziprodukty uvoľnených z D-bunky, skôr než priamo inhibícia kyseliny sekretujících parietálnych buniek [48]. Verilo sa, že somatostatín bol jediný medziprodukt, ale výsledky tejto štúdie naznačujú, že Amylin parakrinný regulácie podľa parietálnych, ECL- a ostatné endokrinné bunky môžu mať úlohu v integračných reakciou na jedle. Inhibícia Amylin-indukovanej histamínu uvoľní z krysích fundusu slizničných segmenty in vitro
bol sprostredkovaný zvýšenému uvoľňovaniu somatostatínu [19], ale za použitia antagonistu receptora somatostatínu selektívne Rossowski et al
ukázalo in vivo u potkanov
, že časť kyseliny inhibičné pôsobenie na oboch Amylin a peptid príbuzný adrenomedullin boli somatostatín nezávislé [49]. Špecifické role Amylin v žalúdku fyziológii vyžadujú ďalšie vysvetlenie, ale tieto dáta naznačujú, že lokálne uvoľní Amylin je priamo schopný regulovať slizničnej funkcie.
Odozvy na adrenalín a karbacholom naznačujú, že autonómne inervácie môže regulovať sekréciu Amylin. Celková bilancia in vivo
by potom závisieť od relatívnej vstupe inhibičných muskarínových a stimulačných adrenergného systému, v kombinácii s cirkulujúcej endokrinné a miestne parakrinný a prípadne luminální faktory.
Záver
štúdia opisuje úvodnú charakteristiku faktory, ktoré upravujú žalúdočné uvoľňovanie Amylin. Ukázali sme, že uvoľňovanie Amylin môže byť stimulované prostredníctvom receptora závislé buď na Ca 2 + /PKC a adenylátcyklázu /cAMP dráhy a fyziologicky relevantné peptidy a nervové mediátory môžu zlepšiť Amylin uvoľnenie. To podporuje hypotézu, že Amylin môže modul žalúdočnej sliznice funkciu. Táto štúdia potvrdzuje, že krátkodobé bunkové kultúry obohatené elutriací bude slúžiť ako model pre skúmanie patofyziologický uvoľňovanie žalúdočné Amylin a poskytujú cestu ďalšieho pochopenie úlohy Amylin v regulácii žalúdočné motorické a sekrečnú funkcie.
Metódy
Materiály
Matrigel bol získaný od Universal Biologicals (Londýn, Veľká Británia), oktreotid od Novartis (Surrey, Veľká Británia) a Ham F12 /Dulbecco modifikovanom Eaglovho médiu kultúry (50:50, objemovo), glutamín, Hanks vyváženého soľného roztok a fetálneho teľacieho séra boli získané od Gibco (Paisley, UK). Sulfatovaný cholecystokinín-8 (CCK), ľudský GLP-1 a všetky ostatné činidlá bola získaná od firmy Sigma (Poole, UK). Izolácia
buniek a kultúra
Primárne kultúry králičieho žalúdka fundusu slizničných buniek obohatené pre D-bunky boli získané ako bolo opísané skôr [39, 48]. Stručne povedané, králik fundusu sliznice bol podrobený sekvenčnej EDTA a trávenie kolagenázy. Vzniknutá suspenzia buniek bola obohatená o D-buniek protiprúde elutatriation za použitia Beckman JE 5.0 štandardné rotor, ako bolo popísané vyššie. D-buniek obohatená frakcia bola resuspendované v kompletnom médiu kultúry (Ham F12 /Dulbecco modifikovanom Eaglovho kultivačné médium (50:50, objemovo), obsahujúci 2 mM glutamínu, 10 mM HEPES pH 7,4, 0,22% NaHCO 3, 10% fetálneho teľacieho séra, 1 mg /l hydrokortizónu, 8 mg /l inzulínu, 100 mg /l penicilínu, 100 mg /l gentamicín, 100 mg /l streptomycínu) a kultivované na Matrigel potiahnuté 24jamkové doštičky pre tkanivové kultúry [50] pri hustote 1 x 10 6 buniek /jamka po dobu 40 hodín v atmosfére 5% CO 2, 95% vzduchu pri 37 ° C.
uvoľnenie štúdia
kultivované bunky boli premyté 3 doba uvoľňovania médiu (Earl vyvážený soľný roztok obsahujúci 0,1% hovädzí sérový albumín, 10 mM HEPES, pH 7,4) na odstránenie mŕtvych a non-adherentních buniek. Pridá sa ďalší 1 ml uvoľňovacieho médiu obsahujúcom testovacie agonistami a bunky boli inkubované po dobu 2 hodín pri teplote 37 ° C v atmosfére 5% CO 2, 95% vzduchu. Po uplynutí doby uvoľňovania, Kondicionované médium bolo odsaté a odstredí na odstránenie non-adherentních buniek. Celková bunková obsah peptidu sa extrahuje za varu v 1 ml v destilovanej vode. Klimatizované média a bunkové extrakty boli skladované pri -70 ° C do testovania na obsah peptidu [30]. Meranie
Peptide
koncentráciou somatostatínu boli hodnotené pomocou rádioimunoanalyticky (RIA) s antisérom K2, ako bolo opísané skôr [39]. Polovicu maximálna inhibícia väzby došlo u 2 fmol /trubky a intra-assay a inter-assay boli 7% a 8% percent, resp. koncentrácie Amylin boli merané pomocou ELISA testu (PENNINSULA Laboratories, Belmont, CA, USA), podľa inštrukcií výrobcu. Test má rad 0.04-2 ng /ml, a intra-assay a inter-assay of < 5% a < 14%, resp. Protilátka použitá má 100% skríženú reaktivitou s Amylin a Amylin-amid, ale < 1% skríženej reaktivity s CGRP a zanedbateľnú reakciu s inými biologicky aktívnych peptidov. Všetky experimentálne vzorky z jedného lieku na zvieratách boli testované v rovnakom RIA alebo ELISA.
Štatistická analýza
Peptide uvoľňovania počas obdobia 2 hodín bola vyjadrená ako percento z celkového obsahu buniek (TCC) uvedeného peptidu. Každá experimentálna podmienka bola testovaná v duplikáte a výsledky z jedného lieku na zvieratách boli považované za N = 1. Výsledky sú vyjadrené ako priemer ± SEM z 3-6 samostatných prípravkov na zvieratách. Každý z 24 jamkové doštičky vždy súčasťou ovládania (bazálny) studní a pozitívne stimulantov. Peptid Únik stimulanty bola v porovnaní s bazálnej uvoľňovania na príslušné 24 jamkové doštičky. Jednosmerná analýza rozptylu a Studentovho párového t-testu boli použité na určenie významnosti. P Č
hodnota < 0,05 bola považovaná za významnú
zoznam skratiek
CCK :.
cholecystokinínu
ECL-:
enterochromaffin-like


GLP-1:
glukagónu podobný peptid-1
IAPP:
ostrovček amylioid polypeptid
IBMX:
isobutylmethylxanthine
PKC:
proteín kinázy C
PMA:
forbol-12-myristát -13-acetát, TCC, celkový obsah buniek.
deklarácia
Poďakovanie
Táto práca bola podporená sčasti tréningovej stáži Medical Research Council pre ILPB.
Niektoré z údaje boli prezentované v podobe abstraktu u Spojených Európskej gastroenterologickej týždňa v Birminghame 1997.
autorov pôvodné predloženej súbory obrazov
Nižšie sú uvedené odkazy na autorov pôvodných predložených súbory pre obrazy. "Pôvodný súbor pre Obrázok 1 12899_

• Rizikové faktory pre hĺbku infiltrácie v diferencovanom depresii včasného karcinómu žalúdka: predbežné analysis
• Diferenciálnej expresie génu v myšom žalúdočnej fundus chýba intersticiálna bunky Cajal